基于脂類代謝的DHFR—CHO細胞培養過程開發與優化

蔣金龍　范里　譚文松

摘要：通過對抗體高產（HP）、低產（LP）2個細胞培養過程進行研究發現，2個過程中脂類代謝差異明顯。結果表明，HP中脂類干質量遠大于LP過程，且其增速也較快，HP中最大脂類干質量達到（83.70±0.04）×10^-9mg/cell，是LP的2.35倍；進一步通過細胞磷脂尼羅紅熒光染色檢測細胞磷脂含量發現，HP、LP細胞培養過程中細胞磷脂差異顯著；隨后對3種重要磷脂——磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰絲氨酸（Ps）的合成前體A（氯化膽堿）、B（乙醇胺）、C（絲氨酸）、D（胞苷）4種因子通過2水平全析因試驗設計進行分析，發現組分A對細胞生長、抗體表達影響極顯著（P<0.01）；最后通過正交試驗對培養基中組分A進行濃度優化，以找出基礎培養基和流加培養基中組分A的最適濃度。結果發現，基礎培養基中組分A最優濃度為95.38 mg/L，流加培養基中最優濃度為189 mg/L；最終活細胞密度對時間累積積分（IVCC）達到79.16×10⁹cells·d/L，提高了74.29%；抗體產量為2.04g/L，增加了1.83倍；抗體比生成速率為34.07 mg/（109 cells·d），提高了18.71%。基于脂類代謝分析，建立了高效經濟的細胞培養過程，并為培養基的優化提供了依據，可為后續大規模單克隆抗體工業化生產奠定基礎。

關鍵詞：脂類；細胞生長；DHFR-CHO；單克隆抗體；中國倉鼠卵巢細胞

中圖分類號：S188；Q952.6 文獻標志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0032—04

隨著單克隆抗體藥物市場的迅速發展，以及對單克隆藥物要求越來越高，對于利用動物細胞培養技術生產單克隆抗體藥物來說既是機遇又是挑戰。如何在保證細胞高密度培養的同時生產出高產量、高質量的單克隆抗體，將成為細胞培養技術的重點研究課題。作為細胞培養的關鍵技術環節，培養過程和培養基的開發、優化尤為關鍵。脂類作為細胞膜、線粒體膜等構成的生物膜系統的主要組成部分，對于保證細胞及亞細胞結構的完整性和生物活性有著極其重要的作用，細胞正常運轉和存活的先決條件就是這些亞細胞結構具有獨立的空間。抗體的合成、分泌需要線粒體提供合成原材料和能量，內質網提供合成場所和相關酶，分泌則與高爾基體有關。Sakai等在研究脂對產hIFN-γ的CHO細胞在無血清培養基中產量的影響時發現，加入磷脂酸（磷脂合成前體）使重組蛋白hlFN-γ產量提高了2.4倍。

為此筆者通過檢測抗體產量差異顯著的高產（HP）、低產（LP）細胞培養過程中細胞脂類、細胞磷脂含量，進一步通過對幾種關鍵磷脂前體[A（氯化膽堿）、B（乙醇胺）、C（絲氨酸）、D（胞苷）]的2水平因子設計析因試驗，發現磷脂合成前體組分A對細胞生長、抗體表達有顯著影響。最后分別在基礎培養基、流加培養基中設計4個添加濃度梯度進行正交試驗，考察了基礎培養基、流加培養中組分A濃度對細胞生長、抗體表達的影響，確定了基礎培養基、流加培養基中組分A的最佳添加濃度。基于脂類代謝的研究開發高效細胞培養過程，可為抗體的大規模生產、培養基優化和工藝優化提供有力的理論基礎和數據支持，對于單克隆抗體工業化發展和其他動物細胞培養生產單克隆抗體藥物工業化具有重要意義。

1材料與方法

1.1細胞株

試驗所用細胞株為表達單克隆抗體的DHFR-CHO細胞株。

1.2培養基

基礎培養基：傳代、種子細胞培養基為商業無血清培養基Hycell（購自Thermo Scientific）；試驗所用培養基為筆者所在實驗室自主開發的無血清培養基XP1-CM15。使用的基礎培養基根據試驗要求配制。

流加培養基：采用筆者所在實驗室自主研發的無血清流加培養基，主要含有葡萄糖、維生素、氨基酸、磷酸鹽、金屬離子等物質的濃縮液。

1.4.3細胞組成測定 細胞脂類含量、細胞干質量均采用Xie等的方法測定。

1.4.4細胞磷脂測定 采用GENMED細胞磷脂尼羅紅（Nile）熒光染色試劑盒測定，收集100萬個細胞，1500 r/min離心5 min，棄上清，加入500μLPBS清洗2遍。具體操作參照說明書。

2結果與分析

2.1高產、低產細胞脂類、磷脂檢測

本試驗選取抗體產量差異較大的2個細胞培養過程進行檢測，其中抗體產量高的產量達到了1.59g/L，是抗體產量低的3倍。分別在培養3、5、7、9、10、12 d檢測抗體產量差異明顯的2個細胞培養過程中脂類干質量。由圖1可以看出，隨著培養時間的延長，HP、LP細胞脂類含量一直增加；HP脂類含量明顯高于LP，最高脂類含量是LP的2.35倍；在抗體合成階段，HP的脂類合成速率是LP的2.43倍。結果表明，在抗體合成差異明顯的細胞培養過程中，其細胞脂類含量差異明顯。

