八肋游仆蟲胞質核糖體蛋白基因序列特征分析

王軟林 趙雪梅 張志云 梁愛華

(山西大學生物技術研究所化學生物學與分子工程教育部重點實驗室, 太原 030006)

八肋游仆蟲胞質核糖體蛋白基因序列特征分析

王軟林 趙雪梅 張志云 梁愛華

(山西大學生物技術研究所化學生物學與分子工程教育部重點實驗室, 太原 030006)

為了探討八肋游仆蟲(Euplotes octocarinatus)核糖體蛋白基因的數目及其結構的特殊性, 研究通過生物信息學方法, 對八肋游仆蟲胞質核糖體蛋白進行了系統的分析。共鑒定得到98個基因編碼78種不同的胞質核糖體蛋白。其中19種胞質核糖體蛋白基因發生了復制, 盡管都是有功能的, 但其中一個基因的表達受到限制。通過與高等真核生物比較, 我們發現: 八肋游仆蟲核糖體蛋白eS30缺失了N端的類泛素結構域, eL6缺失了N端的Ribosomal_L6e_N結構域。另外, 不同于其他高等真核生物, 八肋游仆蟲酸性核糖體磷酸化蛋白uL10為堿性蛋白。研究為進一步探討低等真核生物核糖體的組裝及功能奠定了基礎。

八肋游仆蟲; 核糖體蛋白; 序列分析

核糖體是最古老也是最普遍的生命復合體, 它能夠將遺傳信息(mRNA)轉化為執行各種生命功能的蛋白質, 是細胞中催化蛋白質合成的重要細胞器。雖然進化程度越高, 生物的核糖體越復雜, 但其結構和功能在進化上是保守的[1]。所有的核糖體都由一組核糖體蛋白(Ribosomal protein, RP)圍繞著催化活性中心核糖體RNA(rRNA)組成。真核生物胞質核糖體位于內質網及細胞質基質中, 負責翻譯核基因產生的所有mRNA。它由4種不同的rRNA分子及78—80種胞質核糖體蛋白(Cytoplasmic ribosomal proteins, CRPs)組成。其中, 大亞基含有28S rRNA、5.8S rRNA、5S rRNA及47種RPs, 小亞基含有18S rRNA和32種RPs[2]。

1979年, Wool[3]首次對大鼠(Rat)的CRPs進行了分離和性質描述。隨后, 人們陸續對人(Homo sapiens)[4,5]、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)[6]、擬南芥(Arabidopsis thaliana)[7]及黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)[1]等多種生物的全部核糖體蛋白基因(Ribosomal protein genes, RPGs)進行了系統分析。目前, 核糖體蛋白基因數據庫 (Ribosomal protein gene database)中已收錄39種真核生物, 4種古細菌, 4種真細菌的全部CRPs基因序列信息[8]。

八肋游仆蟲(Euplotes octocarinatus)是一種淡水纖毛蟲, 體內含有一個大核和一個小核[9]。除了其特殊核結構外, 在基因表達調控方面游仆蟲也有特殊之處。在游仆蟲中存在終止密碼子重新分配的現象, 即UAA和UAG作為終止密碼子, 而UGA編碼半胱氨酸[10]或硒代半胱氨酸[11]; 此外游仆蟲中還存在高頻率的編程性核糖體移碼現象[12,13]。游仆蟲中這些特殊現象均與蛋白質合成過程相關, 而核糖體又是細胞內蛋白質合成的場所, RPs作為核糖體的重要組成部分, 在游仆蟲中是否具有特殊性呢？

本研究利用實驗室前期測得的八肋游仆蟲基因組和轉錄組數據, 通過同源序列比對, 共鑒定得到98條RPGs序列, 對應于78種RPs。此外, 對其結構域、理論等電點及分子量進行了分析, 并與高等真核生物進行比較。為進一步探討游仆蟲RPs結構的特殊性, 對比分析高等真核生物、低等真核生物、原核生物RPs的基因結構及三者之間的分子進化關系提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 數據來源

