黑曲霉不同極性分離產物的抗真菌及抗氧化能力

郭博愷　李祝　萬科　李玉環　劉芳　叢銘　胡坤　岳大歷　葛永怡

摘要：進行了以從患有冠癭病的葡萄樹根際土壤中分離獲得的1株黑曲霉Ⅺ用于抑制齊整小核菌的試驗。其中超臨界萃取段、水提醇沉段以及正丁醇段表現出較好的抑制效果。抑制率分別達到了93.22%、74.11%、79.67%。被抑制的菌絲出現了膨大、畸形、原生質聚集等現象，菌落大小也隨著平板含待測樣品的不同而不同。在測定電導率時，發現其隨著藥量濃度增高而增大，表明黑曲霉對齊整小核菌的細胞膜有較強的影響。另外還分別用DPPH法和ABTS法考察了黑曲霉不同極性分離產物的抗氧化能力。

關鍵詞：黑曲霉；白絹病；生物防治；抗氧化

中圖分類號：S432.4⁺4 文獻標志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0290—05

黑曲霉（Aspergillus niger）是生物技術應用中一種非常重要的微生物。早在1919年就被應用于工業中用來發酵檸檬酸。除了檸檬酸，黑曲霉還是果膠酶、蛋白酶和淀粉轉葡糖苷酶豐富的來源。此外，在過去的20年里，黑曲霉亦被用于生物轉化、濕法冶金和廢物處理。經黑曲霉Asp-1#與蛇紋石尾礦作用后，可將部分尾礦中的鎂浸出而生成新物質——有機酸鎂。另外在接種不同體積黑曲霉菌液的處理下，Cd、Zn等元素富集量均顯著低于空白對照處理。而黑曲霉作為一個安全的優勢發酵菌種（GRAS），運用在抗菌藥物研究與開發中的報道甚少，并且其抑制真菌病害的能力更是鮮有報道。而引起植物白絹病的齊整小核菌（Scleriti-um rolfsii）是一種在熱帶、亞熱帶地區普遍發生的植物病害病原，其寄主范圍廣，已知危害100多個科中的200多種植物，嚴重危害時，常造成作物大面積減產。所以本研究對黑曲霉抑制白絹病效果及機理進行研究，著重考察黑曲霉不同極性分離段對其抑菌能力的強弱，以及對其細胞膜的影響，旨在補充真菌病害的生防菌種庫，另外還測試了黑曲霉不同極性分離段清除自由基的能力，為新型保鮮劑的研發提供理論基礎。

1材料和方法

1.1菌株來源

黑曲霉（Aspergillus niger）XJ由貴州大學真菌資源研究所分離，保藏于中國典型培養物保藏中心，CCTCC編號：M206021。齊整小核菌（Sclerotium rolfsii Sacc.）由貴州大學真菌資源研究所分離并保藏。

1.2試劑

二苯代苦味酰基自由基（DPPH，日本東京化成工業株式會社）；2，2′-連氨-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS，日本東京化成工業株式會社）；二丁羥基甲苯（BHT，上海晶純生化科技股份有限公司）；Trolox（日本東京化成工業株式會社）；75%乙醇，95%乙醇；無水乙醇，過二硫酸鉀，正丁醇，乙酸乙酯，石油醚，葡萄糖均為分析純；瓊脂，代森錳鋅。

1.3儀器

DZG-6000電熱恒溫干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）；JHT-C超凈工作臺（上海基星生物科技有限公司）；MLS-3750型獨立式高溫高壓滅菌鍋（北京諾匯誠科技有限公司）；HPX-9082MBE電熱恒溫培養箱（江蘇省科學器材有限公司）；MGC-100P控溫光照培養箱（北京瑞爾欣德科技有限公司）；SKY-2112B雙層特大容量恒溫培養搖床（上海達平儀器有限公司）；CX31數碼生物顯微鏡（日本奧林巴斯）；UV757CRT紫外分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；TopPette移液槍（大龍科技）；DDS-307電導率儀（上海智理科學儀器有限公司）；HAl20-40-0.5超臨界萃取裝置（江蘇南通華安超臨界萃取有限公司）。

