日本鰻鱺IFN-γ 基因的鑒定、表達模式及啟動子活性分析

彭喜霞黃 貝段利朋李春艷梁 英聶 品,黃文樹,

(1. 集美大學水產學院, 廈門 361021; 2. 中國科學院水生生物研究所淡水生態與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072; 3. 鰻鱺現代產業技術教育部工程研究中心, 廈門 361021; 4. 福建省海洋生物資源開發利用協同創新中心, 廈門 361005)

日本鰻鱺IFN-γ 基因的鑒定、表達模式及啟動子活性分析

彭喜霞1黃 貝1段利朋1李春艷1梁 英1聶 品1,2黃文樹1,3,4

(1. 集美大學水產學院, 廈門 361021; 2. 中國科學院水生生物研究所淡水生態與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072; 3. 鰻鱺現代產業技術教育部工程研究中心, 廈門 361021; 4. 福建省海洋生物資源開發利用協同創新中心, 廈門 361005)

為揭示魚類IFN-γ的生物學功能, 研究從日本鰻鱺(Anguilla japonica)中克隆獲得了IFN-γ基因, 命名為AjIFN-γ。AjIFN-γ具有脊椎動物IFN-γ的典型特征: 包括4外顯子/3內含子的基因結構、C端的IFN-γ特征性氨基酸基序和1個核定位信號, 以及6個α-螺旋反向平行構成的二級結構。AjIFN-γ在日本鰻鱺所有組織中均低水平轉錄表達, 其中肝臟中表達量最高, 其次是皮膚和頭腎。Poly I:C刺激和遲緩愛德華氏菌感染均可顯著誘導AjIFN-γ在鰓、頭腎、體腎和(或)脾臟中的轉錄表達, 表明AjIFN-γ能夠參與日本鰻鱺抗菌和抗病毒的免疫過程。此外, 研究還克隆了AjIFN-γ基因的5′調控區序列共1536 bp, 并構建了一系列AjIFN-γ 5′調控區刪節突變體, 分析其啟動子活性, 結果表明, 上游–240/+136區域中含有起始AjIFN-γ轉錄的關鍵啟動子調控元件,–1062/–814區域存在轉錄的正調控元件, 而–1252/–1062區域存在轉錄的負調控元件。上述結果進一步豐富了魚類IFN-γ的基礎知識。

IFN-γ; 日本鰻鱺; 轉錄表達; 啟動子

在哺乳動物中, IFN-γ (interferon-γ, 干擾素γ)是II型IFN的唯一成員, 主要由CD4+輔助T淋巴細胞、CD8+細胞毒性T細胞、NK細胞以及APC細胞產生[1—3]。IFN-γ在進化中高度保守, 其基因組均由4個外顯子和3個內含子結構組成, 氨基酸序列的C端含有IFN-γ特征基序和由4個連續的賴氨酸或精氨酸組成的核定位基序(Nuclear localization site; NLS)。IFN-γ不僅可調節前炎癥細胞因子和趨化因子的產生、激活巨噬細胞的吞噬作用、刺激具有抗菌活性的氧中間體和一氧化氮的產生和釋放, 還可促進Th0細胞分化為Th1細胞, 并誘導MHCⅠ、MHCⅡ類分子和抗原提呈細胞上協同刺激分子的表達以及B細胞中免疫球蛋白類型轉換[4], 在宿主抵抗病毒和胞內細菌感染的過程中發揮著重要的作用。

與哺乳動物不同, 魚類基因組中發現兩個緊密連鎖的IFN-γ基因。第一個IFN-γ是Zou等[5]通過基因共線性分析從河鲀(Takifugu rubripes)中首先發現。2006年, Igawa等[6]發現在斑馬魚(Danio rerio)和綠河鲀(Tetraodon nigrovirdis)基因組IFN-γ的附近發現另一個IFN-γ同源基因, 即IFN-γrel (IFN-γ related gene), 隨后, 從斑點叉尾(Ictalurus punctatus)[7]、鯉(Cyprinus carpio)[8]、金魚(Carassius auratus auratus)[9]和草魚(Ctenopharyngodon idellus)[10,11]等魚類克隆了該基因。研究發現該兩個IFN-γ基因均為4個外顯子/3個內含子結構, 其氨基酸序列的C-端都含有一段保守的IFN-γ特征基序, 然而, IFN-γ的C-端有1個NLS(由4個精氨酸或賴氨酸組成), 而IFN-γrel則無。近年, Shibasaki等[12]在鯽(Carassius auratus langsdorfi)和金魚中再克隆出一個IFN-γrel基因, 并提出根據其氨基酸序列的C端是否具有NLS將鯉科魚類IFN-γrel分為兩類, 即IFN-γrel1的C端有一段富含堿性氨基酸的NLS, 在金魚和鯽中均為“KHHHR”, 而IFN-γrel2則缺乏該NLS。根據該分類特征, 目前已發現的斑馬魚和草魚IFN-γrel均屬于IFN-γrel1, 而鯉IFN-γrel則屬于IFN-γrel2。除綠河鲀外, 目前克隆到的魚類IFN-γrel基因均源自鯉形總目(1971年拉斯分類系統), 無法確定以上IFN-γrel的特征是魚類共有, 還是鯉形總目魚類所特有的。

