缺氧預(yù)處理后GSK3β/STAT3信號通路在大鼠缺血性腦損傷中的作用及機制※

唐智偉，肖宗宇，吳世政，唐超群

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810016；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，青海 西寧 810000；3.青海省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，青海 西寧 810007)

缺氧預(yù)處理后GSK3β/STAT3信號通路在大鼠缺血性腦損傷中的作用及機制※

唐智偉1，3，肖宗宇2，吳世政3*，唐超群1

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810016；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，青海 西寧 810000；3.青海省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，青海 西寧 810007)

目的 探討GSK3β/STAT3信號通路在缺氧預(yù)處理大鼠缺血性腦損傷中的作用及機制。方法 將70只SD大鼠隨機分為正常組(N組，10只)、假手術(shù)組(S組，12只)、腦梗死組(M組，12只)、缺氧預(yù)處理+腦梗死組(HM組，12只)、缺氧預(yù)處理+腦梗死+抑制劑組(HMI組，12只)、缺氧預(yù)處理+腦梗死+生理鹽水組(HMN組，12只)，采用Longa的改良線栓法建立大腦中動脈栓塞模型(MCAO)，造模成功24小時后對大鼠進行神經(jīng)功能評分，同時以TTC染色法測腦梗死的面積、免疫組織化學(xué)法檢測NeuN、p-STAT3在梗死區(qū)紋狀體的表達、Western blot法檢測各組大腦皮質(zhì)p-STAT3、p-GSK3β的表達情況。結(jié)果 HM、HMN、HMI組與M組相比較，大鼠神經(jīng)功能評分及腦梗死體積較單純M組的體積顯著降低(P<0.05)；p-GSK3β、p-STAT3的表達量較單純M組顯著減少(P<0.05)，但NeuN表達較單純M組增加。結(jié)論 缺氧預(yù)處理在大鼠缺血性腦損傷中有神經(jīng)保護作用，大鼠缺血性腦損傷后引起了GSK3β/STAT3信號通路的激活，抑制該信號通路后可減少神經(jīng)元的死亡，對神經(jīng)功能起到保護作用。

缺血性腦損傷 大腦中動脈栓塞 GSK3β/STAT3信號通路

缺血性腦卒中最有效的治療方法是介入取栓及動靜脈溶栓，但兩者的有效治療時間窗必須在4～6小時內(nèi)，這其中溶栓治療方法雖然在一部分患者身上可以取得較明顯的效果，但是對于梗死范圍較大及發(fā)病超過6小時的患者而言，治療效果已不明顯，且再出血風(fēng)險較高，因此限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。所以尋找缺血性卒中后有效的腦保護機制、改善神經(jīng)功能已成為當(dāng)今研究的熱點。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)可通過介導(dǎo)多種細胞因子參與到相關(guān)細胞的活化、增殖和凋亡等多種生理過程發(fā)揮關(guān)鍵作用，是近年來細胞因子在該領(lǐng)域研究的熱點[1]。其中GSK3β/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了一系列中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的炎性病理過程[2]。但GSK3β/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在大鼠腦梗死模型中的作用如何尚不明確。本研究通過建立大鼠大腦中動脈栓塞(MCAO)模型，通過GSK3β特異性抑制劑抑制該通路，觀察NeuN、p-GSK3β、p-STAT3的表達水平、腦梗死體積及神經(jīng)功能缺損等相關(guān)指標(biāo)，探討GSK3β/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在MCAO中的作用及機制，為腦梗死的進一步研究提供新的參考策略。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

雄性SD大鼠70只，質(zhì)量200～250 g，由北京維通利華動物實驗中心提供，隨機分為正常組、假手術(shù)組、腦梗死組、缺氧預(yù)處理+腦梗死組、缺氧預(yù)處理+腦梗死+抑制劑組、缺氧預(yù)處理+腦梗死+生理鹽水組。其中，正常組10只，其余各組均為12只。

1.2 主要試劑選擇

兔抗小鼠NeuN單克隆抗體、兔抗鼠p-STAT3(pTyr705)單克隆抗體及p-GSK3β多克隆抗體購于Abcam公司，SABC免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司，GSK3β/STAT3特異性通路阻斷劑(SB216763)及2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC染色劑)購自美國Sigma公司。

