基于脂類代謝的DHFR—CHO細胞培養(yǎng)過程開發(fā)與優(yōu)化

蔣金龍　范里　譚文松

摘要：通過對抗體高產(chǎn)（HP）、低產(chǎn)（LP）2個細胞培養(yǎng)過程進行研究發(fā)現(xiàn)，2個過程中脂類代謝差異明顯。結(jié)果表明，HP中脂類干質(zhì)量遠大于LP過程，且其增速也較快，HP中最大脂類干質(zhì)量達到（83.70±0.04）×10^-9mg/cell，是LP的2.35倍；進一步通過細胞磷脂尼羅紅熒光染色檢測細胞磷脂含量發(fā)現(xiàn)，HP、LP細胞培養(yǎng)過程中細胞磷脂差異顯著；隨后對3種重要磷脂——磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰絲氨酸（Ps）的合成前體A（氯化膽堿）、B（乙醇胺）、C（絲氨酸）、D（胞苷）4種因子通過2水平全析因試驗設(shè)計進行分析，發(fā)現(xiàn)組分A對細胞生長、抗體表達影響極顯著（P<0.01）；最后通過正交試驗對培養(yǎng)基中組分A進行濃度優(yōu)化，以找出基礎(chǔ)培養(yǎng)基和流加培養(yǎng)基中組分A的最適濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中組分A最優(yōu)濃度為95.38 mg/L，流加培養(yǎng)基中最優(yōu)濃度為189 mg/L；最終活細胞密度對時間累積積分（IVCC）達到79.16×10⁹cells·d/L，提高了74.29%；抗體產(chǎn)量為2.04g/L，增加了1.83倍；抗體比生成速率為34.07 mg/（109 cells·d），提高了18.71%。基于脂類代謝分析，建立了高效經(jīng)濟的細胞培養(yǎng)過程，并為培養(yǎng)基的優(yōu)化提供了依據(jù)，可為后續(xù)大規(guī)模單克隆抗體工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：脂類；細胞生長；DHFR-CHO；單克隆抗體；中國倉鼠卵巢細胞

中圖分類號：S188；Q952.6 文獻標志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0032—04

隨著單克隆抗體藥物市場的迅速發(fā)展，以及對單克隆藥物要求越來越高，對于利用動物細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體藥物來說既是機遇又是挑戰(zhàn)。如何在保證細胞高密度培養(yǎng)的同時生產(chǎn)出高產(chǎn)量、高質(zhì)量的單克隆抗體，將成為細胞培養(yǎng)技術(shù)的重點研究課題。作為細胞培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，培養(yǎng)過程和培養(yǎng)基的開發(fā)、優(yōu)化尤為關(guān)鍵。脂類作為細胞膜、線粒體膜等構(gòu)成的生物膜系統(tǒng)的主要組成部分，對于保證細胞及亞細胞結(jié)構(gòu)的完整性和生物活性有著極其重要的作用，細胞正常運轉(zhuǎn)和存活的先決條件就是這些亞細胞結(jié)構(gòu)具有獨立的空間。抗體的合成、分泌需要線粒體提供合成原材料和能量，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)提供合成場所和相關(guān)酶，分泌則與高爾基體有關(guān)。Sakai等在研究脂對產(chǎn)hIFN-γ的CHO細胞在無血清培養(yǎng)基中產(chǎn)量的影響時發(fā)現(xiàn)，加入磷脂酸（磷脂合成前體）使重組蛋白hlFN-γ產(chǎn)量提高了2.4倍。

為此筆者通過檢測抗體產(chǎn)量差異顯著的高產(chǎn)（HP）、低產(chǎn)（LP）細胞培養(yǎng)過程中細胞脂類、細胞磷脂含量，進一步通過對幾種關(guān)鍵磷脂前體[A（氯化膽堿）、B（乙醇胺）、C（絲氨酸）、D（胞苷）]的2水平因子設(shè)計析因試驗，發(fā)現(xiàn)磷脂合成前體組分A對細胞生長、抗體表達有顯著影響。最后分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)基、流加培養(yǎng)基中設(shè)計4個添加濃度梯度進行正交試驗，考察了基礎(chǔ)培養(yǎng)基、流加培養(yǎng)中組分A濃度對細胞生長、抗體表達的影響，確定了基礎(chǔ)培養(yǎng)基、流加培養(yǎng)基中組分A的最佳添加濃度。基于脂類代謝的研究開發(fā)高效細胞培養(yǎng)過程，可為抗體的大規(guī)模生產(chǎn)、培養(yǎng)基優(yōu)化和工藝優(yōu)化提供有力的理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持，對于單克隆抗體工業(yè)化發(fā)展和其他動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)單克隆抗體藥物工業(yè)化具有重要意義。