IFN-γ與哺乳動物IFN-γ具有類似的功能。首先, 魚類IFN-γ參與魚類抗病毒反應: Poly I:C可顯著誘導虹鱒(Oncorhynchus mykiss)頭腎細胞、斑馬魚的鰓和腸、大西洋鱈(Gadus morhua)的頭腎以及大黃魚(Pseudosciaena crocea)多個組織(腎、脾臟、鰓、頭腎、皮膚和胸腺)中IFN-γ的轉錄表達[6,13—15];鯉科皰疹病毒三型(Cyprinid herpesvirus-3, CyHV-3)可顯著誘導鯉IFN-γ和IFN-γrel的轉錄表達[16]。重組表達的魚類IFN-γ可誘導抗病毒基因GBP (Guanylate-Binding Protein)、ISG (Interferon-Stimulated Gene)和Mx (Myxovirus-resistant)等的表達[17—19]; 鯽IFN-γ能夠顯著提高浸泡感染了CHNV (Crucian Carp Hematopoietic Necrosis Virus)鯽胸腺細胞(GTS9細胞)的存活率[12], 大西洋鮭IFN-γ具有抗IPNV (Infectious Pancreatic Necrosis Virus)和SAV3 (Salmonid Alphavirus 3)的生物活性[18]。其次, 魚類IFN-γ也參與抗菌免疫反應: LPS刺激可上調斑馬魚和鯉IFN-γrel基因的表達量[6,8], 鰻弧菌(Vibrio anguillarum)及哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)可分別誘導IFN-γ基因在大西洋鱈頭腎組織和大黃魚多個組織(肝臟、脾臟和頭腎等)中的表達[14,15]。與哺乳動物IFN-γ相似, 魚類IFN-γ也可激活巨噬細胞和誘導MHC II類分子表達[4,9,13,20,21]。此外, IFN-γ還可參與魚類抗寄生蟲感染的免疫過程: 刺激隱核蟲(Cryptocryon irritans)感染可誘導大黃魚脾臟、腸和皮膚等組織中IFN-γ的表達[15], 血液寄生的擬錐蟲(Trypanoplasma borreli)感染也可上調鯉IFN-γ的表達[8]。

日本鰻鱺(Anguilla japonica)屬于鰻鱺目鰻鱺科, 是重要的經濟魚類。在養殖過程中, 細菌、寄生蟲、真菌和病毒性疾病時有發生, 給鰻鱺養殖業帶來巨大的損失[22]。然而, 目前有關日本鰻鱺抗病基因相關研究仍較為薄弱。本文首先從日本鰻鱺中克隆獲得IFN-γ基因(命名AjIFN-γ), 并研究AjIFN-γ在健康狀態以及病原感染情況下的表達模式, 初步分析了AjIFN-γ 5′-調控區的轉錄調控活性。本研究將目前魚類IFN-γ的研究領域延伸到鰻鱺總目, 將有助于更全面地了解魚類IFN-γ的結構、功能以及進化過程, 同時, 為深入探索鰻鱺的免疫防御機制提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

日本鰻鱺[質量(203±53) g]購于福建省集美大學水產養殖基地, 養殖水溫為(28±2)℃。遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)為本實驗室保種。AJSB細胞株為本實驗室構建, 未發表。

1.2 AjIFN-γ cDNA全長序列的擴增

根據cDNA文庫中獲得的IFN-γEST序列, 設計引物AjIFN-gF/AjIFN-gR, 以日本鰻鱺腸道cDNA為模板, PCR擴增獲得AjIFN-γcDNA部分序列。反應體系(25 μL)為: HSTMReaction Mix 12.5 μL(HSTMkit, 東盛生物), ddH2O 9.25 μL, 上下游引物各1.0 μL, HSTMTaq聚合酶0.25 μL(HSTMkit, 東盛生物), 模板1.0 μL。反應程序為: 94℃ 3min; 94℃ 30s, 62℃30s, 72℃ 40s, 運行38個循環; 72℃ 10min。然后根據獲得的部分cDNA序列, 參照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech, 美國)試劑盒原理, 設計合成3′-和5′-RACE特異性引物(表 1)。以腸道3′-和5′-SMART cDNA為模板, 進行巢式PCR。拼接RACE獲得的3′-和5′-末端序列與cDNA部分序列, 得到AjIFN-γ基因的cDNA全長序列。再根據拼接獲得的cDNA全長序列, 在UTR區設計引物(表1), 通過PCR驗證拼接的cDNA全長序列。PCR產物經電泳、回收、連接、轉化后將陽性克隆子送測序, 具體操作參照本課題組前期研究[23]。

1.3 AjIFN-γ基因序列生物信息學分析

利用NCBI網站中的Blast (http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi)進行序列比對, 使用Primer Premier 6軟件設計引物, 利用ExPASy的翻譯工具(http:// web.expasy.org/translate/)獲得對應的氨基酸序列, ExPASy (http://web.expasy.org/compute_pi/)預測蛋白分子量和pI值, 用SignalP 4.1 Server程序(http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析信號肽, 使用NetNGlyc 1.0程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/ NetNGlyc/)預測潛在的N-糖基化位點, 分別使用PSIPRED程序(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)和Phyre2程序(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/)預測蛋白的二級和三級結構。用ClastalW進行氨基酸序列多重比對; 使用MEGA 6.0中的鄰接法構建系統進化樹, Bootstrap置換1000次。

