氨氮對中華小長臂蝦的急性毒性及非特異性免疫指標的影響

包 杰姜宏波程 慧于業輝李曉東,

(1. 沈陽農業大學畜牧獸醫學院, 沈陽 110866; 2. 盤錦光合蟹業有限公司, 盤錦 124200)

氨氮對中華小長臂蝦的急性毒性及非特異性免疫指標的影響

包 杰1姜宏波1程 慧1于業輝1李曉東1,2

(1. 沈陽農業大學畜牧獸醫學院, 沈陽 110866; 2. 盤錦光合蟹業有限公司, 盤錦 124200)

采用生物毒性實驗方法研究了氨氮對中華小長臂蝦的急性毒性作用, 結果表明: 在溫度為(18±1)℃, pH為7.3±0.1條件下, 氨氮對中華小長臂蝦24h、48h、72h、96h 的半致死濃度(LC50)分別為565.47、371.16、291.16和272.50 mg/L, 安全濃度為 27.25 mg/L。轉化為非離子氨的LC50分別為3.74、2.45、1.93 和1.80 mg/L,安全濃度為0.18 mg/L。根據96h 的LC50和安全濃度按照等差數列設置5個氨氮濃度梯度, 分別60、100、140、180和220 mg/L, 研究氨氮脅迫對中華小長臂蝦非特異性免疫指標的影響。結果顯示: 在24h時, 除了220 mg/L的肌肉組織, 中華小長臂蝦肝胰腺和肌肉中的超氧化物歧化酶(SOD)活性顯著性高于對照組, 并具有明顯的劑量效應, 在48—96h均回落到正常水平; 在24h時, 中華小長臂蝦氨氮處理組中肝胰腺的酸性磷酸酶(ACP)與對照組未發生顯著變化, 而堿性磷酸酶(AKP)則顯著高于對照組, 在48—96h兩者的140、180和220 mg/L處理組均顯著低于對照組; 除了140 mg/L 處理組的ACP活性外, 肌肉中的ACP和AKP活性從24h開始就出現了顯著性下降, 始終低于對照組。研究獲得了氨氮對中華小長臂蝦的急性毒性結果和在高氨氮脅迫下非特異性免疫指標的變化規律, 發現中華小長臂蝦對氨氮具有較強的耐受性, 但高濃度的氨氮會對中華小長臂蝦的免疫酶活性產生抑制作用, 研究結果可為中華小長臂蝦健康養殖發展提供科學依據。

中華小長臂蝦; 氨氮; 急性毒性; SOD; ACP; AKP

中華小長臂蝦(Palaemonetes sinensis)是我國唯一有記載的小長臂蝦屬物種, 在分類地位上隸屬于十足目, 長臂蝦科, 小長臂蝦屬[1]。研究表明, 中華小長臂蝦是一種優良的經濟蝦類, 除了在湖泊、河流、水庫等生態系統中具有重要的作用外[2], 還是一種非常受水族愛好者養殖的品種, 具有良好的觀賞價值, 更重要的是它味道鮮美、營養價值高, 深受國內外消費者的喜愛。然而, 資源環境的惡化使得中華小長臂蝦在自然界中的數量急劇減少, 再加上國內和日韓市場的旺盛需求導致其供不應求, 價格也逐年飆升, 因此養殖中華小長臂蝦可以使人們獲得較高的經濟效益。但是, 目前關于中華小長臂蝦的基礎研究非常有限, 多是在做資源調查時有所提及[3], 尚缺乏關于其基礎生態學方面的系統研究,這也極大地限制了中華小長臂蝦人工高密度養殖工作的開展。

