TcLr35小麥中抗病相關基因S2A2的抗葉銹性分析

張艷俊　張家瑞　栗小英　王海燕　劉大群

摘要：NBS-LRR是已克隆植物抗病基因的高度保守氨基酸區域。前期工作中，筆者成功克隆獲得了1個通讀的NBS類抗病同源基因S2A2的cDNA序列，該序列含有NB-ARC保守結構域和多個LRR結構域，且在小麥葉片中為低豐度組成型表達。進一步根據S2A2基因在TcLr35與Thatcher中擴增獲得的基因序列差異位點設計特異性引物，分別以TcLr35、Thatcher為模板進行擴增，篩選出了具有較高穩定性和可重復性的3對引物。利用3個多態性引物對TcLr35、Thatcher及其F₂代群體進行擴增和遺傳性分析，并用Mapmanager軟件計算分子標記與抗葉銹病基因之間的遺傳距離，結果發現這3對引物獲得的標記與Lr35基因遺傳距離較遠。利用這3個多態性引物擴增33個不同小麥抗葉銹病近等基因系材料，并回收測序，結果表明該基因序列在不同近等基因系材料中廣泛存在。

關鍵詞：NBS-LRR；抗病基因；小麥葉銹病；分子標記

中圖分類號：S435.12 文獻標志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0148—04

小麥是世界上分布范圍最廣，栽培面積最大，總產量最高的糧食作物。病害是威脅小麥穩產高產的主要因素之一。由專性寄生真菌——小麥葉銹菌（Puccinia triticina）引起的小麥葉銹病是最嚴重的小麥葉部病害之一，在世界各產麥區均有發生。在北非、東南亞、中亞、東歐和南北美洲等廣大地區較為嚴重。該病也是威脅我國小麥生產的一種常發病害，20世紀70年代，北方麥區曾發生3次中度以上流行（1973年、1975年和1979年），給我國小麥生產造成嚴重的損失。過去幾年中我國雖然沒有葉銹病大規模暴發的相關報道，但在華北及黃淮麥區，葉銹病經常對小麥生產造成危害，近年來該病害呈上升趨勢。開發利用寄主本身的抗病性是解決病害問題的根本途徑，但由于葉銹菌毒性基因的高度變異性和抗銹品種的不合理使用，導致傳統抗病品種的抗性喪失。因此，利用包括DNA分子標記技術在內的多種手段提高抗病基因和抗病類型的豐富度、保持品種抗銹性的持久有效，是一項十分緊迫的任務。

成株抗葉銹病基因Lr35最初來源于擬斯卑爾脫山羊草（Aegilops spehoides），通過與二倍體的Triticum monococcum回交轉到小麥中，定位在2B染色體上，與Sr39緊密連鎖。國內外至今尚未發現對它表現毒性的菌株存在，是一個應用潛力很大的由主效基因控制的抗病基因。目前人們已經找到了與Lr35緊密連鎖的BCD260和UBC836這2個分子標記，并分別轉化為更為穩定的STS和SCAR特異性標記。筆者所在實驗室王海燕等在TcLr35小麥中獲得$2A2基因全長，序列比較結果表明，與Thatcher中獲得的該基因序列差異明顯，含有多個插入/缺失或者SNP位點，為了能快速且恰當的評價該基因的功能及其與小麥葉銹病的抗病相關性，本研究利用特異性引物篩選抗感材料和不同近等基因系材料差異，以期明確S2A2基因抗葉銹性。

1材料與方法

1.1材料

供試小麥葉銹菌致病菌株99-8-11-5-3由河北農業大學小麥葉銹病研究中心提供。小麥抗葉銹病近等基因系材料TcLr35、感病親本Thatcher和鄭州5389及其他抗葉銹病近等基因系均來自河北農業大學小麥葉銹病研究室。

1.2特異性引物的篩選

圍繞Thatcher和TcLr35中獲得的序列差異位點設計特異性引物（表1），將其自由組合成不同引物組合，并以TcLr35和Thatcher為模板進行篩選。引物篩選的24μL反應體系為：1.0μL模板，18.7μL ddH₂O，2.5μL 10×buffer，0.5μLdNTP，正反向引物各0.5μL，0.3μL Taq酶。反應程序為94℃預變性1 min；94℃變性30 s，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個循環；最后72℃延伸10 min。擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像分析系統進行拍照及分析。