1.4 AjIFN-γ的表達模式分析

遲緩愛德華氏菌菌液制備: 取遲緩愛德華氏菌菌株劃線于LB瓊脂平板, 37℃培養16h, 挑取單克隆于1 mL LB液體培養基中, 37℃, 180 r/min培養4h。取100 μL菌液按1：100 (體積比)加入LB液體培養基, 37℃, 180 r/min培養至菌液A600達到0.5—0.7時, 收菌。取500 μL菌液, 梯度稀釋后各取100 μL涂布在LB瓊脂平板上, 37℃培養16h后計數菌落單位, 推算原菌液的濃度, 用PBS緩沖液洗滌并稀釋至使用濃度。

正常養殖鰻鱺不同組織中的表達差異: 采集健康日本鰻鱺(黑仔鰻)血液、鰓、心臟、肝臟、腸、胃、脾臟、頭腎、體腎、性腺、鰾和皮膚共12個組織/器官, 使用Lightcycler 480 SYBR Green I試劑盒(Roche, 德國)在Ligthcycler 480 II PCR儀(Roche,德國)上, 參照Wang等[24]方法進行實時熒光定量PCR, 研究AjIFN-γ在不同組織中的轉錄表達量差異。β-actin和AjIFN-γ的定量引物的熒光信號采集溫度分別為80℃、82℃和76℃。通過Excel工具計算AjIFN-γ與β-actin的拷貝數比值, 以確定AjIFN-γ在mRNA水平相對β-actin的表達量, 使用DPS 7.0數據處理系統進行統計分析, 使用GraphPad Prism 6.0軟件繪圖。

不同免疫物刺激后的表達差異: 實驗設PBS對照組、Poly I:C刺激組(1 mg/100 g魚, Sigma)和遲緩愛德華氏菌刺激組(2×107cfu/100 g魚), 免疫方法是腹腔注射。在注射后8h、16h、24h和72h分別采集脾臟、鰓、頭腎及體腎, 每個時間點、每條魚的每個組織作為單獨樣品, 進行實時熒光定量PCR檢測。定量數據經β-actin校正后, 以相應時間點、相同組織的PBS對照組中靶基因的表達量為基準計算AjIFN-γ相對表達量的倍數變化。結果用Excel軟件進行計算, 用單因素變量方差分析法(ANOVA)分析刺激組與PBS對照組之間的表達差異的顯著性。

1.5 AjIFN-γ基因啟動子活性分析

根據日本鰻鱺基因組數據設計引物AjIFN-γ ProF/AjIFN-γProR, 以日本鰻鱺肌肉基因組為模板,PCR擴增獲得AjIFN-γ基因上游約2000 bp的調控序列。利用TSSG程序(http://linux1.softberry.com)預測其啟動子轉錄起始位點(Transcriptional Start Site, TSS)及TATA-box。其調控區的轉錄因子結合位點(Transcription Factor Binding Site, TFBS)的預測利用Alibaba 2程序(http://www.gene-regulation.com/ pub/programs/alibaba2/)和PAPIA程序(http://mbs. cbrc.jp/papia/)。

表 1 本文中所用引物序列Tab. 1 Primers used in the present study

根據克隆的5′調控序列以及預測的TFBS, 設計5′調控區刪節引物(表 1)。上、下游引物5′-端分別添加限制性內切酶MluⅠ和Bgl Ⅱ的酶切位點。以pMD19-T-AjIFN-gPro質粒作為模板, PCR擴增系列5′調控區刪節片段: P1 (–1400/+136)、P2 (–1252/+ 136)、P3 (–1062/+136)、P4 (–814/+136)、P5 (–543/+ 136)和P6 (–240/+136), 經限制性內切酶MluⅠ和BglⅡ酶切后, 連接至pGL3-basic載體(Promega, 美國),構建刪節突變體質粒。使用E.Z.N.A Endo-Free Plasmid DNA Mini Kit (Omega, 美國)提取相應質粒并測序驗證。

將AjIFN-γ基因5′調控區刪節突變體質粒轉染AJSB細胞, 具體操作如下: 將AJSB細胞(1.5×105cell/mL)接種到24孔細胞培養板中, 28℃培養48h至貼壁后,使用Lipofectamine 3000 (Invitrogen, 美國)進行轉染。每孔加入相應刪節突變體質粒0.5 μg和內參質粒pRL-TK (Promega, 美國)0.005 μg, 對照組轉染pGL3-basic質粒和pRL-TK質粒。轉染24h后, 用Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, 美國)檢測細胞裂解產物中的螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性。每組設3個重復。

2 結果

2.1 AjIFN-γ基因序列分析

根據EST序列設計引物, PCR擴增獲得cDNA序列, 再設計RACE引物, 經克隆、拼接和PCR驗證, 獲得AjIFN-γ的全長cDNA序列, GenBank登錄號為KU950362。AjIFN-γcDNA序列全長共912 bp, 開放閱讀框546 bp, 可編碼181個氨基酸(aa)的多肽, 預測該多肽N-端21 aa為信號肽。同時, 本實驗室還克隆了日本鰻鱺IFN-γrel (AjIFN-γrel)的cDNA序列(登錄號為KU950363), AjIFN-γrelcDNA全長為888 bp,開放閱讀框為483 bp可編碼160個aa的多肽, 比AjIFN-γ少21 aa, 其N-端23 aa為信號肽。AjIFN-γ cDNA的3′-UTR含有IFN-γ序列中普遍存在的mRNA不穩定基序(ATTTA)3個, 而在AjIFN-γrelcDNA的3′-UTR中沒有發現該基序。AjIFN-γ的C-端具有IFN-γ特征基序“T-Q-R-K-A-I-R-D-L-L-T-V”和1個NLS (RRRR), 然而, AjIFN-γrel僅具有部分IFN-γ特征基序, 并且與其他魚類的IFN-γrel相似, AjIFN-γrel的C-端也缺乏NLS以及鯉形總目魚類IFN-γrel中保守的“CTC”基序(圖 1)。