在HP、LP細胞培養過程中，通過細胞磷脂尼羅紅熒光染色試劑盒檢測細胞磷脂含量。由圖2可見，隨著培養時間增加，細胞磷脂含量一直增加，HP細胞磷脂含量明顯高于LP，其最大磷脂含量是LP的1.46倍；在抗體合成階段（從培養6 d到結束），HP磷脂合成速率是LP的1.32倍。說明在抗體合成差異明顯的細胞培養過程中，細胞磷脂合成差異明顯。

綜上可知，在抗體產量差異明顯的HP、LP細胞培養過程中，細胞脂類代謝（磷脂代謝）表現出明顯差異。Sakai等研究也發現，脂類物質在細胞生長和抗體表達中有重要作用，如細胞磷脂可作為細胞信號分子介導調控多種細胞生長增殖，促進抗體表達分泌。推測磷脂在細胞生長、抗體表達中有顯著影響，因而進一步對3種重要磷脂的合成前體組分A（氯化膽堿）、B（乙醇胺）、C（絲氨酸）、D（胞苷）進行析因分析。

2.2 2水平因子設計試驗

試驗選取3種重要磷脂（磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸）合成前體A、B、C、D 4種試驗因子，采用高（1）、低（-1）2個水平濃度進行2水平全析因試驗設計，進行主效應因子析因試驗。表1為2水平全析因試驗設計，以IVCC、抗體產量為響應值。可以看出，4種因子對細胞生長的IVCC值影響差別不大，但對抗體產量的影響差異明顯。根據方差分析（表2）可知，組分A的P值<0.01，說明組分A為極顯著影響因子。圖3為2水平因子設計試驗殘差的正態分布。點越偏離圖中的線，說明影響效應越顯著。可以看出，4種因子中只有組分A為顯著影響因子。

2.3組分A對細胞生長、抗體表達的影響及濃度優化

通過在基礎培養基（0～200 mg/L）、流加培養基（0～756 mg/L）中分別設計4個濃度兩兩正交來考察組分A對細胞生長、抗體表達的影響，并搜尋出組分A的最優濃度。試驗設計見表3。

從表4、圖4可以看出，在培養0～10 d期間，細胞生長大致一樣；但在培養10、12 d的2 d內，A₁（基礎培養基、流加培養基中均沒有添加組分A）細胞密度迅速下降，細胞大量死亡，從5.32×10⁶ cells/mL降低到0.26×10⁶ cells/mL，下降了95.11%。

除A₁外，在其余試驗中細胞生長差異不大，說明細胞前期生長可能對胞外組分A的需求不大或者不需要胞外組分A；但從培養10 d開始，由于組分A的缺失，導致細胞開始表現出不能正常生長增殖，因此對細胞后期生長維持來說，組分A是不可或缺的，此時必須有組分A的補充。

隨著組分A濃度的增加，細胞生長差異不大，但對抗體表達、抗體比生成速率卻有明顯的影響。從圖4中可以看出，抗體產量最高的是C₂處理（基礎培養基中組分A添加濃度為100 mg/L，流加培養基中組分A添加濃度為189 mg/L）。抗體產量高于1g/L的處理大部分集中在中間（B、C 2組），A組（除A₂、A₃處理外）、D2組產量較低，特別是在D組，其抗體產量普遍偏低，說明當組分A濃度不足或過高時，對細胞抗體表達是有抑制作用的。

通過計算分析，最終得出基礎培養基中組分A最優濃度C_0pt=95.38 mg/L，流加培養中組分A最優濃度C′_0pt=189 mg/L。

2.4組分A最優濃度驗證

在2 L生物反應器中對組分A的最優濃度進行驗證，從圖5可以看出，在最優濃度條件下，細胞最高活細胞密度達到7.16×10⁶ cells/mL，細胞后期維持也比較好，到培養結束時，活細胞密度仍有4.78×10⁶cells/mL，細胞活性仍在80%以上，細胞IVCC達到79.16×10⁹ cells·d/L。抗體表達非常理想，最高抗體產量達到2.04 g/L；抗體表達階段q_Antibody達到34.07 mg/（10⁹cells·d）。與之前流加培養基沒有添加組分A的反應器細胞培養相比，細胞IVCC是其1.74倍，抗體產量是其2.83倍，q_Antibody是其1.19倍。

3結論

利用動物細胞培養技術大規模開發高產的單克隆抗體藥物，已經成為當今生物制藥的主流，具有強勁的市場競爭力。但是抗體類藥物開發成本高、周期長，遠不能滿足日益增長的市場要求。基于細胞代謝研究，比較抗體表達差異顯著的2個細胞培養過程，分析培養過程中有顯著差異的物質代謝，考察培養過程中脂類對細胞生長、抗體表達的影響并優化培養基中脂類合成前體濃度。結果表明：（1）抗體表達差異顯著的2個細胞培養過程中，細胞脂類含量（磷脂含量）差異顯著，通過2水平全析因試驗，最終發現磷脂合成前體組分A對抗體表達具有顯著影響。（2）當培養基中缺乏組分A濃度，細胞生長受到較大影響，當培養至10 d時細胞密度急劇下降，死細胞大量增加；培養到12 d時，細胞成活率已降為50%以下；隨著組分A濃度的進一步增加，細胞生長所受影響不大。（3）適當提高組分A濃度對抗體表達具有明顯促進作用，當基礎培養組分A濃度為95.38 mg/L時，流加培養基中組分A添加濃度在189 mg/L時，IVCC提高了0.74倍，抗體產量提高了1.83倍。

本研究基于脂類代謝的研究，建立了高效的細胞培養過程，實現了培養基營養成分的合理設計和濃度優化，為細胞培養基的開發和優化提供了一種新的方法和依據，對后續抗體類藥物大規模生產具有重要意義。