氨氮是甲殼動物高密度養殖過程中最重要的脅迫因子之一, 隨著養殖密度的升高, 水體中養殖動物的排泄物和殘餌使得水體中氨氮含量居高不下[4], 高濃度的氨氮不僅會影響到甲殼動物的快速生長, 還會造成免疫力下降、代謝機能紊亂、發病率高, 嚴重影響養殖戶的經濟效益[5—7]。甲殼動物以非特異性免疫為主, 不具有脊椎動物的獲得性免疫, 因此缺乏抗體介導的免疫反應來保護機體健康,主要通過血細胞及從細胞釋放到血漿中的多種活性因子來抵抗外物的入侵[8]。在多種體液因子中,超氧化物歧化酶(SOD)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)等酶活力高低常被用做衡量甲殼動物免疫活力高低的參照指標[9,10], 這些酶在消化分解異物顆粒、免疫反應、營養物質的消化吸收、骨化過程和細胞損傷與修復過程中起著重要的作用[11,12]。因此, 實驗以中華小長臂蝦為對象, 首先通過96h的氨氮毒性實驗獲得中華小長臂蝦的安全濃度, 在此基礎上研究氨氮脅迫對其免疫酶活性的影響, 旨在探討氨氮對中華小長臂蝦的毒害機制,為中華小長臂蝦的健康養殖提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗在沈陽農業大學水產養殖室進行, 所用中華小長臂蝦由盤錦光合蟹業有限公司提供, 在實驗室內養殖2周待其適應室內環境后, 挑選體色正常,體質健壯, 體重為(0.28±0.05) g的個體進行實驗。

1.2 實驗方法

氨氮急性毒性實驗 實驗設有對照組和實驗組, 對照組所用水為經靜置曝氣后的自來水, 根據預試驗結果, 按照等比數列設置實驗組濃度梯度,分別為131、181、249、344、475和656 mg/L, 氨氮濃度用氯化銨(分析純)配制, 每24h換實驗液1次。每個實驗梯度均設置3個平行組, 每個平行組有10尾中華小長臂蝦, 實驗水體為2 L, 溫度為(18±1.0)℃, pH為7.3±0.1。實驗期間不充氣, 定時觀察個體死亡情況, 及時取出死亡個體, 準確記錄24h、48h、72h和96h的死亡尾數。實驗結束后以直線內插法求出氨氮對中華小長臂蝦的半致死濃度(LC50) , 并按公式計算出安全濃度(SC)。

氨氮對中華小長臂蝦免疫指標的影響 通過急性毒性實驗獲得中華小長臂蝦的96h半致死濃度為272.50 mg/L, 安全濃度為 27.25 mg/L, 在此區間按照等差數列設置5個濃度梯度, 分別60、100、140、180和220 mg/L, 以不添加氨氮的自來水為對照組。實驗組氨氮濃度用氯化銨(分析純)來調節。每組3個平行組, 每個平行放 20尾蝦, 實驗在30 L的玻璃缸中進行, 水體為 15 L。實驗期間不投餌, 并及時清污, 每24h換實驗液一次。在實驗開始后24h、48h和96h取肝胰腺和肌肉用于SOD、ACP和AKP活性測定。免疫酶的測定方法如下: 樣品蛋白濃度、SOD、ACP、AKP活性均使用南京建成試劑盒進行測定, 具體測定參照試劑盒說明書進行。

肝胰腺和肌肉SOD酶活性單位定義為每毫克蛋白在1 mL反應液中SOD抑制率達到50%時所對應的SOD量為1個酶活性單位[13], 以U/mg prot表示;肝胰腺和肌肉ACP酶活性單位定義為每克蛋白樣品在37℃與基質作用30min產生1 mg酚為1個活性單位[13], 以金氏單位/g prot表示; 肝胰腺和肌肉AKP酶活性單位定義為每克蛋白樣品在37℃與基質作用15min產生1 mg酚為1個活性單位[13], 以金氏單位/g prot表示。

1.3 數據處理

根據前期統計的死亡數量, 計算出死亡百分率,將死亡百分率轉化為死亡概率單位, 建立24h、48h、72h和96h的氨氮質量濃度的對數(x)與中華小長臂蝦死亡概率單位(y)間的直線回歸方程, 根據方程求算LC50;應用 SC=0.1×96h LC50求得氨氮安全質量濃度估算值。非離子氨的計算公式如下:

利用SPSS 18.0軟件對不同氨氮濃度處理下3種酶活性進行單因素方差分析(ANOVA)和Duncan多重比較, 以P＜0.05作為差異顯著性水平。

2 結果

2.1 氨氮急性毒性實驗

結果表明(表 1): 對照組在 96h內無死亡, 實驗組則是氨氮濃度越高, 對中華小長臂蝦的毒性越強,死亡率越強。同一氨氮濃度, 隨時間的延長, 對中華小長臂蝦的毒性作用增強。根據表 1的數據求出氨氮對中華小長臂蝦 24h、48h、72h和96h的半致死濃度分別為 565.47、371.16、291.16和272.50 mg/L,安全濃度為 27.25 mg/L。將24h、48h、72h和96h的半致死濃度、安全濃度轉化為非離子氨的濃度分別為3.74、2.45、1.93、1.80和0.18 mg/L (表 2)。

