血小板源性生長因子在富血小板血漿治療高原地區脊柱結核病中的作用機制研究※

李釗偉，李澤清，唐保明，李春亮，趙 磊，楊愛榮

(1.青海大學附屬醫院創傷骨科；2.青海大學附屬醫院；3.青海省人民醫院骨科；4.青海大學醫學院預防醫學系)

血小板源性生長因子在富血小板血漿治療高原地區脊柱結核病中的作用機制研究※

李釗偉1，李澤清1，唐保明1，李春亮3，趙 磊4，楊愛榮△2

(1.青海大學附屬醫院創傷骨科；2.青海大學附屬醫院；3.青海省人民醫院骨科；4.青海大學醫學院預防醫學系)

目的 觀察富血小板血漿對高原地區脊柱結核病治療的影響，了解血小板源性生長因子在富血小板血漿治療高原地區脊柱結核病的作用機制。方法 收集本院自2013年3月～2016年3期間青海本地脊柱結核患者，根據患者術中是否經PRP治療分為PRP組和非PRP組，術后給予相同治療，并于術后連續4周每周復查各組患者CRP、ESR值；12只家兔隨機分為兩組(實驗組和對照組)，每組6只，無菌操作去除各組家兔椎體側方1 cm×1 cm骨組織，用咬骨鉗將其咬碎備用，實驗組骨組織與預先制備好的PRP混合，并植入對應家兔骨缺損處；對照組骨組織與等體積的生理鹽水混合，并植入對應家兔骨缺損處，術后分籠常規飼養。8周后無菌獲取各組適量骨缺損處組織，置于液氮速凍再移至-80 ℃冰箱暫存，采用Western Blot技術檢測各組骨缺損處組織PDGF、AP-1以及IL-6蛋白的表達水平。結果 PRP組(n=61)和非PRP組(n=57)治療脊柱結核病均達到治愈，但PRP組術后復發感染、血腫以及竇道均比非PRP組少；術前PRP和非PRP組ESR、CRP值差異無統計學意義(P>0.05)，但PRP組和非PRP組術后2、3、4周ESR和CRP值變化差異均有統計學意義(P<0.05)，且均隨術后時間延長而降低。12只家兔，造模前后無感染和死亡，均進入結果分析，無托失值；家兔PRP組和對照組骨缺損處組織PDGF、AP-1以及IL-6蛋白的表達水平變化差異有統計學意義(P<0.05)，且PRP組三種蛋白表達水平均明顯升高。結論 血小板源性生長因子可能通過PDGF、AP-1以及IL-6蛋白改變發揮減少脊柱結核患者術后并發癥的作用，提高富血小板血漿治療高原地區脊柱結核病術后傷口愈合效果。

高原脊柱結核 血小板源性生長因子 富血小板血漿

脊柱結核在青藏高原居民中發病率、凸畸形發生率和截癱等嚴重并發癥幾率都較高[1]。目前國內外治療脊柱結核的主流方法為藥物抗癆基礎上，行病灶清除植骨融合內固定手術治療，但術后易有結核感染復發、竇道形成等并發癥。在主流方法基礎上加入富血小板血漿(Platelet-rich plasma，PRP)輔助治療是我們正在探索的新的治療手段，PRP是通過離心自體血而得到的含有高濃度血小板的血漿，能加速多種組織修復愈合，并有良好的抗感染作用。PRP主要成分之一血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)是一種重要的血管形成刺激因子，在組織生長、修復和再生過程中具有重要的調節作用。PDGF可刺激、提高體外培養成骨細胞白細胞介素-6(interleukin- 6，IL-6)的轉錄水平，但此作用在體內實驗中少見有報道[2]。激活子蛋白-1(activator protein 1，AP-1)是一種重要的轉錄因子，調控IL-6的表達[3]。本文在回顧性分析PRP治療高原地區脊柱結核病的效果的基礎上，用成熟家兔建立脊柱椎體骨缺損模型，檢測PRP的最主要成分PDGF在脊柱椎體骨缺損愈合中發揮的作用機制，為高原地區脊柱結核治療探索新的方法，并提供相應的理論依據。