氨基酸序列同源性分析顯示, AjIFN-γ與AjIFN-γrel的一致性和相似性分別為38.88%和50.66%。PSIPRED程序預測結果顯示, AjIFN-γ的成熟肽二級結構由6個α-螺旋組成, 而AjIFN-γrel僅有4個α-螺旋, 其位置與AjIFN-γ前4個螺旋分別對應(圖 1)。進一步使用Phyre2程序構建了AjIFN-γ和AjIFN-γrel成熟肽的三級結構模型。結果顯示, AjIFN-γ由6個長短不一的α-螺旋反向平行構成(圖 2A), 而AjIFN-γrel則僅由4個α-螺旋反向平行構成(圖 2B)。

2.2 脊椎動物IFN-γ氨基酸序列多重比對

選取人類、小鼠、雞的IFN-γ, 以及硬骨魚類IFN-γ和IFN-γrel的氨基酸全長序列進行多重比對。結果顯示, 雖然脊椎動物IFN-γ氨基酸序列一致性較低,但是, 都具有特征基序“[I/V]-Q-X-[K/Q]-A-X2-E-[L/F]-X2-[I/V]”和由4個連續精氨酸或賴氨酸組成的NLS; 魚類IFN-γrel均缺乏該類NLS, 此外, 鯉形總目魚類IFN-γrel氨基酸序列的近1/2處有一個“CTC”基序, 而AjIFN-γrel和綠河鲀IFN-γrel則無(圖 1)。N-糖基化位點預測結果顯示, 爪蟾和大西洋鱈均缺少N-糖基化位點, 而褐牙鲆有3個, 其他IFN-γ和IFN-γrel均具有1—2個, 其中AjIFN-γ和AjIFN-γrel均具有2個糖基化位點(圖 1、表 2)。

2.3 AjIFN-γ同源性分析

為了研究日本鰻鱺II型IFN與其他脊椎動物II型IFN的同源性, 使用ClustalW軟件和SIAS程序(http://imed.med.ucm.es/Tools/sias.html)分析其氨基酸成熟肽序列的一致性和相似性。AjIFN-γ與其他脊椎動物IFN-γ的一致性均相對稍高于AjIFN-γrel: AjIFN-γ與高等脊椎動物IFN-γ的一致性為14.3%—20%, 而AjIFN-γrel僅為9%—17.5%; AjIFN-γ與其他魚類IFN-γ的一致性為20%—30.7%, AjIFN-γrel為16.8%—27%。除斑點叉尾和綠河鲀外, AjIFN-γrel與其他魚類IFN-γrel的相似性高于其與同種魚類IFN-γ的相似性。鲇形目和鮭形目魚類IFN-γ與日本鰻鱺II型IFN的同源性相對高于其他魚類:在所比較的魚類IFN-γ中, 與AjIFN-γ的同源性最高者為大西洋鮭, 與AjIFN-γrel同源性最高的是斑點叉尾; 與AjIFN-γ和AjIFN-γrel的同源性最低的均為大黃魚IFN-γ (表 2)。

2.4 AjIFN-γ基因結構分析

圖 1 氨基酸序列多重比對Fig. 1 Multiple alignment of deduced amino acid sequence of IFN-γs and IFN-γrels“–”表示空缺; “*”表示一致, “.”或“:”表示相似; 粗體為NLS; 灰底黑字為IFN-γ特征基序, 灰色名稱為IFN-γrel; 下劃線為預測的α-螺旋;灰底白字為信號肽序列; 方框內為預測的N-糖基化位點; 黑色背景為鯉科魚類中保守的“CTC”基序”Dashes (–) indicate gaps in the alignment, asterisks (*) indicate identity and dots (or :) indicate similarity. Nuclear localization signals are in bold and the conserved IFN-γ family signatures are depicted in dark grey. Sequences underlined represent the predicted α-helices. The predicted signal peptides are in italic. The predicted N-glycosylation sites are showed in boxes. The conserved “CTC” motif is shaded in black

圖 2 AjIFN-γ(A)和AjIFN-γrel(B)成熟肽的三級結構Fig. 2 3D structures for AjIFN-γ (A) and AjIFN-γrel (B) mature peptides

表 2 日本鰻鱺Ⅱ型IFN與其他脊椎動物Ⅱ型IFN的同源性Tab. 2 Protein homology between type Ⅱ IFN from Japanese eel and other vetebrates

使用Spidey程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ spidey/)比對AjIFN-γ和AjIFN-γrel的cDNA序列和基因組序列, 獲得其基因結構; 同時, 從Ensembl數據庫中提取人類、小鼠、雞、爪蟾、斑馬魚以及青鳉的IFN-γ以及斑馬魚和草魚IFN-γrel的基因數據;使用GeneMaper 2.5 繪制基因結構圖。結果顯示,雖然不同物種間IFN-γ的總核苷酸數量差異較大(817—5601 bp), 但是其基因結構相似, 都由4個外顯子和3個內含子組成, 所有內含子均為0相位, 4個外顯子的相對大小比較保守, 最小的均為外顯子2,最大的均為外顯子3 (圖 3A), 表明IFN-γ的基因結構在進化過程中較為保守。