八肋游仆蟲基因組數據, 轉錄組數據及蛋白質譜數據由本實驗室前期測得[12,13]。嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophile) RPs序列下載自TGD (http:// ciliate.org/index.php/home/welcome), 三棱尖毛蟲(Oxytricha trifallax)RPs序列下載自OxyDB (http:// oxy.ciliate.org/index.php/home/welcome/), 第四雙小核草履蟲(Paramecium tetraurelia) RPs序列下載自ParameciumDB (http://paramecium.cgm.cnrs-gif.fr/),浮萍棘尾蟲(Stylonychia lemnae) RPs序列下載自StyloDB (http://stylo.ciliate.org/index.php/home/welcome), 多子小瓜蟲(Ichthyophthirius multifiliis) RPs序列下載自IchDB (http://ich.ciliate.org/index. php/home/welcome); 人及其他物種的RPs序列均下載自核糖體蛋白數據庫(Ribosomal protein gene database: http://ribosome.med.miyazaki-u.ac.jp/)。

本研究涉及的生物學軟件有: 本地化的BLAST軟件[14], EMBOSS軟件包中的GetOrf程序[15], Web-Logo[16]及MEGA5.1[17]。

1.2 八肋游仆蟲胞質核糖體蛋白基因的鑒定

為了盡可能找出基因組中所包含的全部CRPs基因序列, 我們對八肋游仆蟲基因組及轉錄組數據庫進行了一系列的BLAST搜索。首先利用人的CRPs序列作為queries對八肋游仆蟲基因組數據庫進行tblastn搜索, 考慮到二者之間進化差異較大, 我們將E值設置為0.1。接著將鑒定得到的八肋游仆蟲微染色體序列作為queries, 對NCBI的非冗余蛋白數據庫進行blastx搜索, 檢查每條序列blastx結果的前20條匹配項是否為核糖體蛋白, 最終鑒定得到110條可能編碼CRPs基因的微染色體。為了排除其中可能的假基因, 對八肋游仆蟲轉錄組數據庫進行blastn搜索, 最終有98條微染色體找到了對應的轉錄本。

1.3 生物信息學分析

利用EMBOSS軟件包中的GetOrf程序預測RPs的氨基酸長度, 利用ExPASy (http://web.expasy. org/compute_pi/)在線預測游仆蟲RPs理論等電點及分子量, 利用Pfam[18](http://pfam.xfam.org/)在線預測游仆蟲RPs所含結構域。

1.4 八肋游仆蟲核糖體蛋白eS30及eL6基因系統進化樹的構建

利用軟件MEGA5.1進行多重序列比對, 比對結果進行了核對并通過手工進行了相應的校正。序列一部分代表了纖毛蟲, 一部分代表模式動物、植物、真菌和寄生蟲。用MEGA5.1軟件構建系統進化樹, 方法為最大似然法, 并進行1000次自展(Bootstrap)檢驗來評估進化樹分支可信度。

2 結果

2.1 八肋游仆蟲CRPs基因的鑒定

以人的CRPs序列作為參考, 通過一系列的BLAST搜索, 最終從八肋游仆蟲基因組中鑒定得到98條CRPs基因序列, 對應于78種CRPs(32種小亞基核糖體蛋白和46種大亞基核糖體蛋白), 僅eL41沒有找到(表 1)。考慮到eL41較短(僅75 bp), 可能在建庫過程丟失, 我們設計了簡并性引物進行PCR擴增,也未能獲取該蛋白的DNA序列信息。在嗜熱四膜蟲和尖毛蟲兩種親緣關系較近的纖毛蟲基因組中存在編碼該蛋白的基因, 所以推測八肋游仆蟲中應該含有eL41。這98條微染色體均含有兩端端粒, 所以可以排除線粒體核糖體蛋白基因的污染。我們對每一條RP基因序列的內含子個數、氨基酸長度、理論等電點、分子量以及所包含的結構域進行了預測(表 1)。

八肋游仆蟲RPs基因根據2014年Nenad Ban等[19]提出的新的核糖體蛋白基因命名系統進行命名。Blastx結果顯示Contig5394與其他生物的核糖體蛋白uS9基因同源性較高, 其C端含有保守的Ribosomal_S9結構域, 但其開放閱讀框較長(共編碼874個氨基酸), 跟其他生物胞質核糖體蛋白uS9相差較大, 我們將其命名為uS9-like基因。