1.4發酵液粗提物不同極性樣品溶液的制備

將200 g干燥菌絲體用700 mL 75%乙醇、60℃回流2 h，濾出乙醇并重復以上步驟1次，分別用500 mL乙醇、正丁醇、乙酸乙酯等幾種極性不同的有機溶劑分2次振蕩并依次萃取，對有機相及水相分別濃縮，得到不同代謝液粗提物樣品。

乙醇提取后取剩余殘渣，加水煮沸，微沸1.5 h，合并濾液，濾液于3 000 r/min離心20 min，取上清液于噴霧干燥箱濃縮，24 h后與95%乙醇混勻，靜置24 h后抽濾，即得水提醇沉萃取段樣品。

將200 g干燥菌絲體粉末混合均勻后，取50 g作為設備清洗之用，余下150 g分2次萃取完成。萃取壓力為5 MPa，溫度為50℃，以160～200 L/h流量得15 g超臨界萃取段樣品。

1.5不同極性分離段對白絹病菌的抑制作用及IC₅₀

含藥培養基制備：將不同分離段用DMSO配制成濃度為80 mg/mL的樣品，分別取150μL加入到15 mL已融化并冷卻至60℃左右的PDA培養皿中（直徑90 mm），使其充分混勻。以加入等體積DMSO的PDA平板為對照。

采用生長速率法，從PDA上培養7 d（待其長出菌核）的白絹病菌落邊緣打取直徑6 mm的菌餅，菌絲面向下，接種于已經凝固的含藥PDA培養基中央，置于28℃恒溫培養箱內光照培養。每個處理3次重復。分別于3、5、7 d后測量供試病菌在不同樣品的含藥培養基上的菌落直徑，與對照比較計算各樣品處理對菌絲生長的抑制率。

由以上試驗得到最優的2個極性分離段，設置不同濃度梯度（0、5、15、30、45、60、75、80 mg/mL）進行試驗，根據生物統計幾率值換算表，將抑制百分率換算成抑制概率值，計算其有效中濃度IC₅₀。

1.6不同極性樣品溶液對白絹病菌細胞膜的影響

采用電導法測定2個效果最優極性分離段對病原菌細胞膜通透性的影響：在50 mL PDA培養液中接人1塊直徑為6 mm白絹病菌菌餅，于28℃下靜置培養7 d。加入效果最優極性分離段至終濃度為0、5、15、30、45、60、75、80 mg/mL，于28℃下靜置培養。分別在0、1、2、3、4、5、6 h測定培養液中電導率。

1.7抗氧化能力的測定試驗

采用DPPH方法，參照文獻[8]的方法并加以改良：取1 mL 0.1 mmol/L DPPH（乙醇為溶劑）、0.95 mL 0.05 mol/LTris-HCl緩沖液（pH值為7.4）、1 mL乙醇和50μL樣品混合30 min后在波長517 nm處常溫條件下測定吸光度，吸光度越小，其自由基清除劑的清除能力越強。計算公式為：

ABTS方法參照文獻[9]的方法并加以改良：將2.5 mL7 mmoL/L的ABTS和44μL 140 mmol/L的K₂S₂O₈溶液混合，在室溫、避光條件下靜置過夜（12～16 h），得到ABTS+儲備液。將ABTS+儲備液用磷酸鹽緩沖液（PBS緩沖液，20 mmol/L，pH值為7.4）稀釋，用分光光度計測量，使其在波長734 nm處吸光度為0.700±0.002，得到ABTS+工作液。取30μL不同濃度藥物與3.0 mL的ABTS+工作液混合，反應6 min，常溫條件下于波長734 nm處測定吸光度。抗氧化能力強弱采用Trolox當量（TEAC）來表示，即相同條件下測得的生物活性物質的抗氧化活性與Trolox的抗氧化活性作對比，由此得到的比值來反映待測生物活性物質的抗氧化能力。計算公式為：

