牡丹紅斑病抗性鑒定方法研究

楊德翠

摘要：紅斑病是牡丹上一種普遍發(fā)生的病害，但不同品種抗病性不同，合適的鑒定方法將為抗病品種的準(zhǔn)確篩選提供保障。選用抗性品種魯菏紅和感病品種趙粉作為試驗(yàn)材料，對(duì)牡丹離體葉片接種和活體植株接種病原菌進(jìn)行抗病性鑒定。同時(shí)，對(duì)患病牡丹丙二醛（MDA）和過(guò)氧化氫（H₂O₂）含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：離體接種試驗(yàn)中，魯菏紅和趙粉在選用的3個(gè)菌液濃度下病情指數(shù)均有顯著差異，與活體接種時(shí)得出的結(jié)論一致，這表明離體鑒定方法可行。此外，與對(duì)照相比，牡丹感染紅斑病后體內(nèi)MDA和H202含量均升高，其中感病品種趙粉含量均顯著高于抗病魯菏紅，說(shuō)明紅斑病抗感品種生理上存在著差異。

關(guān)鍵詞：牡丹；紅斑病；離體鑒定；抗病性鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)：S432.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002—1302（2016）01—0168—03

牡丹雍容華貴，深受我國(guó)人民的喜愛(ài)。不但具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，也有較高的藥用價(jià)值，而且牡丹籽含油量和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，是一種理想的油料資源，近年來(lái)栽培面積不斷擴(kuò)大。然而，由于管理的粗放，其病害程度逐年加重。其中發(fā)生普遍和危害嚴(yán)重的病害有3種：紅斑病、根腐病、根結(jié)線蟲(chóng)病。牡丹紅斑病也稱霉病、輪斑病，是由牡丹枝孢霉菌（Cladosporium paeoniae Pass.）引起的，是牡丹發(fā)生最為普遍的病害之一。紅斑病是一種葉部病害，發(fā)病程度可因品種和地塊的不同而不同。如在山東菏澤地區(qū)，有高達(dá)80%以上的牡丹園病害發(fā)生率在50%左右，且重病園發(fā)病率甚至在90%以上。受害植株光合速率降低、光合機(jī)構(gòu)破壞、抗氧化酶活性發(fā)生變化。從外部表現(xiàn)看，受害牡丹生長(zhǎng)勢(shì)差、丹皮、苗木產(chǎn)量低，花色衰退，嚴(yán)重時(shí)甚至死亡，嚴(yán)重阻礙了牡丹產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。

但不同牡丹品種抗病性不同，為了合理利用牡丹的抗病資源，達(dá)到控制病害的目的，需要有效地鑒定出抗病性強(qiáng)的品種，而合適的抗性鑒定方法是篩選抗性品種的保障。本試驗(yàn)研究抗性品種魯菏紅與感病品種趙粉離體和活體的抗病性鑒定方法，旨在為牡丹紅斑病的快速鑒定及抗病機(jī)制研究提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

2013年秋天從菏澤采購(gòu)的2個(gè)牡丹品種魯菏紅與趙粉移栽上盆，花盆規(guī)格45 cm×32 cm，花盆埋于大田越冬。2014年3月中旬移入溫室，溫室溫度20～30℃。常規(guī)澆水施肥管理，植株生長(zhǎng)正常。

1.2試驗(yàn)材料培養(yǎng)的處理牡丹枝孢霉菌分離和培養(yǎng)

病原菌C.paeoniae Pass.來(lái)自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生理實(shí)驗(yàn)室從病葉上用組織分離法分離并鑒定的菌種。在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，25℃黑暗培養(yǎng)10 d，待菌落長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí)，用無(wú)菌水沖洗培養(yǎng)皿，用超聲波將病原孢子散開(kāi)，分別配成濃度為5.0×10⁴、2.0×10⁵、5.0×10⁵、3.5×10⁶孢子/mL的菌液，分別進(jìn)行離體葉片和活體植株的接種。

