傳統發酵食品中產細菌素乳酸菌的篩選與鑒定

胡彥新　李清　王英　劉小莉　董明盛　周劍忠

摘要：從侗族酸肉、貴州酸湯、苗族酸魚等傳統發酵食品中分離63株乳酸菌，通過瓊脂擴散牛津杯法從中篩選出M-M₄、SS₂-6、SR₄-1這3株對指示菌均具有明顯抑菌作用的菌株。3株菌株經排除有機酸和過氧化氫作用、胰蛋白酶和胃蛋白酶發酵處理、70%硫酸銨沉淀發現，這3株菌株經排除有機酸和過氧化氫作用仍具有一定的抑菌活性；用胰蛋白酶和胃蛋白酶處理，菌株活性消失；經硫酸銨沉淀的鹽析液抑菌能力明顯增大。通過形態學觀察、生理生化試驗和16S rRNA序列分析方法，鑒定這3株菌株分別是香腸乳桿菌、乳酪短桿菌、植物乳桿菌。

關鍵詞：發酵食品；乳酸菌；細菌素；硫酸銨沉淀；篩選鑒定

中圖分類號：TS201.3 文獻標志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0276—03

細菌素是一類在細菌代謝過程中通過核糖體合成機制產生、具有抑菌活性的蛋白質或多肽，一般只對親緣關系較近的細菌有毒害作用，對自己產生的細菌素具有自身免疫性。乳酸菌是公認的安全微生物和益生菌，在許多食品發酵中廣泛應用，歷史長達幾千年。乳酸菌素是乳酸菌產生的一類蛋白類抑菌物質，可以改善腸道生態，對動物無毒性，易被人體消化道中的蛋白酶降解，不會在體內蓄積而引起不良反應，被認為是一種具有廣闊應用前景的天然食品防腐劑和飼料添加劑。目前，研究最為深入的是乳球菌乳酸亞種所產細菌素Nisin，現已被60多個國家廣泛應用于乳制品和罐頭制品等的保藏。

近年來，發現的新型細菌素種類繁多，但對其進行深入研究的很少，而投入生產的更是少之又少，對新型細菌素的研究和開發顯得尤為重要。為獲得結構新穎、抑菌活性更為穩定的細菌素，國內外學者從當地傳統的發酵食品中，尤其是發酵肉制品中進行產細菌素乳酸菌的分離篩選。如De Carvalho等從意大利Salami香腸中分離到1株能抑制李斯特氏菌的乳酸菌；Noonpakdee等從泰國傳統發酵香腸Nham中分離到1株產Nisin的乳酸乳球菌；而我國學者則多從四川臘肉香腸、宣威火腿、泡菜、傳統乳制品等發酵食品中分離得到產細菌素的乳酸菌。

本試驗以侗族發酵酸肉、貴州酸湯和苗族酸魚等傳統發酵食品中分離出的63株乳酸菌為材料，采用瓊脂擴散牛津杯法對產細菌素乳酸菌進行篩選，利用16S rRNA序列分析法進行乳酸菌鑒定，以期從原生態的發酵食品中篩選出有益的乳酸菌，對充分挖掘本地傳統發酵食品中的乳酸菌資源具有一定的理論和實踐意義，為生魚保鮮和食品生物防腐提供優質菌種資源。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株 63株供試乳酸菌分離于苗族酸魚、侗族酸肉、貴州酸湯等傳統發酵食品中；3種指示菌分別為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙門氏菌（Salmoaella）、志賀氏菌（Shigella），均來源于江蘇省農業科學院農產品加工研究所微生物實驗室。

1.1.2培養基與主要試劑 培養基主要有MRS培養基、LB培養基、YPD培養基、糖發酵培養基等；胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，均由美國Sigma公司生產；NaOH、HCl，均為分析純。

1.1.3主要儀器與設備 JY 502電子天平、SX-500型立式電熱壓力滅菌鍋、SW-CJ-2G型雙人單面凈化工作臺、LRH-150型生化培養箱、THZ-98型臺式恒溫振蕩器、SIGMA 3K15高速冷凍離心機、PB-20型pH計、722S型可見分光光度計、85-2型磁力攪拌器、HH-6型數顯恒溫水浴鍋、電熱恒溫鼓風干燥箱、游標卡尺等。

1.2方法

1.2.1乳酸菌的活化及發酵上清液的制備 將63株乳酸菌分別接種于液體MRS培養基中，37℃培養16～18 h；傳代培養2次，以2%接種量接種于MRS液體培養基中，37℃培養24 h；發酵液經10 000 r/min、4℃低溫冷凍離心10 min，收集上清液，置于4℃保存。