2.2 八肋游仆蟲中19種CRPs基因含有兩個亞型

在八肋游仆蟲78種不同的CRPs中, 有19種是由兩個不同的基因編碼的(表 2), 我們分別在基因名后添加后綴 “A”或者“B”來加以區分。其中 5對基因編碼小亞基核糖體蛋白, 另外14對基因編碼大亞基核糖體蛋白。分析這38條CRPs基因序列, 發現其蛋白編碼區均不含有無義突變。轉錄組數據表明這些基因均具有轉錄活性, 部分基因有蛋白質譜數據支持, 表明這些基因能夠產生蛋白產物(表2)。這些證據表明這19對核糖體蛋白基因均是有功能的, 不是假基因。基因組中CRPs基因的復制現象在其他真核生物中也有報道。如在黑腹果蠅的79種CRPs中, 有9種是由兩個不同的基因編碼的[1], 而在釀酒酵母中, 有59種CRPs是由兩個不同的基因編碼的[20]。

在19對CRPs基因中, 氨基酸序列完全一致的有7對(eS17、eS28、uL1、uL2、eL13、uL14及eL39),氨基酸序列相似度大于90%的有6對(eS6、eS7、uL15、eL21、eL33及eL34), 氨基酸序列相似度低于90%的有6對(uS11、uS19、eL24、eL29、uL30及P1), 其中eL24A與eL24B的氨基酸序列相似度最低,僅15.9%, 但二者均含有保守的Ribosomal_L24e結構域。而uL30A與uL30B的氨基酸序列相似度僅為26.2%, 其中uL30B未能檢測到保守的結構域, 暗示其可能具有較高的物種特異性。

表 1 八肋游仆蟲胞質核糖體蛋白基因Tab. 1 The cytoplasmic ribosomal protein genes of E. octocarinatus

續表1

續表1

此外, 我們還對這19對CRPs基因的RPKM (Reads per kilobases per millionreads)值進行了分析, 結果顯示除個別基因對外, 大部分基因對中兩個亞型的RPKM值有明顯差異, 表明其mRNA水平明顯不同。

2.3 八肋游仆蟲胞質核糖體蛋白的保守性與特殊性

核糖體蛋白是一類進化上高度保守的蛋白, 某些核糖體蛋白在從低等的細菌到高等的哺乳動物中均高度保守。將八肋游仆蟲與人的CRPs基因進行比較分析, 結果顯示八肋游仆蟲核糖體蛋白既具有高度的保守性, 同時又存在著自身的特殊性。

內含子 與高等真核生物相比, 纖毛蟲基因組中內含子數目較少, 且長度較短[21]。分析八肋游仆蟲CRPs基因發現, 有41個核糖體蛋白基因含有1—3個內含子, 最短的內含子僅25 bp, 最長的342 bp。內含子平均GC含量(25%)低于編碼區(39%)。我們截取每條內含子5′端及3′端10 bp的序列, 分析其保守性。分析發現, 除Contig20753的第二個內含子外(其5′端剪切邊界為GC), 其他內含子序列擁有統一的剪切型內含子邊界(5′-GT…AG-3′), 并且在5′端含有同高等真核生物內含子一致的相似序列GTAAG。

結構域 在高等真核生物中, 有兩種泛素融合核糖體蛋白(eS31和eL40)。此外, 小亞基核糖體蛋白eS30的N端融合有一個由74個氨基酸組成的類泛素(Ubiquitin-like, FUb)結構域。在八肋游仆蟲中, 胞質核糖體蛋白eS31和eL40的N端含有泛素(Ubiquitin, Ub)結構域。但其eS30的N端缺失了類泛素結構域(圖 1A)。之前有報道稱, 在酵母, 擬南芥及頂復門的弓形蟲和瘧原蟲中, 核糖體蛋白eS30的N端也缺失了該類泛素結構域[22]。我們進而分析了嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophile)、浮萍棘尾蟲(Stylonychia lemnae)、三棱尖毛蟲(Oxytricha trifallax)、多子小瓜蟲(Ichthyophthirius multifiliis)和第四雙小核草履蟲(Paramecium tetraurelia)的eS30序列, 發現所有纖毛蟲核糖體蛋白eS30均不含有融合的類泛素結構域(圖 1A)。

表 2 胞質核糖體蛋白基因亞型分析Tab. 2 Analysis of duplicate CRP genes

此外, 我們發現所有原生動物及部分真菌的核糖體蛋白eL6均缺少N端的Ribosomal_L6e_N結構域(圖 1B)。由于目前關于核糖體蛋白eL6的研究較少, 所以對于低等真核生物中eL6N端缺失Ribosomal_L6e_N結構域可能的作用及影響尚不清楚。