1.3抗病性鑒定的處理方法

離體葉片接種法：選取魯菏紅與趙粉的枝條頂部的第2張、第3張，葉片以0.1%HgCl₂滅菌8 min，無(wú)菌水沖洗4～5遍，用無(wú)菌濾紙將水分吸干。分3個(gè)處理，處理1菌液孢子濃度為5.0×104個(gè)/mL；處理2菌液孢子濃度為2.0×10⁵個(gè)/mL；處理3菌液孢子濃度為5.0×10⁵個(gè)/mL。處理時(shí)將菌液40μL滴至葉片表面，在鋪有無(wú)菌濕濾紙的培養(yǎng)皿中保濕，每處理均為50張葉。以無(wú)菌水處理葉片作對(duì)照，噴霧保濕。觀察離體發(fā)病情況，10 d后統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)。

活體接種法：選取魯菏紅與趙粉長(zhǎng)勢(shì)一致的植株，用噴霧法將3.5×10⁶個(gè)孢子/mL菌液噴于葉子的正反面至滴水，對(duì)照用蒸餾水代替。參照吳玉柱等的方法，利用噴霧器噴霧保濕3 d，并保持溫室空氣濕度達(dá)80%～90%。分別于處理后的20 d統(tǒng)計(jì)2個(gè)品種的發(fā)病率。

1.2牡丹病害病級(jí)鑒定標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1活體鑒定標(biāo)準(zhǔn) 對(duì)牡丹活體噴施處理20 d進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，病狀分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

染病指數(shù)（%）=∑（各級(jí)病株數(shù)×各級(jí)別代表值）/（調(diào)查總株數(shù)×最大級(jí)別代值）。

1.2.2離體鑒定標(biāo)準(zhǔn) 將牡丹紅斑病進(jìn)行人工離體鑒定，按照5級(jí)分級(jí)方法，將病級(jí)記錄。然后根據(jù)公式算出病情指數(shù)，本試驗(yàn)發(fā)病情況調(diào)查分為0、1、2、3、4、5級(jí)（表2）。

染病指數(shù)（%）=∑（各級(jí)病葉數(shù)×各級(jí)別代表值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最大級(jí)別代值）。

1.2.3丙二醛（MDA）和過(guò)氧化氫（H₂O₂）含量的測(cè)定 取活體處理20 d的牡丹枝條頂部第2張、第3張葉片進(jìn)行MDA和H₂O₂含量的測(cè)定，方法均參照文獻(xiàn)[8]，重復(fù)3次。

數(shù)據(jù)使用Excel處理，用SAS 8.1數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1牡丹離體鑒定結(jié)果

離體葉片發(fā)病初期，葉正、反面出現(xiàn)綠色針頭狀小點(diǎn)，后變?yōu)樗疂n狀圓點(diǎn)，發(fā)病時(shí)呈現(xiàn)出褐色病斑，嚴(yán)重時(shí)發(fā)病處變?yōu)楹谏“邤U(kuò)展迅速，相連成片，并伴有霉味。魯菏紅和趙粉的對(duì)照均沒(méi)表現(xiàn)出發(fā)病癥狀，但2個(gè)品種在病原菌處理下均有不同程度的發(fā)病表現(xiàn)。在濃度為5×10⁴孢子/mL處理中，魯菏紅發(fā)病非常輕，而在2×10⁵、5×10⁵孢子/mL處理下癥狀明顯。趙粉在3個(gè)濃度下均表現(xiàn)出明顯的病害癥狀，在所有濃度下病害癥狀均比魯菏紅重（圖1）。隨著處理濃度的增大，魯菏紅和趙粉病情指數(shù)均升高，但趙粉病情指數(shù)高于魯菏紅，說(shuō)明在離體處理的過(guò)程中，所使用的鑒定方法和選用的病原菌濃度是合適的（表3）。

2.2牡丹植株活體處理發(fā)病統(tǒng)計(jì)