1 資料與方法

1.1 患者一般資料和觀察指標

2013年3月至2016年3月，在青海大學附屬醫院手術治療脊柱結核病例118例，其中男性39例，女性79例。患者平均年齡53.55±4.7歲，均來自青海省高海拔地區，平均居住海拔3487米，67%為藏族等少數民族。脊柱結核分布節段為頸椎結核4例、胸椎結核41例、腰胸段結核12例、腰椎結核58例，腰骶段結核3例?；颊呔弦韵录怪Y核病診斷標準：(1)有不同程度的頸、背部疼痛，胸腹部及肢體放射痛，部分有盜汗、午后低熱、體重減輕等結核典型癥狀；(2)病灶標本經Bactec960系統快速結核菌培養陽性或者病理檢查確診結合；(3)X線片、CT及MR檢查符合脊柱結合改變。治療后觀察術后四周C反應蛋白(C-Reactive Protein，CRP)、血沉(Erythrocyte Sedimentation Rate，ESR)及竇道、感染和血腫是否發生等。

1.2 患者手術治療方法

1.2.1 術前準備

對患者的一般情況、生化指標進行常規檢查以評估患者對手術的耐受程度。所有患者進行四聯抗癆治療3周以上，每周復查ESR，患者結核中毒癥狀減輕，ESR持續降低并達40 mm/h以下時手術。

1.2.2 PRP采集制備輸注

術前自患者肘部取外周靜脈血20～60 mL，離心(350g×5min)后收集 PRP，將其再次離心(50g×5min)濃縮至 4～12 mL。所用材料為3.8% 檸檬酸鈉抗凝(美國sigma公司)；5 mL 離心管(德國GIBCO公司)，XL90 超速低溫離心機(美國Beckman公司)。

1.2.3 術中治療

患者均采用全身麻醉，根據患者病變部位具體情況，行前路或后路病灶清除、植骨、內固定術治療。將患者分為PRP組和對照組，PRP組在手術入路縫合后將收集的PRP注射到脊柱患處。

1.2.4 術后處理

術后PRP組和對照組處理相同：病灶行病理檢查，術后繼續抗癆治療10～12個月。術后連續4周每周復查CRP、ESR。

1.3 脊柱椎體骨缺損模型及組織提取方法

用12只家兔(體重2.5～3.0kg，雌雄不限)建立脊柱椎體骨缺損模型，隨機分兩組(每組6只)，即PRP治療組和對照組。兩組家兔分別腹腔內注射5%利多卡因10 mL，待麻醉完全后將家兔置于手術架上，取腹部正中缺口，剝離腹部淺層肌肉，打開腹膜后用腹壁拉鉤牽開腸道及軟組織，暴露椎體前方，用小號骨鑿去除椎體側方1 cm×1 cm骨組織，去除的骨組織用咬骨鉗咬碎，PRP治療組骨組織與預先制備好的PRP混合后植入骨缺損處，對照組混合相同體積的生理鹽水。絲線小心地間斷封閉切口，造模成功手術之后將家兔分籠正常飼養。飼養八周后切開手術部位取一定量骨缺損處組織。所有取出的組織標本立即置液氮中速凍，然后轉移至-80 ℃冰箱中保存。

1.4 Western Blot檢測方法

用組織總蛋白質提取試劑盒提取骨缺損組織總蛋白質，檢測濃度后進行SDS-PAGE電泳，轉PVDF膜后用5% BSA封閉1 h，加入一抗(PDGF為1：300，AP-1為1：500，IL-6為1：500，β-acting為1：10000)4 ℃過夜。用TBST洗膜3次，每次10 min，加入HRP標記的二抗(1：10000)37 ℃搖床孵育1 h，TBST 洗膜3次(10min/次)，然后顯色。將膠片進行掃描、拍照，經Bio-Rad Quantity one 4.4.0圖像分析系統采集圖像，采用β-acting作為內參，以光密度比值表示該蛋白相對表達水平。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 臨床結果

2.1.1 患者術后情況

根據術后隨訪資料，按照脊柱結核臨床治愈標準，PRP組和非PRP組均達到治愈，但非PRP組有1例(1.63%)術后切口邊緣部分壞死，愈合不良，局部分泌物培養陰性，換藥3周而愈。且非PRP組感染復發1例(1.75%)、竇道發生4例(7.02%)、術后血腫3例(5.26%)；PRP組感染復發1例(1.64%)，血腫1例(1.64%)，無竇道發生，兩組顯著性檢驗結果差異無統計學意義。

