2，3，7，8—四氯二苯并—p—二惡英對建鯉肝組織損傷作用研究

杜金梁　曹麗萍　賈睿　劉英娟　趙才源　申玉金　丁煒東　殷國俊

摘要：利用精密肝切片培養(yǎng)技術研究2，3，7，8-四氯二苯并-p-二惡英（TCDD）對建鯉肝組織的損傷作用，將精密肝切片組織分為5個處理組，每個處理組4個重復，將不同濃度TCDD（濃度設定為0.00、0.05、0.10、0.30、0.60μg/L）處理肝切片3 h后，收集上清培養(yǎng)液及肝切片組織測定丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（sOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）、三磷酸腺苷（ATP）等生化指標含量變化。結(jié)果表明：TCDD濃度在0.30μg/L時，對精密肝切片組織損傷較大，可以顯著提高上清培養(yǎng)液中GPT、GOT、MDA的含量，顯著提高切片勻漿上清液中LDH的活性值，與空白對照組相比，差異極顯著（P<0.01）；可以顯著降低切片勻漿上清液中ATP、GSH-PX的含量，與空白對照組相比，差異極顯著（P<0.01）；顯著降低上清培養(yǎng)液中SOD活性值，與空白對照組相比，差異顯著（P<0.05）。這說明采用TCDD進行急性染毒后，可以造成建鯉肝組織的損傷，使機體組織處于氧化應激狀態(tài)，產(chǎn)生一系列氧化應激反應。

關鍵詞：2，3，7，8-四氯二苯-p-二惡英（TCDD）；精密肝切片；建鯉；毒性機理

中圖分類號：S941.8 文獻標志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0248—03

二惡英為三環(huán)芳香族化合物，是一類多種化合物的統(tǒng)稱，能夠持續(xù)危害自然界環(huán)境和生物體。而2，3，7，8-四氯二苯-p-二惡英（TCDD）是其中毒性最強的一類物質(zhì)，目前關于TCDD的研究主要涉及自然界環(huán)境以及哺乳動物方面，涉及到魚類的研究相對較少。在水產(chǎn)方面報道主要有黃金華等對2，3，7，8-四氯二苯并-p-二惡英（TCDD）對魚類功能基因表達的研究，許友卿等對2，3，7，8-四氯二苯并-p-二惡英對魚類生長的影響，關于TCDD對魚類肝組織受TC-DD損傷的研究鮮有報道。魚類對水體污染較敏感，魚組織吸收了污染物TCDD后會影響其許多生理和生化作用，且TCDD進入機體后首先是在肝臟進行解毒和生物轉(zhuǎn)化，機體肝臟是一個重要的解毒器官。由于TCDD的毒性強、危害大，關于其毒性機理尚未弄清，難以防治，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來較大的負面影響。因此，一方面應該積極防止和減少TCDD的產(chǎn)生和污染，另一方面努力深入研究TCDD的毒性及其機制，為防治TCDD毒害提供技術依據(jù)。

目前，有很多毒物可以引起機體的氧化應激反應，但TCDD是否會引起魚類肝組織的氧化應激反應尚不清楚，因此本研究以建鯉為試驗材料，利用不同濃度TCDD處理建鯉肝組織切片，來研究TCDD對魚類肝組織的毒害作用，為以后研究TCDD對魚類毒害機制研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗魚 試驗用建鯉取自中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心漁場，體質(zhì)健康、無傷，取回后將建鯉于循環(huán)水系統(tǒng)中暫養(yǎng)1周。

1.1.2試劑和儀器 L15培養(yǎng)基、HBSS（Hanks，balanced sault solution）溶液、慶大霉素和兩性霉素B（購自美國SIGMA公司）；新生小牛血清（FCS）（浙江天杭生物科技有限公司）和細胞培養(yǎng)板（GIBCO公司）；2，3，7，8-四氯二苯-p-二惡英（廈門慧嘉生物科技有限公司）；GPT、GOT、LDH、GSH-PX、ATP、MDA和SOD測定試劑盒（南京建成生物工程研究所科技有限公司）；MS一222麻醉劑（購自美國SIGMA公司）；723分光光度計（上海欣茂儀器有限公司）；酶標儀MK3（美國Thermo公司），KD-400切片機（購自浙江金華科迪儀器有限公司）。