斑馬魚和草魚的IFN-γrel與脊椎動物IFN-γ的基因結構相似, 也是由4個外顯子和3個內含子組成,最小和最大的外顯子也分別是外顯子2和外顯子3,但是, 其外顯子1都大于IFN-γ的外顯子1, 而外顯子4均小于IFN-γ外顯子4。值得注意的是, 與斑馬魚和草魚IFN-γrel不同, AjIFN-γrel的基因結構僅由3個外顯子和2個內含子組成, 且外顯子3的大小約為其他物種的IFN-γ或IFN-γrel的外顯子3和外顯子4的大小之和(圖 3B)。

2.5 AjIFN-γ基因簇基因共線性分析

低等脊椎動物與哺乳動物的染色體存在共線性, 許多細胞因子基因在不同動物染色體上的位置相對保守[5,25,26]。同時, 由于魚類細胞因子與哺乳動物的同源基因間同源性低, 因此, 染色體共線性分析已成為尋找魚類細胞因子基因的常用方法之一。利用該方法, 已在魚類中發現了許多細胞因子基因, 包括IL-10、IL-22、IFN-γ、IL-2和IL-21等[5,6,27—29]。本研究將克隆獲得的AjIFN-γ和AjIFN-γrel基因cDNA序列在日本鰻鱺基因組數據(Gen-Bank登錄號: AVPY00000000.1)中進行比對, 發現AjIFN-γ位于日本鰻鱺基因組數據庫Scoffold_1498,運用FGENESH網站(http://www.softberry.com/berry. phtml)對Scoffold_1498進行基因預測, 發現6個基因, 其中前5個分別為MDM1、IL-22、IL-26、IFN-γ和IFN-γrel, 第6個為假定基因。我們選擇了人類、小鼠、爪蟾、斑馬魚和綠河鲀與日本鰻鱺的IFN-γ基因簇進行共線性分析, 結果顯示, 與人類、非洲爪蟾和斑馬魚一致, AjIFN-γ上游基因主要包括MDM1、IL-22、IL-26, 但是在非洲爪蟾IL-22和MDM1之間插入了一個MDM4基因, 而在綠河鲀的IL-22與MDM1基因之間則插入了一個RAP1B基因,該基因在人類和小鼠中均位于MDM1基因的上游。小鼠IFN-γ上游有兩個IL-22基因(IL-22a和IL-22b),但是其IL-26基因為假基因, 在其序列中間插入了一段由長散布核元件(Long Interspersed Nuclear Elements, LINE)和長末端重復序列(Long Terminal Re-peat, LTR)組成的(LTR)-LINE-LTR結構[30]。與其他脊椎動物相比, 魚類IFN-γ的上游額外增加一個IFN-γrel基因, 因此, 認為該基因應為魚類所特有。除了小鼠IL-22b和非洲爪蟾MDM1以外, IFN-γ基因簇上各基因的轉錄方向均相同(圖 4)。

圖 3 IFN-γ (A)和IFN-γrel (B)基因結構比較分析Fig. 3 Comparative analysis of IFN-γ (A) and IFN-γrel (B) genomic structures線條表示內含子, 斜線框表示外顯子, 數字表示內含子或外顯子的堿基數; 基因結構數據來源于Ensembl基因組數據庫Exons are showed as slash boxes and introns are presented as lines. Numbers above boxes and below lines indicate the size of exons and introns, respectively. The data are derived from Ensembl database

2.6 AjIFN-γ在魚體中的組織分布

采用實時熒光定量方法檢測AjIFN-γ在日本鰻鱺皮膚、鰓、腸、胃、肝臟、脾臟、心臟、鰾、頭腎、體腎、性腺和血液共12個組織/器官中的表達量。結果表明, AjIFN-γ在健康日本鰻鱺的所有檢測組織中均有不同程度的低水平轉錄表達, 表達量約為β-actin的1‰, 其中, AjIFN-γ肝臟中的轉錄表達量最高, 其次是皮膚和頭腎, 在胃、性腺和鰾中的轉錄表達量最低(圖 5)。

2.7 Poly I:C刺激能誘導AjIFN-γ基因的轉錄表達

為了研究Poly I:C刺激對重要免疫器官中AjIFN-γ轉錄表達的誘導作用, 本研究對健康日本鰻鱺腹腔注射Poly I:C, 注射后8h、16h、24h以及72h, 采用實時熒光定量的方法分別檢測AjIFN-γ在鰓、脾臟、頭腎和體腎中的表達量, 對照組注射等體積PBS。結果顯示, Poly I:C能夠顯著上調AjIFN-γ基因的轉錄表達水平(P＜0.05)。除脾臟以外, 其他3個組織中AjIFN-γ基因的轉錄表達量均在Poly I:C刺激后8h極顯著上調(P＜0.01)。在鰓和體腎中, 表達量在16h達到最高, 而后下降, 在24h仍顯著高于對照組, 72h恢復到與對照組相似水平。在脾臟中, AjIFN-γ基因的轉錄表達量在刺激后各個時間點均無顯著變化(P＞0.05)(圖 6)。