1.2.2指示菌的培養及菌懸液的制備 將金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌3種指示菌傳代1次，保存于4℃冰箱。使用前，將其接種于LB液體培養基，傳代2次，每次均于37℃、120 r/min培養16 h。

1.2.3抑菌活性的測定 采用瓊脂擴散牛津杯法測定乳酸菌發酵上清液的抑菌活性。將指示菌發酵液用冷卻至40～50℃的LB半固體培養基稀釋至10⁶～10⁷CFU/mL，倒平板；待培養基凝固，用無菌鑷子將滅菌的牛津杯從凝固好的培養基中輕輕拔出；乳酸菌發酵上清液用0.22μm濾膜過濾以去除雜菌；在用牛津杯打好的孔中分別注入150μL發酵上清液和鹽析液，4℃冰箱中滲透擴散5 h，37℃培養箱中靜置培養24 h，觀察并測量抑菌圈大小。設3個平行試驗，求均值；下同。

1.2.4有機酸抑菌作用排除試驗 將培養好的發酵液，用1 moL/L氫氧化鈉溶液調pH值為6.0，以金黃色葡萄球菌為指示菌進行抑菌試驗。

1.2.5過氧化氫抑菌作用排除試驗 用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl將發酵上清液調至過氧化氫的最適作用pH值7.0；將發酵上清液用1 mol/L過氧化氫酶于37℃水浴1 h，將pH值調回對照pH值，以未經酶處理的發酵上清液作為對照，進行抑菌試驗。

1.2.6蛋白酶敏感試驗 將胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶分別加入試驗菌株的發酵上清液中，使其終濃度為1 mg/mL；調節pH值至各酶的最適作用范圍，37℃水浴2 h；取出，再將pH值調回至6.0，進行抑菌試驗。

1.2.7細菌素的硫酸銨分級沉淀 在等量發酵上清液中分別加入固體硫酸銨，使其飽和度分別為40%、50%、60%、70%、80%，振蕩過夜；10 000 r/min、4℃離心10 min，收集沉淀，用pH值為6.0的磷酸緩沖液溶解；離心，超濾濃縮，進行抑菌試驗，指示菌為金黃色葡萄球菌和沙門氏菌。

1.2.8產細菌素乳酸菌的鑒定 MRS瓊脂平板上觀察菌落形態，革蘭氏染色觀察菌體形態；各生理生化指標測定參照《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》《微生物學實驗》及《伯杰細菌鑒定手冊》進行，主要包括過氧化氫酶試驗、甲基紅試驗、乙酰甲基甲醇（VP）試驗、石蕊牛奶試驗、淀粉水解試驗、葡萄糖產酸試驗和糖發酵試驗等；16S rRNA遺傳學鑒定方法參照文獻[14]進行。

2結果與分析

2.1產細菌素乳酸菌的篩選

通過瓊脂擴散牛津杯法確定63株乳酸菌中有24株菌株的發酵上清液對3種指示菌有抑制作用，其中有7株菌株對3種指示菌均具有抑菌作用。由表1可見，篩選出的7株菌株對金黃色葡萄球菌的抑菌效果相對最好；對3種指示菌抑菌效果較好的菌株有M-M₄、SS₂-6、SR₄-1。

2.2有機酸、過氧化氫作用的排除

由表2可見，排除有機酸、過氧化氫作用，菌株M-M₄、SS₂-6、SR₄-1仍有一定的抑菌作用，說明這3株乳酸菌對指示菌的抑制作用不單純是由有機酸、過氧化氫引起的，可能由于其在代謝過程會產生其他抑菌物質。

2.3蛋白酶檢測抑菌物質的蛋白質性質

排除有機酸和過氧化氫對指示菌的抑制作用后，為進一步確定抑菌物質是否具有蛋白質性質，本試驗用胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶對發酵液進行處理，用其發酵液進行抑菌試驗，檢測抑菌能力是否降低。結果表明，細菌素對胰蛋白酶、胃蛋白酶特別敏感，其菌株發酵上清液的抑菌效果基本消失；對木瓜蛋白酶、糜蛋白酶則較為穩定，抑菌圈直徑沒有明顯變化。結果說明這2株菌株產生的抑菌物質主要為蛋白質。

2.4硫酸銨沉淀和最佳沉淀濃度的確定

試驗結果表明，隨著硫酸銨濃度的增加，3株菌株的鹽析液對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌都有抑制能力（表3）且逐漸增大，用70%、80%硫酸銨沉淀的鹽析液對其指示菌的抑菌能力相差無幾。因此，確定硫酸銨沉淀的最佳濃度為70%。

2.5產細菌素乳酸菌的鑒定