PTSD大鼠海馬神經元凋亡的變化及規律

劉淘+佘靜+崔欣欣+何婷+耿菲

摘要：文章研究目的：觀察創傷后應激障礙（PTSD）大鼠海馬神經元凋亡的變化。方法：將成年Wistar大鼠20只分為對照組（n=10）和實驗組（n=10），適應性飼養兩周后，采用改良的單一連續應激方法（SPS&S）制備PTSD大鼠模型，TUNEL方法檢測海馬神經元凋亡變化。結果：PTSD大鼠海馬神經元的凋亡率高于對照組。結論：海馬區神經元的凋亡與PTSD的發病有關。

關鍵詞：PTSD大鼠模型；海馬神經元；神經元凋亡；TUNEL；病理改變 文獻標識碼：A

中圖分類號：R749 文章編號：1009-2374（2017）06-0083-02 DOI：10.13535/j.cnki.11-4406/n.2017.06.042

創傷后應激障礙（Posttraumatic Stress Disorder，PTSD）是由異常心理創傷導致的延遲出現的持續性精神障礙，是一種對創傷因素的異常精神反應，近年來其病率越來越高，給社會帶來了嚴重的經濟負擔。研究表明，PTSD患者出現海馬萎縮、體積縮小現象，其機制尚未闡明。我們推測海馬神經細胞凋亡可能是導致這種現象的原因之一，本研究給予大鼠SPS&S應激建立PTSD模型，利用TUNEL方法檢測PTSD發病中海馬神經元的凋亡情況，從而揭示創傷后應激障礙發病時海馬區結構及功能發生異常的原因，為研究創傷后應激障礙的發病機制提供有效的實驗依據。

1 動物

體重為23±20g的健康雄性Wistar大鼠20只，購于華北理工大學實驗動物中心，實驗動物合格證號：SCXK 京2009-0004。

2 主要試劑及儀器

TUNEL-POD細胞凋亡檢測試劑盒購于上海七海復泰生物科技有限公司，-20℃保存。DAB顯色液購于中杉金橋生物技術有限公司，4℃保存。組織包埋機、石蠟切片機、光學顯微鏡、防脫撥片、PBS緩沖液。

3 實驗方法

3.1 動物分組及模型建立

動物喂養于華北理工大學實驗動物中心，適應性飼養兩周后（溫度22℃～25℃、噪聲≤60dB、自由飲水攝食，12h白晝12h黑夜自然光照條件），20只Wistar大鼠隨機分為四組，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組，每組5只，其中Ⅰ、Ⅱ組為對照組，Ⅲ、Ⅳ組為實驗組。實驗組采用改良的單一連續應激方法建立PTSD大鼠模型（禁錮2h，強迫游泳15min，乙醚麻醉至大鼠昏迷，足底電擊5s）。對照組大鼠單純性飼養不做任何處理。

3.2 TUNEL方法檢測海馬神經元凋亡

3.2.1 標本預處理：造模成功后將所有大鼠腹腔注射10%的水合氯醛（0.3mL/100g）麻醉，暴露心臟，用4%多聚甲醛溶液（pH=7.4）250mL灌流固定，直到大鼠四肢僵硬。同時處死對照組和模型組大鼠，剝離腦組織后將腦組織置于10%的中性福爾馬林溶液中浸泡過夜。對照大鼠腦組織立體圖譜對大鼠海馬區進行取材，常規制作石蠟切片。

3.2.2 脫蠟至水：（1）室溫下將石蠟組織切片連續兩次放入不同的二甲苯中浸泡，每次5min，以脫蠟徹底；（2）依次浸泡于濃度為100%、90%、80%、70%的梯度酒精各1次，每次2min，逐漸增加水分；（3）用PBS浸洗組織切片3次，每次5min，用濾紙小心吸干玻片上多余液體；（4）用疏水筆在組織周圍圈出樣本分布的輪廓，便于以下過程中組織標本的處理。

3.2.3 增加樣本的通透性：用PBS溶液配置終濃度為20ug/mL的蛋白酶K（不含DNase活性），每個樣品需要100uL蛋白酶K溶液。在室溫下，在每個樣本上滴加100uL配制好的蛋白酶K溶液，使蛋白酶K溶液將樣本完全覆蓋，孵育20min。PBS輕輕潤洗組織樣本3次，每次5min。然后去掉多余液體，并用濾紙小心吸干在玻片上樣品周圍的液體。將處理好的樣品放置在濕盒中以保持樣本的濕潤。