1.3 大腦中動脈梗塞模型的建立

大鼠大腦中動脈栓塞模型的制備參考Longa法。大鼠用10%的水合氯醛(3.6mL/kg)腹腔注射麻醉后常規(guī)消毒頸部皮膚，用眼科剪在頸部中線處剪開一個約1.5 cm的小口，用鈍器依次分離左側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內(nèi)動脈(ICA)。用4號外科線結(jié)扎CCA的近心端，遠心端用動脈夾夾畢，然后在距CCA分叉部4 mm處剪一小口，將栓線插入到ICA，從CCA分叉處算起，當(dāng)插入深度約為18 mm或感輕微阻力時，證明大腦中動脈已閉塞。手術(shù)結(jié)束再次對切口處進行常規(guī)消毒并縫合切口。假手術(shù)組同樣分離CCA、ECA、ICA，結(jié)扎近心端但不插線栓。術(shù)中及術(shù)后用熱燈保持大鼠體溫(直腸溫度約在38℃)。

1.4 神經(jīng)功能缺失情況評定

采用Longa的5級標(biāo)準法在大鼠術(shù)后24 h進行神經(jīng)功能評分，0分：無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：不能完全伸展對側(cè)前爪；2分：行走時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自行行走，意識喪失；0分及意識喪失者剔除，評分越高說明神經(jīng)元功能缺失癥狀越嚴重。

1.5 腦梗塞面積的測量

各組隨機取4只大鼠，過度麻醉后取新鮮腦組織(去除小腦和覆蓋在皮層表面的軟腦膜)。然后將腦組織放入腦槽后沿冠狀位切成約2 mm厚的切片，將切片放入2%的TTC溶液中，在37 ℃水浴箱中避光孵育10 min，用4%的多聚甲醛固定后拍照。梗死灶區(qū)呈白色、非梗死區(qū)呈紅色。最后用ImageJ軟件分析、計算腦梗塞面積。

1.6 組織切片的制備

隨機取4只大鼠，充分麻醉后剪開腹部皮膚，逐步向上剪開膈肌，充分暴露心臟，經(jīng)左心室向主動脈插管，待右心耳充盈后將其剪開。灌注時先用0.9%的生理鹽水500 mL灌注，待肝臟逐漸變白后，再用4%的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液500 mL灌洗直到全身僵硬。灌注完畢后迅速斷頭取腦，將腦組織快速置于20%的蔗糖多聚甲醛溶液中，24 h后再將其置于30%的蔗糖多聚甲醛溶液中，使其充分脫水固定。常規(guī)OCT包埋劑包埋，準備冰凍切片，自前往后連續(xù)行冠狀位切片，厚約30 μm，將腦片保存于新鮮的PBS溶液中，放置4 ℃冰箱冷藏備用。

1.7 NeuN及p-STAT3表達的檢測

采用SABC法，步驟簡述如下：(1)常規(guī)冰凍切片、挑片，將腦片放置于盛有PBS溶液的24孔板中；(2)用PBS(pH=7.4)溶液沖洗3次，每次5 min；(3)滴加內(nèi)源性過氧化酶阻斷劑3滴，水平圓周搖床慢搖30 min；(4)PBS(pH=7.4)溶液沖洗3次，每次5 min；(5)用山羊血清液3～4滴封閉60 min；(6)單孔分別滴加NeuN一抗(1：1000)、p-STAT3(1：500)約200 μL，室溫孵育1 h后置4 ℃冰箱過夜；(7)將孔板從冰箱取出，室溫孵育1 h；(8)用PBS(pH=7.4)溶液沖洗6次，每次5 min；(9)加二抗3～4滴室溫孵育2 h；(10)用PBS(pH=7.4)溶液沖洗6次，每次5 min；(11)滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶，室溫孵育30 min；(12)用PBS(pH =7.4)溶液沖洗3次，每次5 min；(13)用DAB染色，待充分顯色后再貼片，隔夜晾干；(14)用不同濃度酒精分別脫水，用二甲苯致透明化，用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.8 p-STAT3及p-GSK3β表達的檢測

