補骨脂提取物對黃瓜炭疽病菌的抑制活性

關麗杰　董瑞芳

摘要：采用菌絲生長速率法、孢子萌發法，研究了補骨脂提取物及0.2%異補骨脂查爾酮可溶液劑對黃瓜炭疽病菌的抑制活性的影響。結果發現，補骨脂提取物對黃瓜炭疽病菌菌絲生長、孢子萌發均有很強的抑制作用，其中對菌絲生長的抑制中濃度EC₅₀為62.973 mg/L，孢子萌發的抑制中濃度EC₅₀為8.213 mg/L。此外，0.2%異補骨脂查爾酮可溶液劑對黃瓜炭疽病有很強的防效，當施藥濃度為375倍液時，防效即達到90.90%。以上結果表明，0.2%異補骨脂查爾酮可溶液劑是一種很有市場前景的防治黃瓜炭疽病的植物源殺菌劑。

關鍵詞：植物源殺菌劑；補骨脂提取物；黃瓜炭疽病菌；抑制率

中圖分類號：S436.421.1⁺9 文獻標志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0160—03

黃瓜炭疽病是黃瓜葉部的重要病害，在全國各地均有發生，是世界性的農業問題。當前，生產上對黃瓜炭疽病的防治主要還是依賴于化學農藥，但是化學農藥防治存在成本高、農藥殘留、環境污染、病原抗藥性增強等問題，影響著人類的身體健康，且不符合可持續發展戰略的要求。陳義娟等發現茄子莖葉與辣椒莖葉提取液對黃瓜炭疽病菌具有一定的抑制效果。田菲菲等發現甘草、枸杞、金錢草等11種植物的80%乙醇提取物對黃瓜炭疽病菌都有一定程度的抑制作用。Lee等從中藥石菖蒲根莖的揮發油中分離出有效成分細辛腦，且發現500μg/mL細辛腦對黃瓜炭疽病病變的形成具有很強的抑制作用。Shimizu等發現內寄生的鏈霉菌屬MBCu-56菌株對黃瓜炭疽病有很好的防治作用，10⁹ CFU/mL菌株的防治效果為93%。本研究發現補骨脂乙醇提取物對黃瓜炭疽病菌菌絲生長、分生孢子萌發具有抑制作用，并開展了0.2%異補骨脂查爾酮可溶液劑在室內進行黃瓜炭疽病的初步防治試驗，旨在為其進一步進行田問推廣及應用提供理論依據。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1供試菌種和植物材料 供試菌種：黃瓜炭疽病菌（Colletrichum anthracnose），由沈陽化工大學生物工程教研室保存。

供試黃瓜品種：冠軍密刺。

1.1.2供試藥劑 95%乙醇（沈陽市新化試劑廠）；瓊脂（福建省泉州市泉港化工廠）；葡萄糖（國藥集團化學試劑有限公司）；0.2%異補骨脂查爾酮可溶液劑（補骨脂提取物質量濃度為10%，沈陽化工大學生物工程教研室制備）；75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑（有效成分含量75%，拜耳作物科學公司）。

1.1.3主要儀器LDZX-40BI立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫療器械廠）；PH140A型光照培養箱/干燥箱（上海益恒實驗儀器有限公司）；HNP-1S水平流形超凈工作臺（南通滬南科學儀器有限公司）；SCOUT電子天平SCA210（叟豪斯國際貿易有限公司）；METILER AE240s電子分析天平（特勒-托利多儀器有限公司）；LRH-280微電腦控制生化培養箱（廣東省醫療器械廠）；MOTIC BA220型顯微鏡（上海精密儀器儀表有限公司）。

1.2試驗方法

1.2.1補骨脂提取物的制備 提取溶劑為70%乙醇、固液比為1 g：5 mL、提取溫度為室溫、提取時間每次為3 h、合并濾液次數為2次以上，將所得的乙醇提取液在60℃下用旋轉蒸發儀進行蒸餾濃縮，然后再在真空干燥箱內進行干燥。將干燥后的植物提取物密封好后，放人4℃冰箱內保存備用。

1.2.2補骨脂提取物對黃瓜炭疽病菌菌絲生長抑制作用測定 采用菌絲生長速率法。用乙醇將補骨脂膏完全溶解分別配成濃度為243、81、27、9、3 mg/mL的溶液。取上述配制的5個濃度的溶液各1 mL，分別加入到100 mL，在50℃左右的PDA培養基中。充分混勻后，即配制成所設濃度含藥培養基，將1 mL的乙醇溶液加入到100 mL PDA培養基中作為對照，然后倒入直徑為90 mm的培養皿中制成平板，備用。使用直徑為6 mm的打孔器在事先在PDA平板上打孔，將在28℃下培養了3～5 d的供試病菌菌落邊緣處切取菌餅，并且接種到不同濃度的補骨脂平板和對照平板中央，每次處理重復4次，置于28℃下培養5～7 d，測量菌落的直徑。每種菌落取相交垂直線方向測其直徑，以其均值減去菌餅直徑即得菌落凈生長直徑。

1.2.3補骨脂提取物對黃瓜炭疽病菌孢子萌發的抑制作用測定 將黃瓜炭疽病菌菌餅放置于菜豆培養基平板中央，置于28℃下培養7～10 d，待菌絲長滿后，取長勢良好的黃瓜炭疽病菌平板，加5 mL 1%的無菌葡萄糖水，用毛刷刷洗病原菌平板，8層紗布過濾，用1%的葡萄糖水溶液調至每個視野15～20個孢子，制備成孢子懸液。移取190μL的孢子懸液至32微孔板，加入10μL一定濃度的補骨脂乙醇溶液，使補骨脂提取物的終濃度為3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 mg/L。加入等量的乙醇為對照，等量1%葡萄糖水為空白，每個處理重復3次。每隔2 h鏡檢孢子萌發的狀態。當空白孢子萌發率達到90%時，每處理隨機選取200個孢子，并以芽管長度超過孢子短徑的1/2時視為萌發，統計孢子萌發率，并計算抑制率。