1材料與方法

1.1細胞株

試驗所用細胞株為表達單克隆抗體的DHFR-CHO細胞株。

1.2培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：傳代、種子細胞培養(yǎng)基為商業(yè)無血清培養(yǎng)基Hycell（購自Thermo Scientific）；試驗所用培養(yǎng)基為筆者所在實驗室自主開發(fā)的無血清培養(yǎng)基XP1-CM15。使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基根據(jù)試驗要求配制。

流加培養(yǎng)基：采用筆者所在實驗室自主研發(fā)的無血清流加培養(yǎng)基，主要含有葡萄糖、維生素、氨基酸、磷酸鹽、金屬離子等物質(zhì)的濃縮液。

1.4.3細胞組成測定 細胞脂類含量、細胞干質(zhì)量均采用Xie等的方法測定。

1.4.4細胞磷脂測定 采用GENMED細胞磷脂尼羅紅（Nile）熒光染色試劑盒測定，收集100萬個細胞，1500 r/min離心5 min，棄上清，加入500μLPBS清洗2遍。具體操作參照說明書。

2結(jié)果與分析

2.1高產(chǎn)、低產(chǎn)細胞脂類、磷脂檢測

本試驗選取抗體產(chǎn)量差異較大的2個細胞培養(yǎng)過程進行檢測，其中抗體產(chǎn)量高的產(chǎn)量達到了1.59g/L，是抗體產(chǎn)量低的3倍。分別在培養(yǎng)3、5、7、9、10、12 d檢測抗體產(chǎn)量差異明顯的2個細胞培養(yǎng)過程中脂類干質(zhì)量。由圖1可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，HP、LP細胞脂類含量一直增加；HP脂類含量明顯高于LP，最高脂類含量是LP的2.35倍；在抗體合成階段，HP的脂類合成速率是LP的2.43倍。結(jié)果表明，在抗體合成差異明顯的細胞培養(yǎng)過程中，其細胞脂類含量差異明顯。

在HP、LP細胞培養(yǎng)過程中，通過細胞磷脂尼羅紅熒光染色試劑盒檢測細胞磷脂含量。由圖2可見，隨著培養(yǎng)時間增加，細胞磷脂含量一直增加，HP細胞磷脂含量明顯高于LP，其最大磷脂含量是LP的1.46倍；在抗體合成階段（從培養(yǎng)6 d到結(jié)束），HP磷脂合成速率是LP的1.32倍。說明在抗體合成差異明顯的細胞培養(yǎng)過程中，細胞磷脂合成差異明顯。

綜上可知，在抗體產(chǎn)量差異明顯的HP、LP細胞培養(yǎng)過程中，細胞脂類代謝（磷脂代謝）表現(xiàn)出明顯差異。Sakai等研究也發(fā)現(xiàn)，脂類物質(zhì)在細胞生長和抗體表達中有重要作用，如細胞磷脂可作為細胞信號分子介導(dǎo)調(diào)控多種細胞生長增殖，促進抗體表達分泌。推測磷脂在細胞生長、抗體表達中有顯著影響，因而進一步對3種重要磷脂的合成前體組分A（氯化膽堿）、B（乙醇胺）、C（絲氨酸）、D（胞苷）進行析因分析。

2.2 2水平因子設(shè)計試驗

試驗選取3種重要磷脂（磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸）合成前體A、B、C、D 4種試驗因子，采用高（1）、低（-1）2個水平濃度進行2水平全析因試驗設(shè)計，進行主效應(yīng)因子析因試驗。表1為2水平全析因試驗設(shè)計，以IVCC、抗體產(chǎn)量為響應(yīng)值。可以看出，4種因子對細胞生長的IVCC值影響差別不大，但對抗體產(chǎn)量的影響差異明顯。根據(jù)方差分析（表2）可知，組分A的P值<0.01，說明組分A為極顯著影響因子。圖3為2水平因子設(shè)計試驗殘差的正態(tài)分布。點越偏離圖中的線，說明影響效應(yīng)越顯著。可以看出，4種因子中只有組分A為顯著影響因子。

2.3組分A對細胞生長、抗體表達的影響及濃度優(yōu)化

通過在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（0～200 mg/L）、流加培養(yǎng)基（0～756 mg/L）中分別設(shè)計4個濃度兩兩正交來考察組分A對細胞生長、抗體表達的影響，并搜尋出組分A的最優(yōu)濃度。試驗設(shè)計見表3。