各組隨機取6只大鼠，充分麻醉后斷頭取腦，稱取腦梗側(cè)皮層腦組織約100 mg，以100：1：1的比例分別加入RIPA、PMSF和磷酸酶抑制劑勻漿后提取蛋白。用BCA法定量蛋白后，每個加樣孔上樣20 μg，等量加入5%濃縮膠中及12%的聚丙烯酰胺分離膠中電泳，完畢后切取目的條帶膠段。將電流調(diào)至200 mA(30min至45min不等)，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用新鮮配制的5%脫脂奶粉封閉液封閉2 h，加入p-STAT3兔抗鼠單克隆抗體(1：2000)、p-GSK3β兔抗鼠多克隆抗體(1：1000)及抗β-actin(1：5000)抗體過夜(4℃)。用TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗(山羊抗兔IgG 1：5000，山羊抗小鼠IgG 1：5000)孵育，用TBST洗膜3次，每次10 min，以ECL發(fā)光液顯色，記錄實驗結(jié)果。

過了幾天，老福又去醫(yī)院看母親。母親一本正經(jīng)地說：“記得我上次跟你說的隔壁那個老羅嗎？她叫羅素青，昨天出院了，聽我說你是當(dāng)警察的，還小有名氣，叫我無論如何把你請到她家去，說是她知道有人要害死她。你就抽時間去一趟吧？醫(yī)生覺得她雖然是小病大養(yǎng)，但精神緊張，對身體不好，你就幫著寬慰她一下吧。她沒結(jié)過婚，一個人挺可憐的。”

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準差，多組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組間神經(jīng)功能缺損癥狀評分的比較(表1)

大腦中動脈閉塞術(shù)后24 h進行神經(jīng)功能缺損癥狀評分。以Longa5為標(biāo)準進行評分，結(jié)果顯示HM組的大鼠神經(jīng)缺損程度與單純M組大鼠的神經(jīng)缺損程度有明顯差異，而給予抑制劑后，神經(jīng)功能評分降低，顯示神經(jīng)功能的保護作用顯現(xiàn)。

表1 M組、HM組、HMN組及HMI組大鼠腦梗死后神經(jīng)功能評分結(jié)果表±s)Table 1 Neurological function score of M，HM，HMN，HMI group after cerebral infarction in ±s)

*：與M組相比較P<0.01；#：與HM比較P<0.01；Δ：與HMN組比較P<0.01.

2.2 腦卒中后梗塞面積的計算(表2)

本實驗旨在研究缺氧預(yù)處理對大鼠腦梗死面積的影響，聯(lián)合特異性通路阻斷劑，預(yù)測GSK3β/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在缺氧預(yù)處理大鼠腦梗死面積的影響。TTC染色后出現(xiàn)白色區(qū)域，表明大腦中動脈梗死模型制作成功。白色區(qū)域表示梗死區(qū)域、紅色區(qū)域表示正常組織。

表2 M組、HM組、HMN組及HMI組大鼠腦梗死面積比較Table 2 Comparison of rats’ cerebral infarction area in group M，HM，HMN and ±s)

*：與M組相比較P<0.01；★：與HM比較P<0.01；Δ：與HMN組比較P<0.01.

2.3 各組大鼠NeuN表達的比較(圖1)

圖1 各組大鼠紋狀體內(nèi)NeuN的表達圖(400×)
Figure 1 the expression of NeuN in striatum of rats(400×)

2.4 各組大鼠免疫組化p-STAT3表達的比較(圖2)

圖2 各組大鼠紋狀體內(nèi)p-STAT3(免疫組化)的表達圖(400×)
Figure 2 The expression of p-STAT3 in striatum of rats(400×)

2.5 各組大鼠神經(jīng)元NeuN陽性細胞及p-STAT3陽性細胞表達的比較(表3)

表3 各組大鼠神經(jīng)元NeuN陽性細胞及p-STAT3陽性細胞表達的比較±s)Table 3 Comparison of the expression of NeuN positive cells and p-STAT3 positive cells in the neurons of each group in ±s)

Δ：與N組、S組相比較P<0.05；★：與HM、HMN組相比較P<0.05.