2.1.2 患者ESR和CRP檢測結果

PRP組和非PRP組術前ESR和CRP比較，差異無統計學意義(P>0.05，表1)；兩組術前、術后2、3、4周比較，差異均有統計學意義(P<0.05，表1)。

2.2 動物實驗Western Blot檢測蛋白質表達結果

家兔PRP組和對照組骨缺損處組織PDGF、AP-1和IL-6三種蛋白質表達檢測結果可以看出，和對照組相比，PRP組的AP-1和IL-6三種蛋白質表達水平均明顯升高(圖1)，差異有統計學意義(P<0.05，表2)。

表1 PRP組和非PRP組患者術前、術后2周、3周、4周CRP和ESR比較Table 1 Comparison of ESR and CRP between PRP group and non-PRP group before and 2，3，4 weeks after the surgery

圖1 PDGF、AP-1和IL-6蛋白在PRP組和對照組的表達結果圖
Figure 1 The expression of PDGF、AP-1 as well as IL-6 protein in PRP group and control group

表2 PDGF、AP-1和IL-6蛋白在PRP組和對照組的表達結果Table 2 The expression of PDGF、AP-1 as well as IL-6 protein in PRP group and control ±s)

3 討論

研究成果表明，與組織創傷修復過程密切相關的生長因子有血小板衍生生長因子、成纖維細胞生長因子、血管內皮細胞生長因子以及表皮生長因子等[4，5]，其作用機制主要是通過影響肉芽組織的生長、血管再生、再上皮化，決定組織創傷修復的速度[6，7]。近年研究發現，血小板衍生生長因子可促進骨組織損傷的修復，然而機制并不清楚。

炎性反應標志物是近年研究的一個方向，以CRP和ESR為代表，其中CRP為重要的急性時相反應蛋白，在急性創傷、感染時血漿中CPR和ESR水平均會急劇升高，這樣可以影響損傷病灶[8]。

有研究表明[9]，感染組和非感染組患者CRP水平術后第1、3天有明顯增高趨勢，第7天則有回落，并以感染組變化更為明顯，表明CRP升高與術后感染及炎癥程度有關，且對判斷臨床術后感染及炎癥程度有一定意義。王佳[10]、彭麗萍[11]和陳昌博[12]等均得出一致結論，即CRP、ESR的含量與感染以及炎癥程度呈正相關。此外，有研究表明，血清中大分子蛋白如CRP和球蛋白等可加快血沉，當血清中IL-6含量減少時，血沉速度自然減緩[13]。

本研究發現，PRP治療后患者血清中CRP和ESR下降速度較非PRP組快，且術后傷口感染率、血腫率以及竇道的形成數目較少，提示PRP可能通過減少感染以及抗炎作用，導致患者CRP以及ESR值下降，進而加快術后創傷的愈合速度。

PDGF是一種重要的生長刺激因子，有促進新毛細血管的形成、組織的生長、修復再生的作用[13]。研究表明[7，14]，外源性PDGF可以促進難愈性皮膚潰瘍損傷創面的愈合，并認為高劑量的PDGF可加速上皮移行速率，提早出現肉芽組織、成纖維細胞以及新生毛細血管。Kim等[15]研究表明，經PRP處理后骨密度增加，由此可知PRP可能促進新骨的形成。本研究中家兔經PRP處理后骨缺損處PDGF蛋白含量升高，提示PDGF可能是通過刺激骨缺損處新骨以及新毛細血管的形成，促進骨缺損處的愈合。

AP-1是細胞內的一個轉錄激活因子，是由c-Fos和c-Jun組成的異二聚體，它通過調節基因的表達來應對多種刺激，包括細胞因子，生長因子，細菌和病毒感染等[13]。研究表明[16，17]，AP-1表達調控多種細胞的生理代謝，包括細胞分化、增殖和凋亡，且認為AP-1表達升高時通過調控生長因子的表達促進細胞增殖。Kido[18]等研究表明，負荷應激下可通過促進FosB AP-1家庭成員的表達，促進成骨細胞分化。本實驗中經PRP處理后AP-1蛋白表達升高，可能是通過調控生長因子的表達，促進細胞的增殖，加速骨缺損處組織的愈合。