1.2方法

1.2.1建鯉精密肝切片的制備 選取健康無病體質(zhì)量在800～1 500 g的建鯉來進行試驗，采用MS-222麻醉。無菌采取肝臟后放人冷的L15培養(yǎng)基中（50μg/ml慶大霉素和2.5 mg/mL兩性霉素B），修整肝組織塊，選取5 mm×5 mm的肝組織塊來進行切片，切片厚度為300μm，選取完整切片置于24孔培養(yǎng)板中，每組4孔，每孔6片，置于27℃、5%體積分數(shù)CO₂條件下培養(yǎng)備用。

1.2.2 TCDD誘導精密肝切片損傷模型制備 將獲得的精密肝切片預培養(yǎng)30 min后，棄掉培養(yǎng)液換用含不同濃度（0.00、0.05、0.10、0.30、0.60μg/L）的TCDD進行處理，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。然后收集上清培養(yǎng)液以及肝切片進行GOT、GPT、LDH、GSH-PX、MDA、SOD等指標測定。

1.2.3 ATP含量的測定 收集不同濃度（0.00、0.05、0.10、0.30、0.60μg/L）TCDD處理的精密肝組織切片來進行ATP含量的測定，具體操作方法參照試劑盒說明書。

1.2.4建鯉精密肝切片上清培養(yǎng)液中SOD、GPT、MDA、GOT的測定 將收集精密肝切片上清培養(yǎng)液按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書操作方法進行各項指標測定。

1.2.5精密肝組織切片勻漿上清液中LDH和GSH-PX含量的測定 收集肝組織切片進行勻漿液制備，按照切片質(zhì)量與生理鹽水1：9比例制備成10%的組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液用于LDH和GSH-PX的測定。

1.2.6統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)均用SPSS 16.0軟件進行處理。采用One-Way ANOVA檢驗法進行顯著性分析，結(jié)果以平均值±標準差表示，對樣本間進行t檢驗，以P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2結(jié)果與分析

2.1 TCDD對精密肝組織切片活力的影響

由圖1可知，加入不同濃度的TCDD后，ATP含量呈下降趨勢，且隨著藥物濃度的不斷加大，其含量下降越明顯，TCDD濃度在0.30、0.60μg/L時，與空白對照組相比差異極顯著（P<0.01）。

2.2 TCDD對精密肝切片培養(yǎng)液中GPT、GOT活性的影響

由圖2-A可知，切片經(jīng)過TCDD處理，GPT活性值明顯升高，其濃度在0.10、0.60μg/L時，GPT活性值與空白對照組相比顯著升高（P<0.05）；TCDD濃度在0.30μg/L，GPT活性值與空白對照組相比極顯著升高（P<0.01）。由圖2-B可知，在TCDD濃度達到0.30μg/L時，GOT活性值與空白對照組相比極顯著升高（P<0.01）。

2.3 TCDD對精密肝切片勻漿上清液中LDH活性的影響

由圖3可知，LDH活性值有隨著藥物濃度增加而升高趨勢，TCDD濃度在0.10μg/L時，LDH活性值與空白對照組相比顯著升高（P<0.05）；TCDD濃度達到0.30μg/L時，LDH活性值與空白對照組相比極顯著升高（P<0.01）。

2.4 TCDD對精密肝切片培養(yǎng)液中SOD、MDA含量的影響

由圖4可知，TCDD處理后的SOD活性值呈降低趨勢，當濃度在0.30μg/L時，SOD活性值與空白對照組相比顯著降低（P<0.05）；當濃度在O.60μg/L時，SOD活性值與空白對照組相比極顯著降低（P<0.01）。TCDD處理后的MDA含量呈升高趨勢，有隨著濃度加大其含量不斷增加趨勢，TCDD濃度在0.10、0.30μg/L，MDA含量與空白對照組相比極顯著增加（P<0.01）。

2.5 TCDD對精密肝切片勻漿上清液中GSH-PX含量的影響

由圖5可知，經(jīng)過TCDD處理后，隨著TCDD濃度的加大，其活性值在不斷下降，在TCDD濃度為0.30、0.60μg/L時，GSH-PX含量與空白對照組相比極顯著降低（P<0.01）。

