幾種陽離子和葡萄糖對子一代達氏鱘精子活力的影響

龔進玲　柴毅　羅靜波

關鍵詞：達氏鱘；子一代；精子活力；陽離子；葡萄糖

中圖分類號：S965.215 文獻標志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0257—03

達氏鱘（Acipenser dabryanus Dumeril）隸屬鱘形目、鱘科、鱘屬，為我國較大型淡水經濟魚類，現主要分布于金沙江下段和長江上游干流。由于過度捕撈、水體污染以及水利工程建設等諸多因素，導致生態環境遭到嚴重破壞，野生種群資源不斷下降，達氏鱘的分布區逐漸縮小。于1996年被國際自然保護聯盟（IUCN）列入紅皮書中，并被評為國家一級野生保護動物。2007年成功獲得子二代達氏鱘魚苗之后，達氏鱘規模化全人工繁殖也取得重大突破。目前達氏鱘的報道較少且不系統，主要包括消化系統、池塘養殖、分子進化、形態結構等方面。

魚類精子活力與水環境（鹽度、溫度、pH值、滲透壓、離子）、親魚激素水平及繁殖季節等因素有關，這也是魚類精子生理特性與環境相適應的結果。在魚類繁育中，精子活力能反映精液質量并預測受精率，因此研究精子生物學是非常必要的，并且可為精子冷凍保存提供理論依據，進一步優化冷凍程序。本試驗通過對子一代達氏鱘精子生物學的研究，探討精子與陽離子及葡萄糖之間的關系，可對現行達氏鱘淡水人工養殖技術有積極指導作用，還可為提高全人工繁殖的受精率以及以后該魚的精子稀釋液和保存液的配制提供科學理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1人工蓄養子一代達氏鱘親本 達氏鱘親本是由四川宜賓珍稀水生動物研究所經野生中華鱘人工繁殖所獲得的子一代個體。2006年運輸至中國水產科學院長江水產研究所中華鱘繁育基地培育，于2013年4月11—16日實施人工繁育，共催產2尾雄魚和2尾雌魚。

1.1.2精子獲得 利用B超對達氏鱘性腺發育進行監測，并篩選成熟親鱘開展人工繁殖催產。采用一針注射法對子一代達氏鱘催產，注射LHRH-A₂催產劑12 h后分6批次采集精液，合計采精量300 mL。所獲得的精液裝入干燥潔凈的雙層塑料保鮮袋中，充入純氧氣后放入4℃冰箱中冷藏保存，每4 h換氣1次。

1.1.3試驗溶液的配制 各試驗溶液濃度梯度設置見表1。

1.2試驗方法

精子的活力測定方法參照嚴安生等的分級標準。本次試驗測量快速運動時間和壽命，即激液與啟動液混合開始，視野中70%以上的精子轉入慢速運動為止，為快速運動時間（fast movement time，以下簡稱FT）。精子激活開始到95%以上的精子停止顫動所經歷的時間，為壽命時間（life time，以下簡稱LF）。每個濃度的溶液中同一樣本精子活動情況的觀測重復3次，最后結果取平均值。

1.3統計分析

試驗數據用SAS V8.02統計軟件進行統計分析。

2結果與分析

2.1 NaCl溶液對子一代達氏鱘精子活力的影響

NaCl溶液對子一代達氏鱘精子活力的影響見圖1。隨著NaCl溶液濃度升高，LT不斷上升。在NaCl濃度為0.25%時LT最長，為219.67 s。而后隨著濃度升高急速下降。精子FT呈上升趨勢，其峰值（66.67 s）出現在濃度為0.20%時，當濃度大于0.20%后FT逐漸下降。

方差分析結果表明，NaCl濃度為0.20%時的FT與其他濃度之間差異顯著（P<0.05）。NaCl濃度為0.25%時LT與其他濃度之間差異顯著（P<0.05）。

2.2 KCl溶液對子一代達氏鱘精子活力的影響

不同濃度KCl溶液對子一代達氏鱘精子活力的影響見圖2。子一代達氏鱘精子對K⁺含量變化非常敏感。LT與FT變化規律相似，隨著KCl溶液濃度升高，LT和FT呈逐漸上升的狀態，在其濃度為0.000 4%時，LT、FT分別達到124.67、52.67 s。當KCl溶液濃度超過0.000 4%后子一代達氏鱘精子LT和FT急速下降。

方差分析結果表明，KCl濃度為0.000 4%時的FT、LT與其他各濃度組之間差異顯著（P<0.05）。0.010 0%、0.001 2%、0.001 4%、0.001 6%KCl溶液濃度組所對應的LT之間無顯著性差異（P>0.05）。

2.3 CaCl₂溶液對子一代達氏鱘精子活力的影響

不同濃度CaCl₂溶液對子一代達氏鱘精子活力的影響見圖3。隨著CaCl2濃度逐漸增加，LT和FT呈上升趨勢，至濃度為0.10%時均達到最高值，分別為113.67、28.67 s。當CaCl₂溶液濃度達到0.30%時，精子活力明顯受到抑制，大多數只是微微顫動，極少數緩慢游動。

方差分析結果表明，CaCl₂濃度為0.30%、0.40%和0.45%時，所對應的FT無顯著性差異（P<0.05），0.10%CaCl₂濃度組所對應的Fr、TJT與其他各濃度組之間存在顯著性差異（P<0.05）。