2.2 氨氮對中華小長臂蝦SOD活性的影響

從圖 1可以看出, 在24h時, 酶活性是隨著氨氮濃度的上升而上升, 對照組的酶活性最低, 顯著低于140、180和220 mg/L處理組(P＜0.05); 在氨氮濃度為220 mg/L時最高, 并顯著高于其他處理組(P＜0.05)。隨著處理時間的延長, 各氨氮處理組的酶活性均開始下降, 48h和96h的酶活與對照組之間并無顯著性差異(P＞0.05)。

表 1 氨氮對中華小長臂蝦對蝦急性毒性實驗結果Tab. 1 The acute toxicity of ammonia-N on P. sinensis

從總體上看, 各氨氮處理組中華小長臂蝦肌肉中SOD活性變化趨勢與肝胰腺相近(圖 2)。在24h時, 酶活性是隨著氨氮濃度的上升而上升, 但在濃度為220 mg/L處理組時, 酶活性突然降至最低,與對照組的酶活性無顯著性差異, 并顯著低于140和180 mg/L處理組(P＜0.05); 在所有處理組中以氨氮濃度為180 mg/L時最高, 顯著高于其他處理組(P＜0.05)。同肝胰腺一樣, 隨著處理時間的延長, 除220 mg/L外的各氨氮處理組的酶活性均開始下降, 48h和96h與對照組之間并無顯著性差異(P＞0.05)。

2.3 氨氮對中華小長臂蝦ACP活性的影響

從圖 3可以看出, 在24h時, 各氨氮處理組的ACP活性與對照組均無顯著性差異(P＞0.05)。在48h時, 除了60 mg/L處理組外, 其他處理組的ACP活性均顯著性低于對照組(P＜0.05)。到了96h, 處理組中濃度為140、180和220 mg/L的ACP活性仍顯著低于對照組(P＜0.05), 但60和100 mg/L處理組與對照組之間無顯著性差異(P＞0.05)。

中華小長臂蝦肌肉中的ACP活性與肝胰腺有所不同(圖 4), 在24h時, 各氨氮處理組的ACP活性已經開始下降, 除140 mg/L處理組外, 其他處理組均顯著低于對照組(P＜0.05), 在220 mg/L時降至最低, 顯著低于其他各處理組(P＜0.05)。相比于24h、48h的各氨氮處理組的ACP活性進一步下降, 并全部顯著低于對照組(P＜0.05)。在96h時, 各處理組的ACP活性仍顯著低于對照組, 其中以最高濃度的220 mg/L最低, 顯著低于其他各氨氮處理組(P＜0.05)。

表 2 中華小長臂蝦不同時間的半致死濃度Tab. 2 The half lethal concentration of P. sinensis in different time

圖 1 氨氮對中華小長臂蝦肝胰腺SOD活性的影響Fig. 1 The effect of ammonia-N on hepatopancreas SOD activity of P. sinensis

圖 2 氨氮對中華小長臂蝦肌肉SOD活性的影響Fig. 2 The effect of ammonia-N on muscle SOD activity of P. sinensis

2.4 氨氮對中華小長臂蝦AKP活性的影響

從圖 5可以看出, 在24h時, 相比于對照組, AKP活性有所升高, 除了100 mg/L外, 其他各處理組均顯著高于對照組(P＜0.05)。與24h不同, 在48h時, 隨著氨氮濃度的上升, AKP活性開始下降,除了低濃度的60 mg/L處理組外, 其他氨氮濃度均顯著低于對照組(P＜0.05)。到96h時, 100 mg/L處理組AKP活性有所回升, 與對照組間差異不顯著(P＞0.05), 但140、180和220 mg/L處理組仍顯著低于對照組(P＜0.05)。

如圖 6所示, 在24h時, 中華小長臂蝦肌肉中AKP活性與肝胰腺表現出了不同的趨勢, 各氨氮處理組的AKP活性并未上升, 反而開始下降, 各處理組均顯著低于對照組(P＜0.05)。相比于24h, 48h的各氨氮處理組AKP活性均有所下降, 尤其在180和220 mg/L處理組下降較為劇烈, 顯著低于其他處理組(P＜0.05)。到96h, 100和140 mg/L處理組的肌肉AKP活性進一步下降, 各處理組的AKP活性仍顯著低于對照組(P＜0.05)。