2種方法計算得到的清除率后分別進行作圖并計算其清除率的IC₅₀值。

2結果與分析

2.1不同極性分離段對白絹病菌的抑制作用

通過不同極性分離段的抑菌性試驗后，得到3組效果最好的樣品作為梯度試驗的依據（表1）。較之其他極性分離段，超臨界萃取段（圖1-H）、水提醇沉段（圖1-E）、正丁醇段（圖1-F）抑制率在處理7 d分別達到了93.22%、79.67%、74.11%。

黑曲霉XJ不同段粗提物對白絹病菌絲生長均有不同程度的抑制作用，菌絲在含藥培養基上生長緩慢，甚至在同一濃度下比陽性對照藥代森錳鋅（80 mg/mL）的抑制能力還要強很多（圖1-B）。正常狀態下菌絲無色透明，呈空心管狀結構，有隔膜（圖2-A），呈放射狀生長，有分枝，在分枝的基部有明顯的縊縮，局部有鎖狀聯合現象（圖2-D）。經過水提醇沉萃取段和正丁醇段分別處理后，出現菌絲數量減少、直徑變粗、長度變短，出現褶皺、原生質凝潔、嚴重變形等現象（圖2-B，圖2-C）。同時還觀察到有的菌絲呈念珠狀膨大（圖2-E）。

通過設置不同濃度（0、5、15、30、45、60、75、80 mg/mL）對3種待測藥品進行濃度梯度試驗（表2～表4），通過SPSS19.0軟件計算得到超臨界萃取段、水提醇沉萃取段和正丁醇段的半抑制濃度（IC₅₀）在處理后7 d分別為6.177、71.416、19.248 mg/mL。同時發現在處理后3 d水提醇沉萃取段和正丁醇段在各濃度下均表現出較強的抑菌能力，而超臨界萃取段則在處理后7 d表現的抑菌能力最強。

2.2不同極性分離段對白絹病菌細胞膜的影響

超臨界萃取段、水提醇沉萃取段和正丁醇段對白絹病菌培養液電導率的影響見圖3至圖5。其中白絹病菌在空白對照的培養液中培養時，培養液的電導率隨時間的延長表現十分穩定。3種藥物處理后菌絲的電導率均在不同濃度下相較于空白對照有了顯著提高，且在處理3 h電導率達到頂峰，隨后呈下降趨勢。代森錳鋅處理在處理后2 h達到峰值，隨后穩步下降。

2.3抗氧化能力的測定

表5表明，在2種方法中，水提醇沉萃取段、正丁醇萃取段和超臨界萃取段均有一定的清除DPPH和ABTS自由基的能力，但相對于陽性對照還相差甚遠。水提醇沉萃取段在2種方法均體現了相對于正丁醇和超臨界萃取段更強的抗氧化能力。而超臨界萃取段在APTS法中的抗氧化能力遠強于其在DPPH法中的表現。

按照試驗方法，測得對水提醇沉萃取段、正丁醇萃取段和超臨界萃取段以及陽性對照品不同質量濃度下抗氧化數據，并通過Excel 2010軟件對其制作出抗氧化質量濃度對DPPH自由基和ABTS自由基影響的關系圖（圖6、圖7）。

圖6顯示，在試驗濃度范圍內，水提醇沉萃取段對DPPH自由基的清除率均與質量濃度呈正量效關系，即隨著質量濃度增加，對DPPH自由基的清除率也增大。當質量濃度低于45 mg/mL時，正丁醇萃取段和超臨界萃取段對DPPH自由基的清除率與質量濃度呈正量效關系，隨后繼續增加質量濃度，清除率幾乎不變。當質量濃度低于5 mg/mL時，維生素C、Trolox和BHA對DPPH自由基的清除率與質量濃度呈正量效關系，隨后繼續增加質量濃度，清除率幾乎不變。