2.6 各組大鼠腦組織Western Blot的p-STAT3及其p-GSK3β蛋白表達的比較(圖3)

圖3 各組大鼠腦組織Western Blot的p-STAT3及其p-GSK3β蛋白表達的比較圖
Figure 3 Comparison of p-STAT3 and p-GSK3 protein expression in brain tissue of each group in rats

2.7 各組大鼠p-STAT3及p-GSK3β蛋白的相對表達量表達的比較(表4)

表4 各組大鼠p-STAT3及p-GSK3β蛋白的相對表達量表達的比較表Table 4 Comparison of the relative expression of p-STAT3 and p-GSK3 protein in rats of each ±s)

Δ：與N組、S組相比較，P<0.01；★：與HM比較P<0.01；*：與HM、HMN組相比較P<0.05.

3 討論

糖原合成酶激酶(GSK-3)，它是構(gòu)成活性絲氨酸/蘇氨酸的蛋白激酶[3]，主要位于胞漿，在腦內(nèi)含量豐富，在神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞內(nèi)均有存在[4]，GSK-3由兩個亞型組成：GSK-3a、GSK-3β。有研究認為GSK-3β激活后可能參與細胞的促凋亡機制，包括P53調(diào)控、Bax磷酸化、β-catenin降解等；另外GSK-3β在外周及腦組織炎癥反應(yīng)中的作用也已經(jīng)被廣泛證實，它參與Toll樣受體受刺激后外周血單核粒細胞的促炎因子及抗炎因子的產(chǎn)生[5]；它還可以促進小膠質(zhì)細胞的遷移和活化，導(dǎo)致TNF-a的產(chǎn)生。STAT3是STAT家族的一個重要成員，目前已知的研究結(jié)果表明，STAT3的存在對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和分化起著至關(guān)重要的作用。此外，STAT3可以在許多信號傳遞過程系統(tǒng)中被激活而發(fā)揮作用。1996 年，Planas[6]首次報導(dǎo)，大鼠短暫性腦缺血4 天后，缺血區(qū)小膠質(zhì)細胞活化，表達大量的STAT3，與此同時同側(cè)皮層和紋狀體內(nèi)STAT3的表達大量增加。此后一系列實驗證實：缺血后STAT3的活化與組織對缺血的反應(yīng)密切相關(guān)。對STAT3活化時程的研究表明：缺血中心區(qū)的STAT3在3.5 h開始出現(xiàn)，24 h達到高峰，以后逐漸減少[7]。表明STAT3可能參與了缺血早期的反應(yīng)。本實驗發(fā)現(xiàn)，HM組及HMI組與單純M組相比較，神經(jīng)功能評分及TTC染色腦梗死面積明顯降低(P<0.05)，且兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義。說明缺氧預(yù)處理后及該信號通路被抑制后，可通過減輕腦梗死急性期炎癥反應(yīng)在內(nèi)的一系列病理過程從而減少腦梗死面積，最終起到神經(jīng)功能疊加保護作用。此外NeuN作為在神經(jīng)元內(nèi)的特異性蛋白質(zhì)，它被認為是神經(jīng)元的特異性標(biāo)記物，HM組與單純M組相比較，NeuN陽性細胞表達明顯增加，且抑制GSK3β/STAT3該信號通路后，NeuN的表達水平與HM組NeuN陽性細胞表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明經(jīng)缺氧預(yù)處理和抑制該信號通路可改善因腦梗死而導(dǎo)致的神經(jīng)細胞及神經(jīng)膠質(zhì)細胞的死亡，起到雙重神經(jīng)保護效應(yīng)。另外在用Western Blot法檢測p-GSK3β、p-STAT3的表達中也發(fā)現(xiàn)：M組與N及S組相比較，M組的p-GSK3β及p-STAT3β表達明顯升高，前已述p-STAT3可在腦梗死后24 h表達達到最高峰，HM組及HMI組兩者表達顯著減少，且與單純M組相比較表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義，進一步表明抑制GSK3β/STAT3信號通路及行缺氧預(yù)處理后均可以通過減輕兩者的表達來下調(diào)炎性因子表達、增加抗炎因子表達最終減輕炎癥反應(yīng)，改善神經(jīng)功能缺損癥狀。