3討論

精密肝切片培養(yǎng)技術是一種介于器官和細胞之間的試驗手段，由于具有制片相對簡單、能保證組織完整性等特點，此項技術被國內(nèi)外廣泛應用于藥物篩選過程中，但精密肝切片技術也有它自身的缺點，不如肝細胞培養(yǎng)時間長。對水產(chǎn)動物而言，國內(nèi)外沒有應用魚類肝精密組織切片技術來研究TCDD損傷機制的報道，本實驗室成功研制了魚類精密肝切片培養(yǎng)技術，為以后了解藥物對魚類肝組織損傷研究提供了一種新的技術手段。

有相關報道稱TCDD可以促使機體發(fā)生氧化應激反應，如使脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量增加，抗氧化酶指標SOD、GSH-PX等活力下降。經(jīng)過TCDD處理后所產(chǎn)生的一系列氧化應激反應具體作用機制是由于TCDD與機體內(nèi)的芳香烴受體AHR結(jié)合后，改變了一些酶的活性和蛋白質(zhì)。正常情況下，氧自由基在機體內(nèi)是不斷產(chǎn)生并不斷清除的，當遇到毒物刺激時，機體就會產(chǎn)生氧自由基，如果產(chǎn)生氧自由基過多，機體來不及進行自身代謝來消除，就會引起機體的抗氧化體系失去平衡，進而引起機體組織損傷。GOT、GPT是判定肝組織健康狀態(tài)的經(jīng)典指標，被廣泛應用到肝損傷模型的構建當中，如在本試驗中，加入不同濃度的TCDD后發(fā)現(xiàn)，肝切片上清培養(yǎng)液中GOT、GPT活性值明顯升高，這說明TCDD可以引起肝切片組織的損傷，使GOT、GPT這2個酶學指標不斷從機體中釋放出來，加重了肝組織的損傷，TCDD濃度在0.30μg/L時其活性值達到一個高點，與空白對照組相比，差異顯著（P<0.01）。當TCDD濃度達到0.60μg/L時其活性值出現(xiàn)下降的趨勢。LDH存在于機體細胞的胞質(zhì)內(nèi)，如果機體受到損傷，其含量也會發(fā)生一定的變化，在本試驗中TCDD濃度在0.10、0.30μg/L時，其活性值明顯增加，這說明切片肝組織受到了TCDD的攻擊，因而造成其數(shù)值發(fā)生變化。本試驗結(jié)果與前人結(jié)果類似。

ATP是機體內(nèi)重要的能量分子，它在機體生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用，當機體處于病理或毒物刺激時，其含量就會下降，依此來判斷機體的健康水平。在本試驗中主要應用于判定切片的活性水平，當用不同濃度TCDD處理切片組織后發(fā)現(xiàn)，ATP含量隨著藥物濃度不斷加大而逐漸降低，TCDD濃度在0.3、0.6μg/L時，其含量值最低，與空白對照組相比，差異極顯著（P<0.01），這說明隨著藥物濃度的加大，肝切片活力下降。

當機體受到自由基攻擊后就會出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化反應，MDA就是其中一個判定指標，其含量高低反映了機體受損傷程度，可以準確反映脂質(zhì)過氧化程度。而SOD、GSH-PX這2個指標屬于抗氧化酶體系，其含量變化反映的是機體抗氧化能力的高低。在本試驗中，經(jīng)過TCDD處理后，SOD、GSH-PX活性值隨著藥物濃度的增加呈逐漸降低趨勢，TCDD濃度達到0.30μg/L時，SOD、GSH-PX活性值明顯下降，與空白對照組相比，差異顯著或者極顯著（P<0.05或P<0.01）；TCDD濃度達到0.60μg/L時，SOD、GSH-PX活性值明顯下降，與空白對照組相比，差異極顯著（P<0.01）。而MDA含量隨著藥物濃度增加不斷增加，這說明建鯉肝組織損傷程度在不斷加大。通過以上指標的測定說明TCDD使精密肝切片組織處于氧化應激狀態(tài)，造成機體的損傷。

綜上所述，TCDD可以造成魚類肝組織的氧化應激反應，且在濃度為0.30μg/L時，精密肝切片組織的損傷較為嚴重，關于其具體毒性機制還有待于進一步研究。