圖 3 氨氮對中華小長臂蝦肝胰腺ACP活性的影響Fig. 3 The effect of ammonia-N on hepatopancreas ACP activity of P. sinensis

圖 4 氨氮對中華小長臂蝦肌肉ACP活性的影響Fig. 4 The effect of ammonia-N on muscle ACP activity of P. sinensis

圖 5 氨氮對中華小長臂蝦肝胰腺AKP活性的影響Fig. 5 The effect of ammonia-N on hepatopancreas AKP activity of P. sinensis

圖 6 氨氮對中華小長臂蝦肌肉AKP活性的影響Fig. 6 The effect of ammonia-N on muscle AKP activity of P. sinensis

3 討論

氨氮是甲殼動物蛋白質代謝的最終產物, 占甲殼動物氮代謝的60%—80%[14]。在工廠化養殖過程中, 由于養殖的高密度會導致養殖生物的代謝廢物和殘餌量加大, 進而造成氨氮含量升高, 容易誘發魚病, 這也是影響工廠化高密度養殖成功的主要因素之一。因此, 研究蝦類氨氮的毒性實驗, 是了解蝦類在氨氮脅迫條件下對氨氮耐受性的基礎, 在養殖過程中具有重要的意義。從本研究結果可以看出, 中華小長臂蝦對氨氮具有較強的耐受能力。在本實驗條件下, 中華小長臂蝦的96h LC50達到了272.50 mg/L。相比之下, 在水溫24℃、鹽度31、pH 8.1條件下, 氨氮對脊尾白蝦(Exopalamon carincauda)幼蝦(體長1.2cm)的96h LC50為80.40 mg/L, 成蝦(體長4.3cm)為120.86 mg/L[15]; 在水溫(24.93± 2.7)℃條件下, 氨氮對體重為(6.8±1.2) g和體重為(12.8±1.1) g的克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)的96h LC50分別為169.83和262.60 mg/L[16]; 在溫度為30℃, pH為8, 鹽度為34.5條件下, 氨氮對斑節對蝦(Penaeus monodon)96h LC50為29.94 mg/L[17]。可以看出, 這些研究中的蝦對氨氮的耐受性均低于中華小長臂蝦。當然, 由于氨氮耐受性的影響因素較多,體重、pH、溫度和鹽度等因素都會影響到生物對氨氮的耐受程度, 因此如果想對不同蝦的氨氮耐受性進行比較, 還需對實驗條件進行統一。

在養殖水體中氨氮濃度可能在短時間內急劇升高, 從而會對養殖生物造成急性脅迫, 引起水產動物代謝異常而產生大量的活性氧自由基(ROS),這些氧自由基會威脅生物體健康, 及時地清除掉體內的ROS, 能夠保障細胞發揮正常功能[18]。而SOD是生物體內一種十分重要的抗氧化酶, 能夠對抗與阻斷因ROS對細胞造成的損害, 在防御機體衰老和保護生物體健康等方面發揮重要作用[19,20]。本研究發現, 當中華小長臂蝦受到氨氮脅迫24h時, 除了220 mg/L的肌肉組織外, 肝胰腺和肌肉組織中的SOD酶活性均會應激性升高, 并且具有明顯的濃度依賴性, 即處理組的氨氮濃度越高, SOD酶活性越高。隨著時間的延長, 處理組的SOD酶活性開始下降, 并在48h和96h時恢復到正常水平。這與李永等[17]、任海等[21]的研究結果相似, 他們研究結果發現斑節對蝦在氨氮脅迫12h時SOD活性升到最高,并在48h時酶活性恢復到正常水平, 除低濃度氨氮組外, 脊尾白蝦氨氮脅迫6—24h, 血淋巴和肝胰腺組織SOD活力都有不同程度的升高, 脅迫48—72h上述指標則開始下降并逐漸低于對照組。出現這種變化趨勢的主要原因可能是氨氮脅迫后會導致體內的ROS增加, 進而導致SOD酶活性應激性升高,促進機體活性氧的清除, 隨著氨氮脅迫的持續, ROS的不斷增多造成中華小長臂蝦肝胰腺和肌肉組織SOD持續消耗, 逐漸恢復到正常水平[22]。