1.2.4室內盆栽試驗 將芽勢一致的黃瓜種子播種在花盆中，當植株長到2葉1心時，噴施不同稀釋倍數的0.2%異補骨脂查爾酮可溶液劑，以75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑為對照藥劑，并設清水對照。24 h風干之后，將黃瓜炭疽病菌孢子懸液均勻噴灑于植株上。接種后的試材放置在迷霧氣候箱中培養；溫度28～30℃，相對濕度RH為100%，接種24 h內保證黑暗條件，24 h之后光照：黑暗=12 h：12 h處理；每處理10株黃瓜苗，重復3次；待對照充分發病后調查防病效果，調查分級標準采用《農藥田間藥效試驗》標準。

黃瓜炭疽病分級標準：0級為葉片無病斑；1級為病斑面積占整個葉面積5%以下；3級為病斑面積占整個葉面積6%～10%；5級為病斑面積占整個葉面積11%～25%；7級為病斑面積占整個葉面積26%～50%；9級為病斑面積占整個葉面積50%以上。

1.2.5數據處理 （1）獨立回歸方法：采用最小二乘法計算獨立回歸方程，計算有效抑制終濃度（EC₅₀）。（2）顯著性檢驗方法：采用Duncan's新復極差法在0.05水平進行顯著性檢驗。

2結果與分析

2.1補骨脂提取物對黃瓜炭疽病菌菌絲生長的影響

補骨脂物提取物對黃瓜炭疽病菌菌絲生長的抑制率與提取物濃度呈現正相關，即隨著提取物濃度的升高，抑制率也依次增高。當補骨脂提取物濃度為30、90、270、810、2 430 mg/L時，對黃瓜炭疽病菌菌絲生長的抑制率分別為47.64%、48.51%、62.50%、83.12%、91.33%。其對黃瓜炭疽病原菌EC₅₀值為62.973 mg/L，說明補骨脂提取物對黃瓜炭疽病原菌菌絲生長具有較高的抑制活性（表1）。

2.2補骨脂提取物對黃瓜炭疽病菌孢子萌發的抑制活性

補骨脂提取物的濃度與黃瓜炭疽病菌孢子萌發的抑制率呈正相關，即隨著補骨脂提取物濃度升高，抑制率也增大。當補骨脂提取物的濃度為3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 mg/L時，其抑制率分別為16.35%、32.91%、68.38%、97.74%、98.31%。由此可以得出補骨脂提取物對黃瓜炭疽病菌抑制作用的毒力回歸方程與ECso，其對黃瓜炭疽病原菌ECso值為8.213 1 mg/L（表2）?？梢娧a骨脂提取物對黃瓜炭疽病菌的孢子具有很強的抑制作用，且隨著藥劑濃度的增加對孢子萌發的抑制作用明顯增強。

2.3室內盆栽試驗結果

室內盆栽試驗發現，0.2%異補骨脂查爾酮可溶液劑對黃瓜炭疽病有明顯的防治效果，且防治效果與可溶液劑的稀釋倍數呈現正相關，其中3 000倍液的防效為59.08%，防效好于75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑的效果（表3）。結果表明，0.2%異補骨脂查爾酮可溶液劑對黃瓜炭疽病有很顯著的防效，且其藥效要好于75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑。室內盆栽試驗為能夠進行田問實驗或是真正應用于實際生產中防治黃瓜炭疽病提供一定的數據支持與理論依據。

3討論

本研究通過菌絲生長速率法及孢子萌發法測定了補骨脂提取物對黃瓜炭疽病菌的抑制作用，發現抑制中濃度EC₅₀分別為62.973、8.213 mg/L，說明補骨脂提取物對黃瓜炭疽病菌有極強的抑制作用。最后通過盆栽試驗，測定了0.2%異補骨脂查爾酮可溶液劑對黃瓜炭疽病的防治效果，結果表明0.2%異補骨脂查爾酮可溶液劑對黃瓜炭疽病具有很好的防效。

目前國內外對黃瓜炭疽病的防治，特別是植物源殺菌劑的研究較少，本研究首次發現補骨脂提取物對黃瓜炭疽病菌具有顯著的抑制效果。以往的報道中，陳義娟等發現茄子莖葉和辣椒莖葉的乙醇提取液對黃瓜炭疽有顯著的抑菌作用，當濃度為20 g/L時，其對黃瓜炭疽病菌菌絲的抑制率分別為72.86%、72.57%，EC₅₀依次為6.962 7、8.254/L。在本研究中當補骨脂提取物濃度為2.43g/L時，對黃瓜炭疽病菌菌絲的抑制率為91.33%，其中ECso為62.973 mg/L。田菲菲等發現甘草的乙醇提取物的質量濃度為10 g/L時，對黃瓜炭疽病菌分生孢子萌發的抑制率達99.6%。在本研究中，補骨脂提取物的濃度為50 mg/L時，抑制率為98.31%?？梢姡a骨脂提取物對黃瓜炭疽病菌菌絲生長、孢子萌發均有很強的抑制作用

本試驗結果表明，補骨脂對黃瓜炭疽病菌具有很強的抑制作用，且補骨脂制劑作為植物源殺菌劑，它的作用靶標或對病原菌的作用一般都是多因子的，故不易使靶標菌產生抗藥性。因此，補骨脂作為一種綠色環保的植物源農藥對防治黃瓜炭疽病具有很好的應用前景。本研究為田問藥效實驗及補骨脂的推廣利用提供了理論依據。