加利福尼亞兔和新西蘭兔UCP1 基因第5外顯子多態性和生物信息學研究

李維　林家棟　劉若余　謝海強　李思　杜雪琴　肖超能

摘要：本試驗以加利福尼亞兔和新西蘭兔為研究對象，分別用磁珠法動物基因組DNA抽提試劑盒提取新西蘭兔和加利福尼亞兔的DNA，通過構建DNA池，擴增UCP1基因的第5外顯子及第4內含子部分序列。擴增產物進行雙向測序，利用DNAStar和BLAST分析測序結果。結果發現：在加利福尼亞兔中沒有發現SNP位點，在新西蘭兔中有4個多態性位點，分別為G743T、A744G、C819A和G849T，其中G743T為同義突變，A744G為錯義突變，導致編碼的蘇氨酸（Thr）變為丙氨酸（Ala）；C819A、G849T突變位點位于內含子區。多態位點的出現對UCP1基因的RNA二級結構產生的影響表現在其最小自由能由-1.93 MJ/mol變為-1.932 MJ/mol，同時SNPs位點對UCP1基因蛋白結構也有一定影響。

關鍵詞：UCPl基因；新西蘭兔；加利福尼亞兔；SNPs；RNA二級結構

中圖分類號：S829.12 文獻標志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0041—03

解偶聯蛋白（uneouplingprotein，UCPs）是褐色脂肪細胞線粒體內膜上存在的一種質子轉運蛋白，它存在于動物的各組織中，在能量平衡、維持體溫、機體產熱和代謝等方面都起著巨大的作用。比如，它激活后可以產生質子電化學梯度降低，使呼吸鏈與ATP（三磷酸腺苷）合成過程解耦聯，使能量以熱的形式釋放；UCP1基因參與機體能量代謝，對機體能量平衡涉及的食物轉化效率、靜止代謝率和體重肥胖等性狀具有明顯的效應，對肌肉生長和品質的改良作用重大。目前，這個家族的5種蛋白質在魚、禽類、哺乳動物甚至在人類的不同組織線粒體的內膜上都已發現。其中，UCP1是最早發現的成員。

UCP1是褐色脂肪組織（brown adipose tissue，BAT）中表達的標記基因，它具有解離氧化磷酸化耦聯功能，如機體通過在線粒體中產生能量，三羧酸循環產生的還原當量通過電子將能量釋放，使H⁺從線粒體基質轉移至內膜面，形成1個跨線粒體內膜的質子電化學梯度，當線粒體的ATP合酶將H⁺從內膜面順梯度運回至基質面時，其能量可推動二磷酸腺苷與磷酸結合，促使生成ATP。UCP1基因的表達增加可能是受到去甲腎上腺素促進，使其與G偶聯蛋白相關的環磷酸腺苷合成，后者又可使蛋白激酶激活，蛋白激酶作用的靶蛋白包括激素敏感性脂肪酶，這種酶一旦被磷酸化激活就可以抑制三酰甘油的貯存，使脂肪分解，非脂化脂肪酸增加，促進產熱作用。此外，UCP1表達增加還有可能受腎上腺素和甲狀腺素等的刺激，從而增加棕色脂肪組織所消耗脂肪酸的活性，因此UCPl被認為是2型糖尿病和抵抗肥胖的重要基因。

Clark等發現，UCP1基因的表達水平對羔羊出生后的成活率起著重大作用。Bassett等發現，UCP1基因的表達對初生羔羊BAT的含量影響重大。然而對兔線粒體中UCP1基因方面的研究很少，本試驗以加利福尼亞兔和新西蘭兔構建其DNA池，對UCP1基因第5外顯子及第4內含子部分序列進行擴增，BLAST分析其測序結果篩選多態位點，由DNAStar軟件進行序列拼接、校正，并預測其對RNA結構影響和等位基因頻率估算。

1材料與方法

1.1樣品的來源

從貴州貴陽白云牛場大林農牧專業合作社種兔場和貴州貴陽修文盛鑫兔業開發有限公司種兔場采取加利福尼亞兔的組織樣48個和新西蘭兔組織樣48個，將采取的樣品放在已編好序號的自封袋中于-20℃冰箱中保存。

1.2構建DNA池和引物設計、合成

利用磁珠法動物基因組（組織）DNA抽提試劑盒提取DNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提的DNA，取5μL構建DNA池。以兔UCPl基因（其GenBank登錄號為：NC_013683.1）DNA序列利用Primer-BLAST設計1對引物來擴增UCPl基因第5外顯子和第4內含子的部分序列，將所設計的引物送往生工生物工程（上海）股份有限公司合成。物序列為F：GAGGTAAGTCCATCCCCACG，R：ACTCTTCTA-ACGATGTAGTGTC；退火溫度為59℃；目的片段大小為809 bp。

1.3 DNA的擴增和序列的分析

反應體系為25μL：2×Taq PCR Master Mix試劑12.5μL，基因組DNA 2.5μL，三蒸水7μL，上、下游引物10 pmol/μL各1.5μL。PCR擴增條件為：94℃預變性5 min；95℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環；72℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，并用凝膠成像系統觀察結果，最后拍照保存。