圖 1 不同物種核糖體蛋白eS30(A)和eL6(B)基因結構域分析Fig. 1 Domain analysis of ribosomal protein eS30 (A) and eL6 (B) genes in various species系統發育樹是利用不同物種的eS30和eL6蛋白采用最大似然法構建的, 自展值以百分比的形式列于每一個節點, 各物種核糖體蛋白所包含的結構域列在右側The domains of eS30 and eL6 are mapped onto the maximum likelihood phylogenetic tree. Bootstrap values are displayed as percentages at each tree node. The domains of ribosomal protein are shown on the right

等電點 八肋游仆蟲CRPs基因的理論等電點及分子量與高等真核生物非常相似。跟人及其他生物一樣, 八肋游仆蟲中酸性的胞質核糖體蛋白很少: 僅有5個蛋白(uS2、eS12、P1A、P1B及P2)的等電點小于pH 7.0。與高等真核生物不同的是,真核生物酸性核糖體磷酸化蛋白uL10在八肋游仆蟲中是堿性的(表 3)。進一步研究表明纖毛蟲的uL10均為堿性, 而隸屬于頂復門的弓形蟲及瘧原蟲,其uL10蛋白為酸性(表 3)。這一結果與前期嗜熱四膜蟲中關于uL10蛋白的研究結果一致[23]。實驗室前期工作表明八肋游仆蟲酸性核糖體磷酸化蛋白P1A與P1B有相互作用, 但與P2均無相互作用[24], 那么特殊的uL10是否在核糖體柄狀結構五聚體的形成過程中發揮重要作用, 尚需后續實驗驗證。

表 3 不同物種核糖體蛋白uL10的理論等電點Tab. 3 The theoretical isoelectric point of ribosomal protein uL10 in various species

3 討論

在本研究中, 我們得到了除eL41外所有的八肋游仆蟲CRPs基因的序列信息, 這是迄今為止纖毛蟲中第一個對單一物種所有CRPs基因的全面分析。在八肋游仆蟲基因組中, 我們預測得到98個CRPs基因序列, 對應于78個核糖體蛋白基因家族。有19種CRPs基因有兩種亞型, 且兩種亞型的mRNA水平有明顯差異。通過與人等高等真核生物比較, 我們發現八肋游仆蟲CRPs在進化上高度保守, 但某些蛋白也具有物種特異性。其中核糖體蛋白eS30缺少N端的類泛素結構域, 核糖體蛋白eL6缺少N端的Ribosomal_L6e_N結構域。另外, 八肋游仆蟲的酸性核糖體磷酸化蛋白uL10不同于其他真核生物, 為堿性蛋白。

基因復制(Gene duplication)是產生新的基因的主要途徑[25]。八肋游仆蟲中有19種CRPs發生了復制, 這為我們后續研究基因復制后功能的分化提供了機會。盡管轉錄組數據表明這19對基因中兩個亞型的mRNA水平差異較大, 但造成這種差異的原因及其生物學意義目前尚不清楚。在酵母中, 大部分CRPs基因都發生了復制。雖然這些CRPs蛋白序列相似度很高(～95%), 但敲除后表現出不同的表型, 暗示這些復制的核糖體蛋白基因(duplicated RPGs, dRPGs)的功能可能發生了特化[26]。dRPGs功能的差異是通過基因表達形式的變化形成的。分析無內含子的RPs基因的序列及表達模式發現,每一個dRPG的表達水平都受到特定調控序列的調控, 以此來應對變化的生長條件。dRPGs序列的均一化(Homogenization)雖然并不改變表達的基因的數量, 但降低了細胞的耐壓能力。所以, 在酵母中,復制基因提供了一種調控核糖體蛋白響應壓力表達的方式[27]。在黑腹果蠅中, 不同的核糖體蛋白亞型具有組織表達特異性, 如RpS5b、RpS19b及RpL10Aa僅在果蠅的生殖細胞中富集表達[1]。在后續實驗中, 我們可通過檢測不同時期(生長時期、饑餓時期、接合生殖時期)及不同外界壓力(如熱激處理, 高鹽濃度處理)下dRPGs的mRNA水平, 比較分析dRPGs不同亞型啟動子的強弱, 來深入研究游仆蟲中dRPGs不同亞型之間的分工及生物學意義。