ACP和AKP普遍存在于動植物體內, 是兩種參與免疫防御的重要水解酶, 可催化各種含磷化合物的水解過程[23]。在本研究中, 肝胰腺中的AKP出現了短暫升高, 這可能是短時間內一定濃度的氨氮使得中華小長臂蝦通過去磷酸化應激反應來適應氨氮的脅迫有關[24]。但隨著氨氮脅迫時間的延長, 肝胰腺和肌肉的ACP和AKP活力均呈現顯著降低的趨勢, 這與甲殼動物在密度、鹽度和溫度等脅迫條件下酶活力隨時間的變化趨勢基本一致[25]?？梢钥闯? 長時間的氨氮脅迫會顯著抑制中華小長臂蝦肝胰腺和肌肉中ACP和AKP的活力, 出現免疫疲勞,降低中華小長臂蝦機體的免疫防御能力, 對中華小長臂蝦的養殖是不利的。

國家漁業水質標準中規定非離子氨的含量不能超過0.02 mg/L, 本實驗發現中華小長臂蝦非離子氨的安全濃度為0.18 mg/L, 說明中華小長臂蝦對高密度養殖過程中產生的氨氮脅迫具有較強的耐受性。但長時間受到氨氮脅迫會導致中華小長臂蝦免疫力下降, 因此, 在養殖過程中應該注意氨氮含量控制在安全范圍內, 避免脅迫導致中華小長臂蝦疾病的發生。

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EFFECT OF AMMONIA NITROGEN ON ACUTE TOXICITY AND NONSPECIFIC IMMUNE PARAMETERS OF PALAEMONETES SINENSIS

BAO Jie1, JIANG Hong-Bo1, CHENG Hui1, YU Ye-Hui1and LI Xiao-Dong1,2
(1. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China; 2. Panjin Guanghe Crab Ltd., Co., Panjin 124200, China)

The current study explored the acute biological toxicity of ammonia-N on Palaemonetes sinensis. In the condition of (18±1)℃, pH 7.3±0.1, the half lethal concentrations of ammonia-N were 565.47 mg/L for 24h, 371.16 mg/L for 48h, 291.16 mg/L for 72h, and 272.50 mg/L for 96h, respectively, and the safe concentration was 27.25 mg/L. In the same condition, half lethal concentrations of non-ionic ammonia were 3.74 mg/L for 24h, 2.45 mg/L for 48h, 1.93 mg/L for 72h, 1.80 mg/L for 96h respectively and the safe concentration was 0.18 mg/L. Five different concentrations (60 mg/L, 100 mg/L, 140 mg/L, 180 mg/L and 220 mg/L) were used to study the influence of ammonia nitrogen stress on the non-specific immune indexes based on 96h LC50and safety concentration. Results showed that the superoxide dismutase (SOD) in hepatopancreas and muscle of P. sinensis significantly increased by ammonia nitrogen at 24h except muscle tissue in 220 mg/L, which decreased to the normal level at 48—96h. Compared with the control group, acid phosphatase (ACP) in hepatopancreas of P. sinensis by ammonia nitrogen treatment was not changed significantly at 24h, while alkaline phosphatase (AKP) was significantly increased. At 48—96h, both ACP and AKP were lower than the control group. Muscle ACP and AKP by ammonia nitrogen treatments except 140 mg/L were significantly lower than those in the control group at 24 and 96h. This study revealed that P. sinensis had strong tolerance to ammonia nitrogen. High ammonia nitrogen had can inhibit the activities of immune enzyme. The results will provide the scientific basis for the aquaculture of P. sinensis.

Palaemonetes sinensis; Ammonia-N; Acute toxicity; SOD; ACP; AKP

S968.22

A

1000-3207(2017)03-0516-07

10.7541/2017.66

2016-05-05;

2016-07-06

遼寧省教育廳項目(L2015472、L2014254); 遼寧省自然科學基金(201602654)資助 [Supported by the fund of Liaoning Provincial Department of Education (L2015472, L2014254); Natural Foundation of Liaoning Province (201602654)]

包杰 (1980—), 女, 滿族, 遼寧人; 講師, 博士; 研究方向為甲殼動物遺傳育種。E-mail: yh_baojie@163.com, Tel: 15904088690

李曉東 (1965—), 男, 教授, 博士; 研究方向為甲殼動物遺傳育種。E-mail: lxd001@ceraap.com