2.8 遲緩愛德華氏菌感染能誘導AjIFN-γ基因的轉錄表達

遲緩愛德華氏菌是日本鰻鱺常見的致病菌之一, 本研究檢測了健康日本鰻鱺腹腔注射遲緩愛德華氏菌后8h、16h、24h和72h, AjIFN-γ在鰓、脾臟、頭腎和體腎中的轉錄表達量, 對照組注射等體積PBS。結果顯示, 遲緩愛德華氏菌感染可顯著誘導AjIFN-γ在鰓、頭腎、體腎和脾臟中的表達(P＜0.05)。在鰓、頭腎和體腎中, 遲緩愛德華氏菌感染8h后, AjIFN-γ的表達量先略為下調, 而后在16h顯著上調(P＜0.05), 在24h達到最高水平; 在體腎中, 刺激后72h, AjIFN-γ的表達量仍極顯著高于對照組(P＜0.001), 而在鰓和頭腎中則與對照組無差異; 在脾臟中, AjIFN-γ的表達量在8h、16h和24h均顯著下調(P＜0.05), 但是呈現逐步上升的趨勢, 在72h表達量達到最高, 且極顯著高于對照組(P＜0.001)(圖 7)。

2.9 AjIFN-γ基因啟動子區轉錄因子結合位點和刪節突變體活性分析

擴增日本鰻鱺AjIFN-γ基因5′-側翼區長為1536 bp的序列, 預測其轉錄起始位點(TSS)位于起始密碼子上游155 bp處, TATA-box位于TSS上游24 bp處; AjIFN-γ基因5′-側翼區的轉錄因子結合位點(TFBS)包括GATA-1 (GATA結合因子-1)、SRF(血清應答因子)、AP-1(激活蛋白-1)、IRF-1 (干擾素調節因子-1)、C/EBPβ (CCAAT增強子結合蛋白β)、NF-κB (核因子-κB)等(圖 8A)。

圖 4 AjIFN-γ基因座的基因共線性比較分析Fig. 4 Gene synteny analysis of the AjIFN-γ gene locus with that from human, mouse, zebrafish and Xenopus箭頭指示基因的轉錄方向, 方框內為基因名稱。“ψ”表示假基因Arrows indicate gene transcription orientation. ψ represents pseudo gene

為研究AjIFN-γ啟動子活性的調控序列, 以pGL3-basic載體, 構建了6個5′-端刪節片段的突變體質粒(P1—P6), 并分別轉染AJSB細胞, 測定各刪節突變體的相對熒光素酶活性。以pGL3-basic為對照組。結果顯示, 6個AjIFN-γ啟動子刪節突變體的相對活性都顯著高于pGL3-basic。P6(–240/+ 136)活性約為pGL3-basic的40倍; P3(–1062/+136)活性最高, 為pGL3-basic的157倍, 并且顯著高于P2(–1252/+136)和P4(–814/+136), 而P1、P2和P4之間相對活性無顯著差異, 但其活性顯著高于pGL3-basic, 為后者的48—68倍(圖 8B)。

3 討論

哺乳動物、鳥類和兩棲類的Ⅱ型IFN成員均只有1個, 而魚類的Ⅱ型IFN包括IFN-γ和IFN-γrel。本研究克隆獲得了日本鰻鱺IFN-γ基因(AjIFN-γ)的cDNA序列, 并與本實驗室已經克隆的日本鰻鱺IFN-γrel的cDNA序列進行了比較分析, 同時, 對AjIFN-γ和AjIFN-γrel進行了基因結構和共線性分析。此外, 研究了AjIFN-γ在健康日本鰻鱺中的組織分布及Poly I:C誘導和遲緩愛德華氏菌感染誘導其轉錄表達的效應, 初步揭示其在抗菌和抗病毒方面的作用。此外, 我們還克隆了AjIFN-γ的5′調控區序列,預測其中的TFBS, 并研究了其啟動子活性。

圖 5 健康日本鰻鱺不同組織/器官中AjIFN-γ相對β-actin的表達量Fig. 5 Relative expressions of AjIFN-γ in various tissues of healthy Japanese eel relative to β-actin數值通過1000×(AjIFN-γ/β-actin)公式計算; 縱軸表示平均值±SEM, N=6; 相同字母表示沒有顯著性差異, P＞0.05The value is present by 1000×(AjIFN-γ/β-actin). Vertical bars represent mean±SEM, N=6. Same letter above the bars means no significant difference. P＞0.05

圖 6 腹腔注射Poly I:C后AjIFN-γ相對表達量Fig. 6 The relative expression of AjIFN-γ in various tissues after intraperitoneal injection with Poly I:CPoly I:C刺激后8h、16h、24h、72h時, 采用real-time PCR分析不同組織中AjIFN-γ的轉錄本數量; 以每個組織中β-actin作為內參比; 縱軸表示平均值± SEM, N=6 (鰓16h組, N=5); *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001, t-test; 下同Real-time PCR was used to analyze the amount of AjIFN-γ transcript in different tissues at 8h, 16h, 24h, 72h after being stimulated by Poly I:C in vivo. Copies of β-actin in each tissue was used as an internal control for normalized different samples. Vertical bars represented the mean±SEM, N=6 (for gill at 16h, N=5) *P＜0.05, **P＜0.01 and ***P＜0.001, t-test; the same applies below

圖 7 腹腔注射E. tarda后AjIFN-γ的相對表達量Fig. 7 The relative expression of AjIFN-γ after intraperitoneal injection with E. tardaE. tarda 刺激后8h、16h、24h、72h時, 采用real-time PCR分析不同組織中AjIFN-γ的轉錄本數量Real-time PCR was used to analyze the amount of AjIFN-γ transcript in different tissues at 8h, 16h, 24h and 72h after being challenged by E. tardain in vivo

