牡丹紅斑病抗性鑒定方法研究

楊德翠

摘要：紅斑病是牡丹上一種普遍發(fā)生的病害，但不同品種抗病性不同，合適的鑒定方法將為抗病品種的準確篩選提供保障。選用抗性品種魯菏紅和感病品種趙粉作為試驗材料，對牡丹離體葉片接種和活體植株接種病原菌進行抗病性鑒定。同時，對患病牡丹丙二醛（MDA）和過氧化氫（H₂O₂）含量進行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：離體接種試驗中，魯菏紅和趙粉在選用的3個菌液濃度下病情指數(shù)均有顯著差異，與活體接種時得出的結(jié)論一致，這表明離體鑒定方法可行。此外，與對照相比，牡丹感染紅斑病后體內(nèi)MDA和H202含量均升高，其中感病品種趙粉含量均顯著高于抗病魯菏紅，說明紅斑病抗感品種生理上存在著差異。

關鍵詞：牡丹；紅斑病；離體鑒定；抗病性鑒定

中圖分類號：S432.2 文獻標志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0168—03

牡丹雍容華貴，深受我國人民的喜愛。不但具有極高的經(jīng)濟價值，也有較高的藥用價值，而且牡丹籽含油量和營養(yǎng)價值極高，是一種理想的油料資源，近年來栽培面積不斷擴大。然而，由于管理的粗放，其病害程度逐年加重。其中發(fā)生普遍和危害嚴重的病害有3種：紅斑病、根腐病、根結(jié)線蟲病。牡丹紅斑病也稱霉病、輪斑病，是由牡丹枝孢霉菌（Cladosporium paeoniae Pass.）引起的，是牡丹發(fā)生最為普遍的病害之一。紅斑病是一種葉部病害，發(fā)病程度可因品種和地塊的不同而不同。如在山東菏澤地區(qū)，有高達80%以上的牡丹園病害發(fā)生率在50%左右，且重病園發(fā)病率甚至在90%以上。受害植株光合速率降低、光合機構(gòu)破壞、抗氧化酶活性發(fā)生變化。從外部表現(xiàn)看，受害牡丹生長勢差、丹皮、苗木產(chǎn)量低，花色衰退，嚴重時甚至死亡，嚴重阻礙了牡丹產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。

但不同牡丹品種抗病性不同，為了合理利用牡丹的抗病資源，達到控制病害的目的，需要有效地鑒定出抗病性強的品種，而合適的抗性鑒定方法是篩選抗性品種的保障。本試驗研究抗性品種魯菏紅與感病品種趙粉離體和活體的抗病性鑒定方法，旨在為牡丹紅斑病的快速鑒定及抗病機制研究提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

2013年秋天從菏澤采購的2個牡丹品種魯菏紅與趙粉移栽上盆，花盆規(guī)格45 cm×32 cm，花盆埋于大田越冬。2014年3月中旬移入溫室，溫室溫度20～30℃。常規(guī)澆水施肥管理，植株生長正常。

1.2試驗材料培養(yǎng)的處理牡丹枝孢霉菌分離和培養(yǎng)

病原菌C.paeoniae Pass.來自青島農(nóng)業(yè)大學生理實驗室從病葉上用組織分離法分離并鑒定的菌種。在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，25℃黑暗培養(yǎng)10 d，待菌落長滿培養(yǎng)皿時，用無菌水沖洗培養(yǎng)皿，用超聲波將病原孢子散開，分別配成濃度為5.0×10⁴、2.0×10⁵、5.0×10⁵、3.5×10⁶孢子/mL的菌液，分別進行離體葉片和活體植株的接種。

1.3抗病性鑒定的處理方法

離體葉片接種法：選取魯菏紅與趙粉的枝條頂部的第2張、第3張，葉片以0.1%HgCl₂滅菌8 min，無菌水沖洗4～5遍，用無菌濾紙將水分吸干。分3個處理，處理1菌液孢子濃度為5.0×104個/mL；處理2菌液孢子濃度為2.0×10⁵個/mL；處理3菌液孢子濃度為5.0×10⁵個/mL。處理時將菌液40μL滴至葉片表面，在鋪有無菌濕濾紙的培養(yǎng)皿中保濕，每處理均為50張葉。以無菌水處理葉片作對照，噴霧保濕。觀察離體發(fā)病情況，10 d后統(tǒng)計病情指數(shù)。

活體接種法：選取魯菏紅與趙粉長勢一致的植株，用噴霧法將3.5×10⁶個孢子/mL菌液噴于葉子的正反面至滴水，對照用蒸餾水代替。參照吳玉柱等的方法，利用噴霧器噴霧保濕3 d，并保持溫室空氣濕度達80%～90%。分別于處理后的20 d統(tǒng)計2個品種的發(fā)病率。

1.2牡丹病害病級鑒定標準

1.2.1活體鑒定標準 對牡丹活體噴施處理20 d進行統(tǒng)計，病狀分級標準見表1。

染病指數(shù)（%）=∑（各級病株數(shù)×各級別代表值）/（調(diào)查總株數(shù)×最大級別代值）。

1.2.2離體鑒定標準 將牡丹紅斑病進行人工離體鑒定，按照5級分級方法，將病級記錄。然后根據(jù)公式算出病情指數(shù)，本試驗發(fā)病情況調(diào)查分為0、1、2、3、4、5級（表2）。

