蓖麻蠶對辛硫磷農藥的代謝抗性機制

陳立華　張月華　錢荷英　孫平江　李剛　徐安英

摘要：將40%辛硫磷原液稀釋成35～70 mg/L濃度區間的8個濃度梯度，采用浸葉法測定了辛硫磷對于5齡第3天蓖麻蠶（Philosamia cynthia ricini）24 h的半致死濃度（LCso），計算出40%辛硫磷乳油對蓖麻蠶的LC₅₀（24 h）為51.81 mg/L。用實時熒光定量PCR（RT-qRCR）方法檢測添食50 mg/L辛硫磷后蓖麻蠶乙酰膽堿酯酶基因Pcracel、Pcrace2在不同組織（血液、脂肪體、中腸、絲腺、頭）中的表達變化，結果顯示：在添食辛硫磷之后，Pcracel、Pcrace2在各組織中的表達都有變化，其中Pcracel在頭部、脂肪體的轉錄表達量分別比對照組高10.66、26.50倍；Pcrace2在頭部、脂肪體的轉錄表達量分別比對照組高24.73、14.56倍；Pcracel、Pcrace2表達量在中腸、絲腺中的變化不大，上調的倍數分別是7.65、5.62與3.44、2.34倍；Pcracel、Pcrace2在血液中幾乎無表達變化，表達變化倍數分別為2.52、1.11倍。結果表明，Pcracel、Pcrace2主要在脂肪體、頭部發揮代謝解毒作用，而中腸、絲腺等組織對農藥辛硫磷的代謝解毒作用較小，血液幾乎不參與解毒作用。

關鍵詞：蓖麻蠶；辛硫磷；半致死濃度（LC₅₀）；代謝解毒；乙酰膽堿酯酶基因（ace）

中圖分類號：S885.22 文獻標志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0264—03

蓖麻蠶（Philosamia cynthia ricini）原產于印度，是大蠶蛾科樗蠶的一個亞種，以蓖麻葉、椿樹葉及木薯葉為主要飼料，在我國廣西、江蘇、內蒙以及印度、泰國等東南亞國家進行飼養，是絹絲生產的重要蠶品種之一。辛硫磷是一種以觸殺、胃毒為主的高效低毒有機磷殺蟲劑，因其具有殺蟲廣譜性和無內吸作用，廣泛應用于小麥、玉米、水稻、棉花、桑樹等作物的多種鱗翅目害蟲的防治。但是在對木薯、蓖麻等作物害蟲進行防治的過程中，由于對藥物濃度、殘留期等把握不好，蓖麻蠶農藥中毒的情況時有發生，導致蠶農養蠶絕收或蠶繭質量、產量下降，養蠶戶出現較大的經濟損失，成為蓖麻蠶產業發展的阻力。

乙酰膽堿酯酶是昆蟲靶標抗性作用靶標之一，為有機磷、氨基甲酸酯類殺蟲劑的作用靶標，乙酰膽堿酯酶的突變和超表達是昆蟲抵抗殺蟲劑的重要方法，國內外已有許多相關報道。王舉梅等對家蠶添食辛硫磷前后2種乙酰膽堿酯酶基因（ace1、ace2）的轉錄特征進行了研究，結果表明：在正常的家蠶中，ace1在各組織中表達量差異很大，在腦組織中高量表達，在其他所有組織中只有微弱的表達；而ace2在各組織中的表達量差距不大，在中腸、絲腺和血淋巴中相對表達量較低，在脂肪體、卵巢中相對表達量較高。劉芳等已發現乙酰膽堿酯酶不敏感的果蠅、家蠅、埃及伊蚊等抗性昆蟲。目前關于蓖麻蠶在靶標抗性解毒酶分子水平的研究報道很少。本研究根據《化學農藥環境安全評價試驗準則》推薦的浸葉法測定辛硫磷對蓖麻蠶5齡第3天24 h的半致死濃度（LC₅₀），并采用實時熒光定量PCR（RT-qRCR）方法檢測添食辛硫磷后乙酰膽堿酯酶基因在不同組織（血液、脂肪體、中腸、絲腺、頭）中的表達變化，以期為蓖麻蠶抗藥性研究提供基礎，也為害蟲的防治提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料與藥劑

供試農藥：40%辛硫磷乳油，連云港立本農藥化工有限公司生產。供試蓖麻蠶品種：海藍（B7）品種，由中國農業科學院蠶業研究所提供，用常規方法催青，飼養至5齡第3天，選取發育一致的正常蓖麻蠶幼蟲個體。供試蓖麻葉：由中國農業科學院蠶業研究所試驗場提供，采摘未施用農藥的新鮮5齡蓖麻葉。

1.2菌種與試劑

大腸桿菌DH5a感受態細胞，由筆者所在課題組制備。PrimeScrip RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、SYBR Premix Ex Taq^TMⅡ（Tli RNaseH plus）、pMD19-T Simple Vector等，購自大連寶生物工程公司。TRIzol試劑，購自Promega公司。

1.3辛硫磷對蓖麻蠶LC₅₀的測定

采用浸葉法測定辛硫磷對蓖麻蠶5齡第3天24 h的LC₅₀。參照農藥公司推薦的使用濃度和預試驗測定的24 h蓖麻蠶全部死亡和全部存活的濃度，正式試驗在此濃度范圍內重新設定濃度，以蒸餾水浸泡蓖麻葉為對照。將40%辛硫磷原液分別稀釋成35、40、45、50、55、60、65、70 mg/L，共8個濃度梯度。將蓖麻葉切成1 cm²左右的方片，在辛硫磷配制液中浸泡10 s，自然晾干后供蓖麻蠶食用。采用添食毒蓖麻葉1g/頭的標準，取飼養20頭5齡第3天蓖麻蠶為1個試驗組，每個濃度3次重復，共計60頭。將喂食添加辛硫磷農藥后的蓖麻蠶置于溫度為25℃、相對濕度80%的環境中飼養，24 h后觀察并記錄中毒情況及死亡數。

采用Abbott公式計算添食辛硫磷后蓖麻蠶的死亡率，當對照組死亡率為0時，試驗組死亡率=[（試驗蠶數-藥后活蠶數）/試驗蠶數]×100%；當對照組死亡數<10%時，試驗組死亡率=[（試驗組死亡率-對照組死亡率）/（1-對照組死亡率）]×100%。在Excel中計算出辛硫磷對蓖麻蠶的毒力回歸方程和半致死濃度。

1.4蓖麻蠶乙酰膽堿酯酶基因的克隆