1.3抗葉銹病分析

Lr35基因為成株抗葉銹病基因，待供試小麥生長至4葉期，采用撒粉法接種新鮮小麥葉銹菌種。接種后15 d左右，待發病充分時進行抗感鑒定，按0、；、1、2、3、4等6級標準調查記載表現型，0～2級為抗病，3～4級為感病。同時利用Lr35的SCAR引物進行抗病性鑒定。24μL反應體系為：模板1.0μL，ddH20 18.7μL，10×buffer 2.5μL，dNTF0.5μL，正反向引物各0.5μL，Taq酶0.3μL。反應程序為：94℃預變性1 min；94℃變性30 s，64℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個循環；最后72℃延伸10 min。擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像分析系統進行拍照及分析。

利用小麥近等基因系尋找TcLr35的多態條帶，再用F2分離后代單株，驗證該多態性條帶與目標基因連鎖程度。用Mapmanager軟件對數據進行連鎖分析，計算遺傳距離。

2結果與分析

2.1特異性引物的篩選

為了進一步明確該基因與Lr35的關系，根據S2A2基因在TcLr35和Thatcher中序列的差異性位點設計引物組合進行篩選，獲得3條特異性條帶，即3對引物組合能擴增出小麥抗葉銹病近等基因系TcLr35特異性條帶，而在Thatcher中條帶缺失，這3對引物分別是SSA7/SSA8、SSA2/SSA8、SSAT/SSA12。引物對SSA7/SSA8能在TcLr35中穩定擴增出1條大小為1200 bp左右的條帶；引物對SSA2/SSA8能在TcLr35中穩定擴增出1條大小為890 bp左右的條帶；引物對SSA7/SSA12能在TcLr35中穩定擴增出1條大小為1300 bp左右的條帶（圖1）。經多次試驗，擴增結果具有很高的穩定性和可重復性。

2.2小麥葉銹病的鑒定及群體遺傳分析

葉銹菌生理小種99-8-11-5-3接種TcLr35、感病親本Thatcher及雜交F1代10個單株。抗病鑒定結果表明，TcLr35和10個雜交F1代單株對生理小種99-8-11-5-3表現為高抗（反應型為0），而Thatcher表現為高感（反應型為4）。

成株期對192個F2代單株接種小麥葉銹菌生理小種99-8-11-5-3后，抗病146株，感病46株，用卡方測驗（x²-test）檢驗其適合度，其卡方值是0.11，檢驗結果表明，該基因符合3：1的遺傳規律，說明F₂代中的Lr35基因以單顯性基因方式存在。為保證鑒定結果的可靠性，用Lr35的SCAR引物對192株F2（TcLr35×Thatcher）代群體抗病性進行鑒定，結果在抗病品種中擴出了Lr35基因的特異條帶而在感病品種中沒有（圖2），結果與接菌鑒定一致。

為檢測目的基因位點與所獲得標記位點的遺傳連鎖性，利用3個多態性引物檢測F₂代群體單株，其結果顯示，引物對SSA7/SSA8在46株感病中有4株擴出大小為1200 bp的差異性條帶，而在146株抗病中有4株沒有擴出差異性條帶（圖3）；引物對SSA7/SSA12在46株感病中有5株擴出大小為1290 bp的差異性條帶，而在146株抗病中有3株沒有擴出差異性條帶（圖4）；引物對SSA2/SSA8在46株感病中由5株擴出890 bp差異性條帶，而在146株抗病中有4株沒有擴出差異性條帶（圖5），表明在后代群體中3個標記交換值均較高。用Mapmanager軟件計算分子標記與抗葉銹病基因之間的遺傳距離，結果發現這3對引物獲得的標記與Lr35基因遺傳距離較遠。