染病指數(shù)（%）=∑（各級病葉數(shù)×各級別代表值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最大級別代值）。

1.2.3丙二醛（MDA）和過氧化氫（H₂O₂）含量的測定 取活體處理20 d的牡丹枝條頂部第2張、第3張葉片進行MDA和H₂O₂含量的測定，方法均參照文獻[8]，重復3次。

數(shù)據(jù)使用Excel處理，用SAS 8.1數(shù)據(jù)處理軟件進行顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1牡丹離體鑒定結(jié)果

離體葉片發(fā)病初期，葉正、反面出現(xiàn)綠色針頭狀小點，后變?yōu)樗疂n狀圓點，發(fā)病時呈現(xiàn)出褐色病斑，嚴重時發(fā)病處變?yōu)楹谏“邤U展迅速，相連成片，并伴有霉味。魯菏紅和趙粉的對照均沒表現(xiàn)出發(fā)病癥狀，但2個品種在病原菌處理下均有不同程度的發(fā)病表現(xiàn)。在濃度為5×10⁴孢子/mL處理中，魯菏紅發(fā)病非常輕，而在2×10⁵、5×10⁵孢子/mL處理下癥狀明顯。趙粉在3個濃度下均表現(xiàn)出明顯的病害癥狀，在所有濃度下病害癥狀均比魯菏紅重（圖1）。隨著處理濃度的增大，魯菏紅和趙粉病情指數(shù)均升高，但趙粉病情指數(shù)高于魯菏紅，說明在離體處理的過程中，所使用的鑒定方法和選用的病原菌濃度是合適的（表3）。

2.2牡丹植株活體處理發(fā)病統(tǒng)計

對魯菏紅和趙粉植株進行病原菌液噴施，保濕3 d后，趙粉葉正、反面出現(xiàn)綠色針頭狀小點，5 d時有病斑，而魯菏紅10 d時偶有小斑出現(xiàn)。30 d左右時，可擴展成10～25 mm大小的病斑，呈紫紅色，大多數(shù)病斑有明顯的同心輪紋，近圓形，最后病斑枯焦連成片（表4）。

2.3牡丹枝孢霉菌侵染過程中MDA和H₂O₂含量變化

MDA是細胞膜脂過氧化的重要產(chǎn)物，MDA的產(chǎn)生又可引起酶的變性和膜的損傷，會導致膜結(jié)構(gòu)破壞，使膜透性增大，其含量高低可反映植物的受害程度。魯菏紅和趙粉在枝霉菌侵染20 d后，2種牡丹染病后MDA含量均高于相應對照組，其中魯菏紅比對照MDA高50%、趙粉比對照高84.6%（圖2），表明MDA含量的升高反映出受傷害的程度。牡丹植株受侵染后H₂O₂的含量變化規(guī)律與MDA相似（圖3）。由此可以判斷，病原菌侵染后，MDA和H₂O₂含量升高，對細胞膜造成過氧化作用，膜受傷害。

4討論

牡丹不同品種對紅斑病的抗性不同，為了充分利用牡丹自身的抗病性，就要充分篩選抗病性品種進行研究，發(fā)掘抗病資源。由于離體鑒定法具有快速、節(jié)省空間等優(yōu)點，因此建立合適的離體鑒定方法對篩選抗性品種非常重要。

本研究選用對紅斑病抗性較強的魯菏紅和抗性較弱的趙粉作為試驗材料，通過離體葉片接種病原菌和活體植株噴施病原菌，調(diào)查病情指數(shù)的大小來反映抗病性強弱。本試驗結(jié)果表明，在濃度為5×10⁴、2×10⁵、5×10⁵孢子/mL處理下2個品種表現(xiàn)出明顯差異，與活體鑒定中得出的結(jié)論一致，這說明離體鑒定所選擇的濃度范圍是合適的，也說明離體鑒定方法的可行性。在其他一些物種中也有離體與活體鑒定結(jié)果一致的報道，如趙志祥對水稻抗瘟性離體鑒定結(jié)果與常規(guī)的活體鑒定結(jié)果高度一致，黃振濤等報道小麥品種在抗稈銹病的離體鑒定方法與活體鑒定結(jié)論一致。然而，宋維富等發(fā)現(xiàn)小麥稈銹病離體與活體鑒定在個別品種上不完全一致。

在受病原菌侵染后，抗感品種的生理生化大部分具有差異。余文英等在甘薯抗瘡痂病的研究中發(fā)現(xiàn)，感病品種的MDA上升幅度遠高于抗病品種。本研究中受枝孢霉菌侵染的牡丹葉片中無論是MDA還是H₂O₂的含量，趙粉均顯著高于魯菏紅。在牡丹藏枝紅受病原菌Cylindrocladium caller-dense侵染后也觀察到MDA和H₂O₂的含量升高的現(xiàn)象。柯玉琴等在研究煙草青枯病的MDA和H₂O₂含量時結(jié)果相似。然而江彤等研究卻表明，在接種病原菌后抗性強的煙草品種MDA含量明顯高于感病品種，這也許與寄主和病原的不同以及取材時間的不同有關系。

本研究中創(chuàng)建了牡丹紅斑病的離體葉片鑒定法，在便于控制環(huán)境的條件下方便地鑒定品種抗紅斑病的強弱，而且感病后MDA含量的變化也可作為抗病性強弱的參考，因此本研究結(jié)果可為牡丹抗病性的鑒定和抗病品種的篩選提供參考。