圖7顯示，在試驗濃度范圍內，水提醇沉萃取段、正丁醇萃取段和超臨界段萃取對ABTS自由基的清除率均同樣與質量濃度呈正量效關系，即隨著質量濃度增加，對ABTS自由基的清除率也增大。而水提醇沉萃取段在60 mg/mL前幾乎以線性條件增長，其后在80 mg/mL時清除率達到了97.41%。

3討論

黑曲霉Ⅺ系從患有冠癭病的葡萄樹根際土壤中分離獲得的，與植物病原菌有相似的生態環境，生長快，且分泌抑菌物質多。筆者所在課題組前期的研究表明其發酵液對根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）和金黃色葡萄球菌（Staphylo-coccus aureus）有較強的抑制效果，本研究針對黑曲霉不同極性分離段對齊整小核菌（Sclerotium rolfsii）的抑菌活性、細胞膜通透勝以及藥物自身抗氧化能力等幾個方面做了相關的研究，為進一步完善其作用機制、明確其抑菌機理奠定了基礎。

在抑菌活性方面，通過顯微觀察，經水提醇沉萃取段和正丁醇段處理后白絹病菌菌絲生長速率嚴重減緩，菌絲出現嚴重變形、細胞內原生質凝結和菌絲頂端膨大等現象。而且黑曲霉Ⅺ不同粗提物段也表達出了抑菌能力遠強于化學農藥的能力。

目前，報道的多是殼聚糖影響真菌細胞膜通透性增加以及細胞內蛋白質、核酸等物質的外泄，但是關于黑曲霉對真菌細胞膜功能的影響還未見報道。本研究發現水提醇沉萃取段和正丁醇段處理白絹病菌絲在短時間內即會使溶液電導率變化百分率明顯提高，并且在測定3 h時達到峰值，且不同濃度均高于對照中的電導率變化百分率。當微生物處于不利環境或受到藥物毒害時，往往會導致其生物膜流動性降低和半透性喪失，此時細胞內K⁺等電解質大量外泄，而經藥物處理后，培養液電導率的升高可以反映細胞膜滲透性的改變，抑制物破壞了細胞膜的完整性，使細胞膜通透性增加，細胞質滲漏，電解質不斷滲出，導致電導率的升高可能造成細胞流動性降低，細胞內環境穩定性被破壞，從而導致原生質外滲，破壞菌體細胞，從而起到抑菌作用。但由于未對胞內蛋白和核酸等物質測定，所以不能籠統地認為其機制與殼聚糖完全相同。

食品如果受到微生物感染以及自由基的釋放會導致不飽和脂肪酸的自身氧化。而本研究發現的分離產物有與對照品相似的增強商品貨架期的長短及自由基清除能力，甚至還有抑制有害微生物的能力。針對于黑曲霉XJ 3個分離段的自由基清除能力，雖相對于對照品較弱，但黑曲霉作為一種對人體無害的優勢發酵菌種，體現出的發酵能力強、抑菌譜廣的特性是對照品無法比擬的。另外在本研究中出現了其抑菌能力與抗氧化能力呈負增長關系，可以推測分離段對白絹病菌絲有氧化作用，以提高其抑菌能力。

綜上，本研究著重對黑曲霉粗提物對白絹病菌體外的抑菌效果、細胞通透性以及藥物自由基清除能力做了基本的試驗，也部分揭示出了黑曲霉在這幾方面上的能力。但深入的研究還需在下一步的試驗中予以實踐，例如黑曲霉是否導致細胞內蛋白質、核酸等物質的外泄，以及對抑制過后的菌體超微結構下觀察等研究，這些對于完整闡述出黑曲霉的抑菌機制是十分必要的。