2.3特異性引物擴增近等基因系

用3對特異性引物組合分別對33個小麥抗葉銹基因系材料進行PCR擴增（圖6、圖7、圖8），結果顯示，引物組合SSA7/SSA8、SSA7/SSA12除在TcLr14a、TcLrl4b、TcLr14ab、TcLr41、TcLr42和TcLrl8中沒有獲得擴增條帶外，其余27個近等基因系中均擴增出目的條帶；引物組合SSA2/SSA8除在TcLr14a、TcLr14b、TcLr14ab、TcLr41、TcLr42、TcLr11和TcLr18中沒有條帶外，其余26個近等基因系中均擴增出目的條帶，說明3個特異性條帶在大多數近等基因系材料中存在，選取不同來源近等基因系材料中獲得的差異性條帶回收測序，所得序列與TcLr35的差異性條帶序列差異不大，表明獲得的序列在近等基因系材料中普遍存在。

3討論

抗葉銹病基因的利用，在小麥抗葉銹病育種中發揮了重要的作用。迄今為止，國際上已發現100余個小麥抗葉銹基因，正式命名編號至Lr72，其中大部分已分子作圖并獲得緊密連鎖或共分離的分子標記（Lr1、Lr2c、Lr12、Lr25、Lr32、Lr37、Lr38、Lr41、Lr42、Lr48和LrZH84，但由于氣候條件的變化、生產上的局限性及新的葉銹菌生理小種的形成，導致許多抗銹品種反應型由近免疫到了1或2型甚至4型。如Lr1基因對小麥大部分葉銹菌生理小種已表現感病，Lr2c基因毒性頻率也下降等等。培育成株抗性品種將會成為控制小麥葉銹病經濟與環保相結合的有效方法。小麥抗葉銹病基因Lr35是一個成株抗性基因，且尚未報道發現其毒性小種，是有效的成株抗性基因，吸引了大量的研究者。本實驗室先后對其抗病機制、分子標記、輔助育種等方面進行了研究，并取得了一定的進展。本研究旨在前期工作的基礎上進一步明確S2A2基因與小麥抗葉銹性的關系。

研究發現試圖應用特異性引物在抗感材料間發現帶型上的差異不太可能。可能是單堿基的差異，而不是堿基數目的差異，這是不能用普通的電泳帶型區分的，這與已克隆的小麥抗葉銹病基因Lr34特點類似。本研究根據S2A2基因序列設計全長引物，在Thatcher和TcLr35基因組中分別獲得該基因擴增條帶，進行了全長測序，發現S2A2基因在抗感材料問序列差異明顯，尤其3′端差異顯著，含有多個較長的插入、缺失序列，而大多數基因的功能主要決定于3′端。

為了揭示$2A2基因與Lr35相關性，根據抗感材料中序列差異明顯區域，尤其圍繞2個內元設計特異性引物，有3個引物能夠揭示TcLr35和Thatcher抗感親本間差異，而在F₂代驗證中感病單株也出現了與抗病親本相同的特異條帶，郭楠等和閆紅飛等分別在獲得Lr45、Lr38的分子標記時也具有該現象，可能是由單核苷酸位點突變引起的重組突變或染色體交叉導致的，但其交換值較高，這些標記與Lr35基因遺傳距離較遠。當然這些引物擴增的僅是S2A2基因全長中的一部分序列，可能為遺傳背景中共同的遺傳信息，由于小麥抗葉銹病基因來源比較復雜，如Lr19來源于長穗偃麥草（Thinopyrum elongatum），Lr35來源于擬斯比爾脫山羊草（Ae-gilops speltoides），Lr38來源于中間偃麥草（T.interrnedium），Lr41和Lr42基因來源于粗山羊草（T.tauschii）等等，轉入普通小麥后，經過6代回交，可能會產生一些共同的遺傳物質，如果篩選更多的特異性引物，可能會獲得與Lr35緊密連鎖或共分離的分子標記。同時利用這些特異性引物在一部分小麥抗葉銹病近等基因系材料中可以獲得相同的序列，在一部分小麥抗葉銹病近等基因系材料中不能獲得有效擴增片段，說明這些序列在多數近等基因系基因組中廣泛存在，而且這種差異能在抗感材料間表現。由于小麥基因組的復雜性，以及Lr35目的基因本身來源于外源導入片段，從以上的研究結果推測，S2A2基因可能不是Lr35目的基因，但其中的一些序列在多數小麥抗葉銹病近等基因系材料中普遍存在，而且可能與小麥抗葉銹性相關，可能為多數小麥抗葉銹病反應中的調控基因，該結果尚待在穩定轉化中進行進一步的功能驗證。