核糖體蛋白在進化上高度保守, 這使得我們可以利用高等真核生物的RPs序列通過同源比對, 鑒定出低等真核生物八肋游仆蟲的全部RPs基因。分析結果顯示八肋游仆蟲RPs既具有高度的保守性,又存在著自身的特殊性。八肋游仆蟲核糖體蛋白eS30和eL6N端結構域發生缺失。在高等真核生物,如人、小鼠、果蠅及線蟲中, 核糖體蛋白eS30的N端含有FUb結構域, 研究顯示, 在這些生物中, 存在相應的蛋白酶能夠將FUb結構域切除, 所以在成熟的核糖體中, 核糖體蛋白eS30并不包含FUb結構域[28]。那么FUb結構域有何功能呢？研究人員推測FUb結構域可能在eS30的合成過程中扮演分子伴侶的角色, 以達到提高核糖體蛋白產量的目的[22,29]。核糖體蛋白除了參與核糖體組裝外, 還具有重要的核糖體外功能。核糖體蛋白eL6跟人類疾病努南綜合征(Noonan syndrome)有關[30]。對幾種哺乳動物核糖體蛋白eL6氨基酸序列進行比對, 發現該蛋白N端部分序列差異較大, 本研究結果顯示, 不同生物的核糖體蛋白eL6的N端序列明顯不同, 原生動物及酵母的eL6N端缺失了Ribosomal_L6e_N結構域。由于目前關于eL6基因N端結構域功能的研究較少, 所以低等真核生物中缺失Ribosomal_L6e_N結構域的影響尚不清楚。分析八肋游仆蟲和人核糖體蛋白基因eS30和eL6的基因結構(圖 2)發現, 在緊挨Ribosomal_S30結構域和Ribosomal_L6e結構域的上游都有一個內含子存在, 我們推測這兩個融合基因是通過外顯子改組(Exon shuffling)進化而來的。

總之, 對八肋游仆蟲全部CRPs基因的鑒定, 以及對它們的序列結構和基本特征的研究, 為我們深入探討其生物學功能、核糖體的結構模型奠定了基礎。

圖 2 游仆蟲和人核糖體蛋白基因eS30(A)和eL6(B)基因結構Fig. 2 Structures of the Euplotes and human eS30 (A) and eL6 (B) genes黑色方框代表外顯子及側翼DNA, 細線代表內含子。基因按相同比例繪制, 除了人的核糖體蛋白基因的內含子按比例縮小了一半Exons and flanking DNA are shown as black boxes, introns as fine lines. Genes are drawn to the same scale except that introns of human ribosomal protein genes are half-scale

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THE CHARACTERIZATION OF CYTOPLASMIC RIBOSOMAL PROTEIN GENES IN EUPLOTES OCTOCARINATUS

WANG Ruan-Lin, ZHAO Xue-Mei, ZHANG Zhi-Yun and LIANG Ai-Hua
(Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education, Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

Ribosome is a ribonucleoprotein complex that is composed of rRNAs and proteins, and is responsible for the synthesis of polypeptide chains in all living cells. Euplotes octocarinatus is a freshwater ciliate which possesses unique regulation of gene expression. The study of the unique features of E. octocarinatus ribosomal proteins has been hampered by the lack of available information. In this study, we performed bioinformatic approach to conduct a systematic analysis of the CRPs of E. octocarinatus. We identified 98 genes encoding 78 different CRPs. Interestingly, 19 CRP genes are present as duplicates and, while all appear to be functional, one member of each gene pair has relatively limited expression. Compared with higher eukaryotic organisms, the ribosomal proteins eS30 and eL6 of E. octocarinatus lost ubiquitin-like domain and Ribosomal_L6e_N domain, respectively. Furthermore, the uL10 of E. octocarinatus is a basic protein. Our study lay a foundation for the future understanding of the assembling and function of ribosome in lower eukaryotic organisms.

Euplotes octocarinatus; Ribosomal protein; Sequence characterization

Q344+.1

A

1000-3207(2017)03-0661-10

10.7541/2017.84

2016-10-19;

2016-12-29

國家自然科學基金(31071924和31372199)資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31071924, 31372199)]

王軟林(1989—), 男, 山西臨汾人; 在讀博士; 主要研究方向為原生動物分子生物學。E-mail: swangrl@163.com

梁愛華(1957—), 女, 山西榆社人; 教授, 博士; 主要研究方向為分子生物學。E-mail: aliang@sxu.edu.cn