對(duì)魯菏紅和趙粉植株進(jìn)行病原菌液噴施，保濕3 d后，趙粉葉正、反面出現(xiàn)綠色針頭狀小點(diǎn)，5 d時(shí)有病斑，而魯菏紅10 d時(shí)偶有小斑出現(xiàn)。30 d左右時(shí)，可擴(kuò)展成10～25 mm大小的病斑，呈紫紅色，大多數(shù)病斑有明顯的同心輪紋，近圓形，最后病斑枯焦連成片（表4）。

2.3牡丹枝孢霉菌侵染過(guò)程中MDA和H₂O₂含量變化

MDA是細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的重要產(chǎn)物，MDA的產(chǎn)生又可引起酶的變性和膜的損傷，會(huì)導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)破壞，使膜透性增大，其含量高低可反映植物的受害程度。魯菏紅和趙粉在枝霉菌侵染20 d后，2種牡丹染病后MDA含量均高于相應(yīng)對(duì)照組，其中魯菏紅比對(duì)照MDA高50%、趙粉比對(duì)照高84.6%（圖2），表明MDA含量的升高反映出受傷害的程度。牡丹植株受侵染后H₂O₂的含量變化規(guī)律與MDA相似（圖3）。由此可以判斷，病原菌侵染后，MDA和H₂O₂含量升高，對(duì)細(xì)胞膜造成過(guò)氧化作用，膜受傷害。

4討論

牡丹不同品種對(duì)紅斑病的抗性不同，為了充分利用牡丹自身的抗病性，就要充分篩選抗病性品種進(jìn)行研究，發(fā)掘抗病資源。由于離體鑒定法具有快速、節(jié)省空間等優(yōu)點(diǎn)，因此建立合適的離體鑒定方法對(duì)篩選抗性品種非常重要。

本研究選用對(duì)紅斑病抗性較強(qiáng)的魯菏紅和抗性較弱的趙粉作為試驗(yàn)材料，通過(guò)離體葉片接種病原菌和活體植株噴施病原菌，調(diào)查病情指數(shù)的大小來(lái)反映抗病性強(qiáng)弱。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在濃度為5×10⁴、2×10⁵、5×10⁵孢子/mL處理下2個(gè)品種表現(xiàn)出明顯差異，與活體鑒定中得出的結(jié)論一致，這說(shuō)明離體鑒定所選擇的濃度范圍是合適的，也說(shuō)明離體鑒定方法的可行性。在其他一些物種中也有離體與活體鑒定結(jié)果一致的報(bào)道，如趙志祥對(duì)水稻抗瘟性離體鑒定結(jié)果與常規(guī)的活體鑒定結(jié)果高度一致，黃振濤等報(bào)道小麥品種在抗稈銹病的離體鑒定方法與活體鑒定結(jié)論一致。然而，宋維富等發(fā)現(xiàn)小麥稈銹病離體與活體鑒定在個(gè)別品種上不完全一致。

在受病原菌侵染后，抗感品種的生理生化大部分具有差異。余文英等在甘薯抗瘡痂病的研究中發(fā)現(xiàn)，感病品種的MDA上升幅度遠(yuǎn)高于抗病品種。本研究中受枝孢霉菌侵染的牡丹葉片中無(wú)論是MDA還是H₂O₂的含量，趙粉均顯著高于魯菏紅。在牡丹藏枝紅受病原菌Cylindrocladium caller-dense侵染后也觀察到MDA和H₂O₂的含量升高的現(xiàn)象。柯玉琴等在研究煙草青枯病的MDA和H₂O₂含量時(shí)結(jié)果相似。然而江彤等研究卻表明，在接種病原菌后抗性強(qiáng)的煙草品種MDA含量明顯高于感病品種，這也許與寄主和病原的不同以及取材時(shí)間的不同有關(guān)系。

本研究中創(chuàng)建了牡丹紅斑病的離體葉片鑒定法，在便于控制環(huán)境的條件下方便地鑒定品種抗紅斑病的強(qiáng)弱，而且感病后MDA含量的變化也可作為抗病性強(qiáng)弱的參考，因此本研究結(jié)果可為牡丹抗病性的鑒定和抗病品種的篩選提供參考。