IL-6是由活化的T細胞和成纖維細胞產生的淋巴因子，能使B細胞前體成熟并產生抗體，與集落刺激因子協同，能促進原始骨髓源細胞的生長和分化，增強自然殺傷細胞的裂解功能[13]。本實驗中經PRP處理后骨損傷處組織IL-6表達水平升高，可能是因為富血小板血漿制備過程中沒有將白細胞去除，而是保留了全血中絕大部分的淋巴細胞，還有骨損傷刺激下產生的大量淋巴因子[19]；IL-6升高還有可能與AP-1蛋白表達升高有關，AP-1可調控IL-6的表達[3]。此外，有研究表明[20，21]，IL-6與TNF-α表達升高時均可增強破骨細胞的破骨功能，加速骨溶解過程。本實驗中經PRP處理后IL-6表達升高，說明在骨組織損傷之后，機體可能通過促進AP-1蛋白的表達，升高IL-6的表達水平，增強破骨細胞的活性，加速已損傷骨細胞的處理過程，為新骨的形成提供原料。

綜上所述，本研究結果顯示，血小板源性生長因子可減少術后復發感染率、血腫以及竇道的形成，促進高原脊柱結核病患者術后創面愈合，其作用機制可能通過升高骨組織損傷處PDGF、AP-1和IL-6三種蛋白的表達水平，進而影響肉芽組織的生長、血管再生、新骨組織的形成以及損傷骨組織的清除過程。

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The mechanism study of platelet derived growth factor in the platelet-rich plasma treating spinal tuberculosis in high altitude area※

LI Zhao-wei1，LI Ze-qing1，TANG Bao-ming1，LI Chun-liang3，ZHAO Lei4，YANG Ai-rong△2

(1.Trauma department of orthopedics，Qinghai university affiliated hospital； 2.Qinghai university affiliated hospital； 3.Department of orthopedics，Qinghai Provincial People′s Hospital； 4.Department of preventive medicine；Qinghai University School of Medicine)

Objective By observing the influence of platelet-rich plasma on the treatment of spinal tuberculosis in high altitude area，we sought to test the molecular mechanism of platelet-derived growth factor in the platelet-rich plasma in the treatment of spinal tuberculosis.Methods During 2013/03-2016/03，we enrolled spinal tuberculosis patients in Qinghai University affiliated hospital who were all from Qinghai area.The patients who were under the PRP therapy entered into the PRP group and the rest entered into non-PRP group.Then give them the same treatment postoperatively.Finally，CRP and ESR of each patient in two groups were tested for four weeks.12 rabbits were randomly divided into 2 groups(the experimental group and the control group)，six rabbits in each group.Each rabbit were taken sterile operation to remove vertebral side 1 cm×1 cm bone tissue，rongeur were used to bite it.The bone tissue of PRP group was mixed with PRP which was prepared，implanted it into bone defect of corresponding rabbit；the bone tissue of the control group mixed with same volume of normal saline，implanted it into bone defect of corresponding rabbit；divided in cage raising for 8 weeks.A moderate amount of bone tissue was obtained from the bone lesions，which was firstly placed in liquid nitrogen and then moved to -80 ℃ refrigerator.Western Blot were used to test PDGF，AP-1 and IL- 6 protein level in each group of bone defect tissue.Results All patients of spinal tuberculosis were cured in the PRP group(n=61)and the non-PRP group(n=57)，but the case of infection，hematoma，postoperative recurrence and antrum in PRP group were less than that of the PRP group.There was no significant difference of ESR and CRP value between the PRP group and the non-PRP group preoperatively(P>0.05).The difference of ESR and CRP values had statistical significance(P<0.05)between the PRP group and the non-PRP group after using PRP therapy for 2weeks，3weeks，4 weeks，and the changing speed of ESR and CRP values in PRP group is faster than that of the non-PRP group.12 rabbits have no infection and death after process of model，the changes of PDGF，AP-1 and IL-6 protein expression level in the bone defect tissue of the PRP group and the control group was significantly different(P<0.05)，and those three protein expression levels were significantly increased in PRP group.Conclusions：PDGF may improve PRP treatment of spinal tuberculosis by increasing the expression level of AP-1 and IL-6，to reduce postoperative complications in patients with spinal tuberculosis.

Plateau spinal tuberculosis Platelet-derived growth factor Platelet-rich plasma

※：青海省科技廳自然科學基金項目(2014-ZJ-761)。Δ：通信作者，教授，Tel：13119762686 李釗偉(1971～)，男，漢族，青海籍，教授

R363.1

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10.13452/j.cnki.jqmc.2017.01.009

2016-10-01