1986年Murry[8]等在研究心肌缺血中提出預(yù)處理的概念。預(yù)處理保護作用在多種動物身上已經(jīng)得到明確證實。并且可以用缺氧預(yù)處理來模擬其保護作用，缺氧預(yù)處理是一個復(fù)雜的、多種因素及多機制參與的保護過程，近年的研究表明腦組織的缺氧預(yù)適應(yīng)同樣可產(chǎn)生內(nèi)源性神經(jīng)保護作用，其保護機制相當(dāng)復(fù)雜，涉及神經(jīng)化學(xué)、分子神經(jīng)生物學(xué)等諸方面的變化[9]。目前缺氧預(yù)處理主要集中于機制研究，臨床應(yīng)用仍有一段距離，但由于其保護作用明確，在臨床上有廣泛的應(yīng)用前景。在本實驗中證實缺氧預(yù)處理對缺血性腦損傷具有的神經(jīng)保護作用，可能與缺氧預(yù)處理的一系列內(nèi)源性保護機制相關(guān)。本實驗顯示HM組與單純M組相比較，p-GSK3β及p-STAT3的表達顯著減少，在GSK3β/STAT3信號通路中，因GSK3β位于STAT3上游，目前已有研究證實缺氧預(yù)處理可以增加腦組織Toll樣受體的表達。因此，我們推測缺氧預(yù)處理后可能出現(xiàn)以下兩種保護機制：(1)缺氧預(yù)處理后，Toll樣受體表達增加，其中的TLR5可能使通路下游的起保護作用的Akt(蛋白激酶B)磷酸化表達增加，P38表達下調(diào)；(2)缺氧預(yù)處理后可通過一系列通路使p-GSK3β表達減少，最終兩者的共同通路是通過減少STAT3的表達最終下調(diào)炎性因子的表達、促進抗炎因子表達，發(fā)揮對腦梗死的內(nèi)源性保護作用。

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Mechanism of GSK3 beta /STAT3 signaling pathway in hypoxic preconditioning in rats with ischemic brain injury

TANG Zhi-wei1，3，XIAO Zong-yu2，WU Shi-zheng3*，TANG Chao-qun1

(1.Medical College of Qinghai University，Xining，Qinghai，810001； 2.Department of Neurosurgery，Affiliated Hospital of Qinghai University，Xining，Qinghai 810001； 3.Department of Neurology，Qinghai Provincial People’s Hospital，Xining，Qinghai 810000)

Objective To investigate the role of GSK3β/STAT3 pathway in hypoxic preconditioning ischemic brain injury in rats.Methods 70 male SD rats were randomly divided into normal group(group N，10 rats)，sham operation group(group S，12 rats)，cerebral infarction group(group M，12rats)，cerebral hypoxic preconditioning and obstruction group(group HM，12 rats)，hypoxia preconditioning and brain obstruction and inhibitor group(group HMI，12 rats)，hypoxia and cerebral obstruction treatment and saline group(group HMN，12 rats)，the establishment of middle cerebral artery occlusion model with modified Longa line embolism method(MCAO)，The neurological function score was performed 24 hours after modeling sullessful，cerebral infarction avea was measured by TTC staining，The expression of p-STAT3 and NeuN in the striatum of the infarct area was detected by immunohistochemistry.The expression of p-STAT3 and p-GSK3β in the cerebral cortex of each group were detected by Western Blot method.Results Compared with the M group，the neurological function score and infarct volume in HM，HMN，HMI groups were decreased significantly(P<0.05)；the expression of p-GSK3β，p-STAT3 were significantly decreased(P<0.05)than M group；but the expression of NeuN was higher than M group.Conclusion Hypoxic preconditioning treatment has a neuroprotective effect on ischemic brain injury in rats.The ischemic injury of rat brain can cause the activation of GSK3β/STAT3 signaling pathway.Inhibition of this signaling pathway can reduce neuronal death and has the protective effect on the neural function.

Ischemic brain injury Middle cerebral artery occlusion GSK3β/STAT3 signaling pathway

R74

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2017.01.007

2016-10-10

※：青海省科技廳自然科學(xué)基金青年項目(2015-ZJ-943Q)；*：通信作者，教授，博士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師， E-mail： wushizheng2005@hotmail.com 唐智偉(1987～)，男，漢族，湖南籍，在讀碩士