圖 8 AjIFN-γ啟動子刪節突變體的相對活性Fig. 8 Relative luciferase activities of promoter 5′-deletion mutants of AjIFN-γA. 用于構建AjIFN-γ啟動子5′-端刪節突變體的插入序列及其預測的轉錄因子結合位點示意圖; B. AjIFN-γ啟動子5′-端刪節突變體在AJSB細胞中的相對活性; 啟動子活性以經海腎熒光素酶活性校正的相對光度單位(RLU)表示A. Schematic diagram of the promoter deletion mutants in different length and the TFBSs on them; B. Relative luciferase activities of promoter 5′-deletion mutants of AjIFN-γ in AJSB cells

3.1 AjIFN-γ具有魚類Ⅱ型IFN的典型特征

雖然AjIFN-γ與其他物種IFN-γ的一致性較低,但是, 具有IFN-γ的典型特征, 包括特征基序“[I/V]-Q-X-[K/Q]-A-X2-E-[L/F]-X2-[I/V]”、C端保守的NLS (“RRRR”)以及6個α-螺旋構成的高級結構。迄今, 僅在魚類中發現了第二個Ⅱ型IFN, 即IFN-γrel,其最初被命名為IFN-γ1[6], 隨后, 發現其與魚類IFN-γ同源性不高, 且與高等脊椎動物IFN-γ的同源性低, 更名為IFN-γrel[31]。與其他魚類IFN-γrel相似,日本鰻鱺IFN-γrel也缺少魚類IFN-γ的C端高度保守的由連續4個賴氨酸或精氨酸組成的NLS (為區分,以下記為NLS1)。盡管有研究認為虹鱒IFN-γ缺失NLS1, 其生物活性受影響[13], 然而, Grayfer等[21]研究發現, 缺乏NLS1的重組金魚IFN-γrel, 仍然具有誘導單核細胞反應性氧中間物(ROI)的產生、激活巨噬細胞的吞噬作用、通過誘導iNOS基因的表達增加NO的產生、誘導前炎癥細胞因子和趨化因子的表達以及STAT1的磷酸化作用等生物活性。最近, Shibasaki等[12]在鯽和金魚中分別克隆到2個IFN-γrel, 部分魚類IFN-γrel的C端具有一個富含堿性氨基酸的NLS(記為NLS2, 在金魚和鯽中均為“KHHHR”), NLS2也能夠發揮核定位作用。此外,他們根據IFN-γrel中是否含有NLS2分為IFN-γrel1,主要包括鯉科魚類; 缺乏NLS2的IFN-γrel為IFN-γrel2。本實驗室克隆到的AjIFN-γrel與Shibasaki等[12]所描述的IFN-γrel2相似, 也缺少NLS2。此外, AjIFN-γrel和綠河鲀IFN-γrel均缺乏鯉形總目魚類中高度保守的“CTC”基序, 推測該基序只存在于鯉形總目魚類中。

3.2 AjIFN-γ主要參與日本鰻鱺的抗病毒免疫過程

早期采用半定量PCR方法, 在健康斑馬魚和虹鱒的多個組織中均未發現IFN-γ的轉錄表達[6,13],而斑點叉尾IFN-γ僅在頭腎和脾臟中檢測到一定的表達[7]。而采用靈敏度更高的熒光定量PCR方法后, 發現IFN-γ在健康魚體的不同組織中均有表達, 尤其是鰓和脾臟。此外, 金魚和南亞野鯪(Labeo rohita) IFN-γ在脾臟中的表達量均高于其他組織[9,32], 鯉IFN-γ在腸和鰓中的表達量最高[8], 大西洋鱈IFN-γ在鰓和脾臟中表達量最高[14]。本研究中AjIFN-γ在所檢測的12個組織中均低水平表達, 其表達模式與大黃魚IFN-γ相似, 主要在肝臟以及主要免疫組織(皮膚和頭腎)中表達, 暗示其可能參與機體的免疫過程。

與哺乳動物相似, 魚類IFN-γ參與機體的抗病毒反應。經Poly I:C誘導后, 虹鱒(頭腎白細胞、腎和脾臟)、斑馬魚(鰓和腸)、大西洋鱈(頭腎)、金魚(腎白細胞)IFN-γ的轉錄表達量均上調[6,9,13,14]。在鯉科皰疹病毒三型感染的每一個階段, 鯉IFN-γ和IFN-γrel的轉錄表達量均顯著上調[16]。Stolte等[8]發現鯉IFN-γrel主要由IgM+細胞產生, 表明其主要調節體液免疫[8,33]。在本研究中, Poly I:C刺激后, AjIFN-γ在鰓、頭腎和體腎中的表達量顯著上調, 尤其是體腎中, 上調約39倍, 而頭腎和體腎是硬骨魚類抗體產生的重要器官[34], 魚類鰓中也含有抗體分泌細胞[35,36]以及T淋巴細胞[37], 并且能高水平表達T淋巴細胞相關的基因[38,39], 推測AjIFN-γ也可能參與日本鰻鱺抗病毒的體液免疫和(或) T淋巴細胞介導的細胞免疫反應。

愛德華氏菌病是嚴重危害日本鰻鱺養殖的主要疾病之一, 流行范圍廣, 給日本、中國臺灣和大陸的養鰻業造成重大經濟損失[40]。有研究發現, 褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)重組IFN-γ可激活宿主的抗遲緩愛德華氏菌感染的免疫反應[41]。在本研究中, AjIFN-γ在鰓、頭腎和體腎中的轉錄表達量均在遲緩愛德華氏菌感染16h開始顯著上調, 24h表達水平達到最高, 而脾臟中在72h也顯著上調。該結果表明, AjIFN-γ可參與日本鰻鱺抵抗遲緩愛德華氏菌感染的免疫反應。