從表4、圖4可以看出，在培養(yǎng)0～10 d期間，細胞生長大致一樣；但在培養(yǎng)10、12 d的2 d內(nèi)，A₁（基礎(chǔ)培養(yǎng)基、流加培養(yǎng)基中均沒有添加組分A）細胞密度迅速下降，細胞大量死亡，從5.32×10⁶ cells/mL降低到0.26×10⁶ cells/mL，下降了95.11%。

除A₁外，在其余試驗中細胞生長差異不大，說明細胞前期生長可能對胞外組分A的需求不大或者不需要胞外組分A；但從培養(yǎng)10 d開始，由于組分A的缺失，導(dǎo)致細胞開始表現(xiàn)出不能正常生長增殖，因此對細胞后期生長維持來說，組分A是不可或缺的，此時必須有組分A的補充。

隨著組分A濃度的增加，細胞生長差異不大，但對抗體表達、抗體比生成速率卻有明顯的影響。從圖4中可以看出，抗體產(chǎn)量最高的是C₂處理（基礎(chǔ)培養(yǎng)基中組分A添加濃度為100 mg/L，流加培養(yǎng)基中組分A添加濃度為189 mg/L）。抗體產(chǎn)量高于1g/L的處理大部分集中在中間（B、C 2組），A組（除A₂、A₃處理外）、D2組產(chǎn)量較低，特別是在D組，其抗體產(chǎn)量普遍偏低，說明當組分A濃度不足或過高時，對細胞抗體表達是有抑制作用的。

通過計算分析，最終得出基礎(chǔ)培養(yǎng)基中組分A最優(yōu)濃度C_0pt=95.38 mg/L，流加培養(yǎng)中組分A最優(yōu)濃度C′_0pt=189 mg/L。

2.4組分A最優(yōu)濃度驗證

在2 L生物反應(yīng)器中對組分A的最優(yōu)濃度進行驗證，從圖5可以看出，在最優(yōu)濃度條件下，細胞最高活細胞密度達到7.16×10⁶ cells/mL，細胞后期維持也比較好，到培養(yǎng)結(jié)束時，活細胞密度仍有4.78×10⁶cells/mL，細胞活性仍在80%以上，細胞IVCC達到79.16×10⁹ cells·d/L。抗體表達非常理想，最高抗體產(chǎn)量達到2.04 g/L；抗體表達階段q_Antibody達到34.07 mg/（10⁹cells·d）。與之前流加培養(yǎng)基沒有添加組分A的反應(yīng)器細胞培養(yǎng)相比，細胞IVCC是其1.74倍，抗體產(chǎn)量是其2.83倍，q_Antibody是其1.19倍。

3結(jié)論

利用動物細胞培養(yǎng)技術(shù)大規(guī)模開發(fā)高產(chǎn)的單克隆抗體藥物，已經(jīng)成為當今生物制藥的主流，具有強勁的市場競爭力。但是抗體類藥物開發(fā)成本高、周期長，遠不能滿足日益增長的市場要求。基于細胞代謝研究，比較抗體表達差異顯著的2個細胞培養(yǎng)過程，分析培養(yǎng)過程中有顯著差異的物質(zhì)代謝，考察培養(yǎng)過程中脂類對細胞生長、抗體表達的影響并優(yōu)化培養(yǎng)基中脂類合成前體濃度。結(jié)果表明：（1）抗體表達差異顯著的2個細胞培養(yǎng)過程中，細胞脂類含量（磷脂含量）差異顯著，通過2水平全析因試驗，最終發(fā)現(xiàn)磷脂合成前體組分A對抗體表達具有顯著影響。（2）當培養(yǎng)基中缺乏組分A濃度，細胞生長受到較大影響，當培養(yǎng)至10 d時細胞密度急劇下降，死細胞大量增加；培養(yǎng)到12 d時，細胞成活率已降為50%以下；隨著組分A濃度的進一步增加，細胞生長所受影響不大。（3）適當提高組分A濃度對抗體表達具有明顯促進作用，當基礎(chǔ)培養(yǎng)組分A濃度為95.38 mg/L時，流加培養(yǎng)基中組分A添加濃度在189 mg/L時，IVCC提高了0.74倍，抗體產(chǎn)量提高了1.83倍。

本研究基于脂類代謝的研究，建立了高效的細胞培養(yǎng)過程，實現(xiàn)了培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的合理設(shè)計和濃度優(yōu)化，為細胞培養(yǎng)基的開發(fā)和優(yōu)化提供了一種新的方法和依據(jù)，對后續(xù)抗體類藥物大規(guī)模生產(chǎn)具有重要意義。