2.4 MgCl₂溶液對子一代達氏鱘精子活力的影響

不同濃度MgCl2溶液對子一代達氏鱘精子活力的影響見圖4。隨著MgCl2濃度不斷上升，精子LT、FT開始不斷上升。濃度為0.30%時精子LT最長，為102 s；FT也最長，為25 s。而后隨著MgCl₂溶液濃度的上升呈明顯下降趨勢。

方差分析結果表明，MaCl₂濃度為0.30%時FT與其他濃度組之間差異顯著（P<0.05）。0.25%和0.40%MgCl2濃度組所對應的LT無顯著性差異（P>0.05），濃度為0.30%時所對應的LT與其他各濃度組之間存在顯著性差異（P<0.05）。

2.5葡萄糖溶液對子一代達氏鱘精子活力的影響

由圖5可知，子一代達氏鱘精子在不同濃度葡萄糖溶液中活力存在明顯差異。隨著葡萄糖溶液濃度逐漸增加，TJT和FT呈緩慢趨勢延長，在濃度為0.60%時活力明顯增加，當葡萄糖濃度達到0.70%時LT、FT最長，分別為259、74.67 s。而后隨著濃度升高其活力呈下降趨勢。

方差分析結果表明，0.70%葡萄糖濃度組所對應的FT與其他各組之間存在顯著性差異（P<0.05）。0.20%、0.60%、0.70%葡萄糖濃度組所對應的LT之間無顯著性差異（P>0.05），其中，0.70%濃度組所對應的LT達到峰值。

3討論

3.1 NaCl、KCl溶液對精子活力的影響

魚類精子在精巢和等滲溶液中是不運動的，但是卻存在著極強的潛在活動能力。排出體外的精子一旦與水或非等滲溶液相結合便會激烈運動，即激活。精漿與外部介質具有差異性，體現在離子組成成分和滲透壓上。魚類精子的抑制與激活機制與種類有關，其活力與精子對離子和滲透壓的敏感程度有關。Morisawa等表明鮭科（Salmonidae）魚類精漿中高出血漿數倍的K⁺是抑制精子運動的因素，而精漿中K⁺含量是血漿的18～29倍的鯉科（Cyprinidae）魚類，其K⁺含量不阻止精子運動，反而能提高精子運動速度。鱘魚類精子的敏感性由精漿的成分和Na⁺含量決定。離子對不同魚類精子的影響效果具有很大差異，研究理化因子對子一代達氏鱘精子活力的影響對現行人工繁殖技術的指導十分必要。

Na⁺是魚類精漿重要組成成分和構成滲透壓的主要離子。胭脂魚（Myxocyprinus asiaticus）精子在0.60%NaCl濃度時快速運動時間最長；0.30%NaCl能延長翹嘴紅鲌（Erythroculter ilishaefor）精子快速運動時間；劉鑒毅等發現中華鱘（Acipenser sinensis Gray）精子在0.10%NaCl溶液中快速運動最長。本試驗中測得子一代達氏鱘精子在NaCl溶液濃度為0.25%時壽命時間最長，在0.20%時陜速運動時間最強，兩者變化規律相似。

鱘魚類精子對K⁺濃度的變化最為敏感。從西伯利亞鱘（Acipenser baerii Brandt）、湖鱘（Acipenser fulvescens）和中華鱘精子在K⁺濃度變化中發現鱘魚類精子對低濃度K⁺的敏感性極強，但活力可受低濃度K⁺調控。Alavi等研究表明K⁺是抑制鱘魚類精子在精漿中活動的主要因子。本試驗發現當K⁺濃度大于0.000 4%時精子壽命時間和快速運動時間逐漸縮短，說明高濃度的K⁺對精子有明顯的抑制作用，而K⁺含量只有低于精漿濃度時才能增強精子活力，延長壽命時間。

NaCl、KCl對精子活力的影響都表現在滲透壓方面。當精子在水中活動時，內外滲透壓的差距促使精子調節平衡，從而消耗大量的自身能量。若將精子處于等滲溶液中，必然會使存活時間明顯延長，原因在于調節滲透壓時所用的能量轉用于維持其生命活動。因此，在人工繁殖過程中配制與親本滲透壓相當的稀釋液，對提高精子受精率、增加漁業產量有重要意義。

3.3葡萄糖對精子活力的影響

葡萄糖、半乳糖、果糖是精漿的重要成分碳水化合物中主要成分。Gardiner認為體外授精的魚類精子可利用細胞外源性營養物質為精子運動提供能量。已有研究表明，適宜的葡萄糖濃度可明顯延長白斑狗魚（Esox lucius）、高白鮭（Coregouns peled）及中華鱘精子的活動時間。在本次試驗中，可以看出葡萄糖在適宜濃度時有延長子一代達氏鱘精子壽命的作用，這與上述研究觀點一致。表明子一代達氏鱘精子可以利用外源性葡萄糖補充在整個運動活動中所消耗的能量，從而提高精子壽命時間。

3.4本研究的局限性

精子活力能較準確地預測受精率，而精子受精率的大小直接影響人工繁殖效果，但會受到水環境的影響。本試驗對子一代達氏鱘精子在幾種離子和葡萄糖下活力影響進行初步試驗，未對其授精效果進行研究，其合適的人工授精激活液濃度未知，可在以后的研究中進行探討。