3.3 AjIFN-γ啟動子活性分析

哺乳動物IFN-γ的轉錄表達受一系列轉錄因子的調控, 尤其是NFAT、AP-1和NF-κB家族的轉錄因子[42—48]。AjIFN-γ的啟動子區存在AP-1、NF-κB、GATA-1、SRF、IRF-1、C/EBPβ等TFBS。對刪節突變體的啟動子活性的分析結果顯示, P6(–240/+ 136)的相對活性顯著高于pGL3-basic, 表明上游–240/+136區域中含有AjIFN-γ啟動子的關鍵轉錄調控元件, 可起始AjIFN-γ的轉錄, 該區域內含有我們所預測的TSS和TATA-box, 說明該TSS可能是AjIFN-γ轉錄起始的位置。此外, 研究結果還顯示, P3(–1062/+ 136)相對活性最高, 且顯著高于P2(–1252/+136)和P4(–814/+136), 說明在–1062/–814區域中可能存在提高AjIFN-γ轉錄活性的TFBS, 而在–1252/–1062區域可能含有抑制AjIFN-γ轉錄活性的TFBS。進一步分析發現–1062/–814區域中含有2個AP-1和1個SRF,–1252/–1062區域中包括AP-1、GATA-1和IRF-1,然而, 究竟是哪個TFBS正向調控或負向調控AjIFN-γ的轉錄表達, 有待進一步研究。值得一提的是, Lai等[49]研究發現, 在草魚腎臟細胞中過表達IRF-1可以提高Ⅰ型IFN的啟動子活性, 而有關IRF-1對Ⅱ型IFN啟動子活性的調控作用, 未見相關報道。

綜上所述, 本研究克隆獲得了日本鰻鱺IFN-γ基因, 命名為AjIFN-γ; 研究了AjIFN-γ在日本鰻鱺中的表達情況, 發現其在肝臟、皮膚和脾臟中的轉錄表達水平較高; 研究其對不同免疫刺激的響應, Poly I:C刺激和遲緩愛德華氏菌感染都能誘導AjIFN-γ的轉錄表達; 克隆并分析AjIFN-γ的上游調控區序列, 通過構建不同長度啟動子區刪節突變體并分析其啟動子活性, 發現其啟動子區–1062/–814區域可能存在AjIFN-γ的轉錄正調控元件。后續我們將通過體外重組表達獲得AjIFN-γ的重組蛋白, 對其免疫功能進行深入研究, 并繼續細化分析AjIFN-γ的啟動子區–1062/–814區域, 進一步研究其主要轉錄調控機制。

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CHARACTERIZATION, EXPRESSION PATTERN AND PROMOTER ACTIVITY ANALYSIS OF INTERFERON-GAMMA IN JAPANESE EEL, ANGUILLA JAPONICA

PENG Xi-Xia1, HUANG Bei1, DUAN Li-Peng1, LI Chun-Yan1, LIANG Ying1, NIE Pin1,2and HUANG Wen-Shu1,3,4
(1. College of Fisheries, Jimei University, Xiamen 361021, China; 2. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 3. Engineering Research Center of the Modern Technology for EelIndustry, Ministry of Education PRC, Xiamen 361021, China; 4. Fujian Collaborative Innovation Center for Development and Utilization of Marine Biological Resources, Xiamen 361005, China)

IFN-γ is a cytokine that is critical for innate and adaptive immunity against viral, some bacterial and protozoal infections. In this study, an interferon-γ gene, named AjIFN-γ, was cloned and characterized from Japanese eel, Anguilla japonica. The AjIFN-γ shared some common features with its vertebrate homologues including a 4-exon/3-intron gene structure, a typical IFN-γ characteristic motif and a predicted nuclear localization site in the predicted protein. AjIFN-γ mRNA could be detected in all the tested tissues from healthy Japanese eel with the highest in liver, followed by skin and head kidney by real-time RT-PCR. A significantly increased expression of AjIFN-γ could be found in gill, head kidney, trunk kidney and (or) spleen post intraperitoneal injection with Poly I:C or Edwardsiella tarda, which indicated a role in defense of Japanese eel against both viruses and bacteria. Furthermore, luciferase reporter assay demonstrated that the sequence from –240 bp to +136 bp in the 5′ flanking region of AjIFN-γ gene was essential for initiating the transcription of AjIFN-γ, and the sequence form –1062 bp to –814 bp may contain some positive transcriptional regulatory elements while the sequence from –1252 bp to –1062 bp may contain negative transcriptional regulatory elements. This study provided the basis for further investigation of the expanding functions of IFN-γ molecules in immunity and other physiological processes in teleost and other animals.

IFN-γ; Anguilla japonica; Transcriptional expression; Promoter

Q344+.1

A

1000-3207(2017)03-0589-14

10.7541/2017.76

2016-05-18;

2016-08-21

國家自然科學基金(31402329、31174238和U1205123); 福建省自然科學基金(2014J05042、2012J06008和JK2014026); 鰻鱺工程中心科研基金資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31402329, 31174238 and U1205123); the Natural Science Foundation of Fujian Province (2014J05042, 2012J06008 and JK2014026); a Fund from Engineering Research Center of the Modern Technology for Eel Industry]

彭喜霞(1990—), 女, 江西吉安人; 碩士; 主要研究方向為魚類免疫學。E-mail: pengxixia1990@163.com

聶品, E-mail: pinnie@ihb.ac.cn; 黃文樹, E-mail: wshuang@jmu.edu.cn