將擴增的產物送往立菲生物技術有限公司進行雙向測序。用DNAStar軟件校正測序結果，通過BLAST軟件對SNPs進行確定。

1.4測量峰高及等位基因頻率估算

利用MWSnap軟件對SNP位點等位基因的相應峰高進行測量，可依據如下公式f_i=h_i/（h₁+h₂），i=1，2，對等位基因頻率進行估算。f_i表示SNP位點某等位基因頻率，h₁表示SNP等位基因1峰的高度，h₂表示SNP等位基因2峰的高度。

1.5 RNA二級結構預測和蛋白質二級結構預測

通過在線預測軟件：http：∥rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi，對UCPl基因突變前后不同DNA序列進行RNA二級結構變化的預測，通過蛋白質二級結構在線預測軟件：https：∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html，對UCPl基因突變前后不同蛋白氨基酸序列進行蛋白質二級結構預測。

2結果與分析

2.1 PCR產物擴增

設計1對引物分別擴增加利福尼亞兔和新西蘭兔的UCPl基因第5外顯子及第4內含子部分序列。PCR擴增（圖1）后送往立菲生物技術有限公司進行雙向測序，BLAST分析共發現4個SNPs（圖2）。NCBI中SNP數據庫尚無該基因SNP信息，本試驗所篩查的SNPs均為新發現多態性位點，以UCP1基因第1外顯子第1位為+1位，SNPs位點分別為G743T、A744G、C819A、G849T，其中G743T為同義突變，A744G為錯義突變，導致編碼的蘇氨酸（Thr）變為丙氨酸（Ala）；C819A、G849T突變位點位于內含子區。

2.2估算SNPs等位基因頻率

通過MWSnap軟件對加利福尼亞兔和新西蘭兔SNPs等位基因峰高進行測量，根據公式估算4個SNPs位點等位基因頻率（表1）。由表1可知，內含子C819A和外顯子A744G在加利福尼亞兔和新西蘭兔中有較大差異，而外顯子G743T和內含子G849T在2種兔品種中差異較小，且加利福尼亞兔的4個位點基因頻率均高于新西蘭兔。

2.3預測UCP1基因的RNA二級結構

預測突變前后UCP1基因的RNA二級結構，結果表明，SNPs導致RNA二級結構發生改變，并導致RNA二級結構最小自由能發生變化，由-1.934 MJ/mol變為-1.932 MJ/mol，這不僅可能影響RNA二級結構的穩定性，還可能影響后續蛋白質翻譯過程（圖3）。

2.4突變前后UCP1蛋白二級的預測

通過在線SOPMA服務器預測新西蘭兔UCP1基因突變前后蛋白質二級結構變化，結果表明：突變前后α螺旋由109變到110，而B轉角由39變成40，延伸鏈由86變到83，自由卷曲由72變到73（表2）。

3討論

大量的研究表明，UCP基因家族與畜禽肉質關系密切。涂榮劍等對豬的UCP3基因研究發現，突變可能導致相應編碼氨基酸序列的改變，從而影響胴體、肉質性狀。韓瑞華等對牛的UCP3基因進行研究，發現UCP3基因不僅對肉牛胴體、肉質性狀等方面具有重要影響，而且對肉牛的育種工作具有指導作用。王濤等研究了UCP基因對雞肉質和豬肉質量的影響。肌內脂肪沉積是兔肉肉質標記輔助選擇中重要的選擇指標，篩選出對家兔肌內脂肪沉積有影響的基因有助于加快品種選育進程和提高家兔肉質性能。

目前對兔的UCP1基因多態性研究報道很少，本試驗以加利福尼亞兔和新西蘭兔為研究，對UCP1基因第5外顯子及第4內含子部分序列進行擴增，將擴增的PCR產物進行雙向測序，結果發現4個新的多態性位點：G743T、A744G、C819A、G849T，其中G743T為同義突變，A744G為錯義突變，導致編碼的蘇氨酸（Thr）變為丙氨酸（Ala）；C819A、G849T突變位點位于內含子區。比較加利福尼亞兔和新西蘭兔多態性位點等位基因頻率發現，內含子C819A和外顯子A744G在加利福尼亞兔和新西蘭兔中有較大差異，而外顯子G743T和內含子G849T在2個兔品種中差異較小，且加利福尼亞兔的4個位點基因頻率均高于新西蘭兔。

突變前后UCP1編碼蛋白二級結構也發生了改變，B轉角由39變成40，α螺旋由109變到110，延伸鏈由86變到83，自由卷曲由72變到73。突變前后UCPl基因RNA二級結構發生改變，其最小自由能由-1.934 MJ/mol變為-1.932 MJ/mol。這說明該位點可能影響2個品種的肌內脂肪沉積等肉質性狀差異，下一步工作將分析該多態性位點與兔肌內脂肪沉積性狀的關聯性，就UCP1基因對兔肉質性能的調控作進一步探究，從而為線粒體中相關基因對兔肌內脂肪沉積影響提供一定的依據。