3.2.4 配置標記反應液。

3.2.5 標記反應：洗滌樣本1次，輕輕吸干樣本周圍的緩沖液，注意不要觸碰到樣本。在每個樣本上滴加50uL上述配置的標記反應混合物。將切片放置于濕盒中于37℃孵育60～90min。

3.2.6 顯色與結果判斷：用PBS溶液孵育2次，每次1min，用濾紙吸干栽玻片上樣品周圍多余液體。室溫下，用去離子水浸洗樣本2次，每次5min，滴干載玻片上多余的水并用吸水紙擦拭樣本周邊的區域。用POD稀釋液配制POD溶液（1∶25稀釋）在每個樣本上滴加50uL POD溶液，37℃放置30min。DAB顯色液A和B混合稀釋成1X工作液。PBS洗滌載玻片3次后，加入50～100uL DAB底物，室溫放置10min。PBS洗滌載玻片3次，除去多余底物后，蘇木素復染數s，自來水沖洗2min，鹽酸酒精分化2s，自來水沖洗2min，室溫下依次用50%、70%、85%、95%梯度酒精脫水2min。二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下分析樣本。

3.3 海馬神經元凋亡率的計算

在400倍光學顯微鏡下隨機取海馬區5個不重疊視野，數出相應視野內神經元細胞數和凋亡陽性細胞數。細胞凋亡率=凋亡陽性細胞數/神經元細胞總數。

3.4 統計學處理

統計結果用均數士標準差表示，用SPSS 13.0對兩組數據進行t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

4 實驗結果

TUNEL陽性細胞核固縮顏色呈黃色或黃褐色，細胞體積縮小，有細胞凋亡的特征。對照組出現較少的神經元凋亡細胞（Ⅰ組9.74+0.88、Ⅱ組9.66+1.23），實驗組出現較多的神經元凋亡細胞（Ⅲ組20.1+1.04、Ⅳ組19.7+1.53）。PTSD實驗組大鼠TUNEL陽性細胞率明顯高于對照組，并具有統計學意義（P<0.05）。見表2：

5 討論

實驗選用成年雄性Wistar大鼠是由于其屬于封閉群大鼠，具有無特定病原體、繁殖力強、性格溫順、對傳染病抵抗力強、頭部較寬闊等特點，有利于飼養、實驗操作及結果觀察，為PTSD的研究建立接近臨床患者情況的動物模型。本實驗在SPS之后隨即對大鼠進行足底電擊是改良后的單一連續應激建模方法，足底電擊是將大鼠放在一個有電板的隔離空間內，通過電板導電對大鼠產生電刺激，足底電擊可以產生較高強度的應激反應。TUNEL是檢測細胞凋亡的常用方法，常用的切片方法為石蠟切片，由于石蠟切片加熱操作等過程可導致細胞損傷，增加了細胞凋亡的假陽性，但本實驗應用蛋白酶K溶液透明降低了組織樣本對TUNEL的敏感性，并且石蠟切片具有可切薄片、易于保存等優點，因此成為實驗中應用最普遍的方法之一。

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，是一種不同于細胞病理性死亡的生理性變化過程。細胞在發生凋亡時，會在生理生化及細胞形態上發生一系列變化。隨著地震、洪水等自然災害和車禍等人為災害的增多，創傷后應激障礙越來越多的出現在人類的社會生活之中，但治療效果一直不容樂觀，因而對PTSD發病機制的研究已經成為當今醫學界研究的熱點之一。有研究表明：PTSD可導致海馬區神經元結構及功能發生變化，但機制尚不清楚。多篇研究顯示：在PTSD中海馬體的損傷及形態結構、細胞學變化與患者及動物模型的病理改變密切相關提示，在PTSD發病過程中，海馬部位神經細胞存在凋亡的病理改變。但截止到目前，PTSD詳細發病機制仍未被確切闡明。本實驗通過TUNEL方法對PTSD大鼠海馬區細胞凋亡情況進行檢測，結果表明，PTSD大鼠海馬神經元細胞凋亡率高于對照組，揭示了海馬區神經元細胞凋亡可能與PTSD發病機制有密切關系，為PTSD發病過程中海馬區結構及功能變化的機制研究提供實驗依據。

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基金項目：華北理工大學科學研究基金項目（Z201344）；華北理工大學大學生創新創業性實驗（X2015141）。

作者簡介：劉淘（1993-），女，河北邯鄲人，華北理工大學臨床醫學院學生，研究方向：神經病學與精神病學；耿菲（1981-），男，河北唐山人，供職于華北理工大學基礎醫學院，研究方向：神經病學與精神病學。

（責任編輯：蔣建華）