不同地理種源丹參根系分泌物的GC—MS比較分析

蘭英　沈曉鳳　嚴鑄云　王海　何冬梅　王蘇琴　任波　陳新

摘要：為了闡明丹參根系分泌行為與遺傳和環境的關系，以不同地理（四川省、山東省、河南省）種源丹參組培苗和根段材料，分別進行無菌和沙土培養。并利用GC-MS技術對丹參根系分泌物進行組分分析，從組培和盆栽丹參根系分泌物中分別檢測出19種、36種物質，其中組培丹參根系分泌物以酚類、酯類為主。各種源丹參根系分泌物中有其特殊的成分，但所有分泌物中均含有十六烷棕櫚酸、硬脂酸油醇酯、松油醇等，只是含量不同。土培條件下，根系分泌物中烴類、醇類、醛類在種類及含量上均有所增加，而酚類、酯類明顯減少，尤其是酚類物質，增加2種酸類、2種甾醇類和1種萘胺、2種酰胺類組分，但未檢出組培丹參根系分泌物中的1種酮類和3種脂肪胺類物質。研究表明，丹參根系分泌物的組成和相對含量受遺傳和環境的影響，其中有機酸、甾醇類和酰胺類是環境脅迫下的主要分泌物，本研究結果將為提高丹參根際土壤養分高效利用提供一定參考。

關鍵詞：丹參；根系分泌物；組培法；土培法；氣相色譜一質譜

中圖分類號：R284.1 文獻標志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0301—05根系分泌物是植物與環境相互作用的媒介，在植物間、植物與微生物問的相互作用中具重要的生態學意義，其組成受遺傳和環境的雙重調控，在植物根系化感作用及根際營養調控中起著重要作用。研究表明三七、人參、西洋參、地黃、蒼術等的根系分泌物具化感作用。丹參（Salvia mihiorrhiza Bge.）是多地栽培的藥用植物，其中四川、河南、山東是丹參藥材的道地產區。已有研究表明，丹參雖具廣泛的土壤適應性，但不同產地丹參的有效成分和無機元素含量差異明顯，并與遺傳特性及土壤因子相關。本試驗以四川省、河南省、山東省種源丹參為試驗材料，研究不同遺傳背景丹參在MS培養基和盆栽過程中根系分泌物的差異，旨在為深入研究丹參根系分泌物產生機制提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

丹參種源于2012年12月分別采自四川中江石泉鄉、山東臨沂呂匣鎮，河南方城拐河鎮3個不同產區，根段繁殖，翌年開花后，經鑒定均為唇形科植物丹參。沙土盆栽，完整挖出植株根系，剝取距離根表0～4 mm內的土壤約200 g，置陰涼處自然風干，研磨，過60目篩備用。

組培苗取上述盆栽植物作外植體，經組織培養獲取叢生芽，于1/2MS+0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA（含蔗糖1.5%，瓊脂0.8%，pH值5.8～6.0），溫度（25±2）℃，光照度約5 000 k，光照時間11 h/d條件下培養50 d后，取其根部的培養基備用。

1.2試劑與儀器

儀器：Agilent GC6890/MSD5973氣相色譜-質譜聯用儀；JA5003型電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；KQ5200超聲儀（昆山市超聲儀器廠有限公司）；RE5203旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；TDZ5-WS臺式低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）。

試劑：乙酸乙酯（分析純）（成都科龍試劑化工廠，批號20130718），二氯甲烷（成都科龍試劑化工廠，批號2013093001），甲醇（分析純）（成都科龍試劑化工廠，批號20110415），無水硫酸鈉（分析純）（成都科龍試劑化工廠，批號20130705）。

1.3試驗方法

1.3.1培養基中根系分泌物的提取 選取長勢一致的丹參組培苗（山東），剝離其根部附近的培養基，等分成3份，分別置于圓底燒瓶中，一份加入200 mL蒸餾水及100 mL乙酸乙酯于90℃加熱融化后回流提取30 min；另一份加入相同的溶劑后于100 W、40℃超聲提取30 min，放置冷卻后，分別分離乙酸乙酯層，將瓊脂層重新轉入原燒瓶中，用1 mol/L NaOH將pH值調至9，各加入100 mL乙酸乙酯，分別以上述同樣的方法提取30 min，合并各樣品2次乙酸乙酯提取液；最后一份培養基中加入200 mL甲醇，于100W，40℃超聲提取45 min，以5 000 r/min離心10 min，分離上清液；將3份提取液用無水硫酸鈉脫水后，于35℃減壓濃縮至干，以二氯甲烷溶解并定容至1 mL，用于GC-MS分析，確定提取方案。以最佳方法分別制備山東、四川、河南丹參組培苗根系分泌物供試液。并以未使用過的MS培養基制備空白供試液。

1.3.2根際土壤浸提液的制備 分別稱取3種丹參根際土各約50 g，置500 mL錐形瓶中，按1：5比例加入蒸餾水，于30℃超聲提取30 min，離心，上清液用1 moL/L HCl調pH值至4，以等體積的乙酸乙酯萃取2次，分離乙酸乙酯層，水相用1 mol/L NaOH調節pH值至9，再用等體積乙酸乙酯萃取2次，合并2次所得乙酸乙酯萃取液，用無水硫酸鈉脫水后，于35℃減壓濃縮至干，以二氯甲烷溶解并定容至1 mL，作供試品溶液。并從加入蒸餾水開始同時制備空白供試液。

1.3.3根系分泌物的GC-MS測定 提取的根系分泌物用氣相色譜一質譜聯用儀（Agilent GC6890/MSD5973）進行分析。色譜條件：色譜柱db-35：（30 m×0.25 mm，0.25μm）；載氣：He；分流比：2：1；柱恒流：1 mL/min；進樣量：1μL；進樣口溫度：260℃。升溫程序：組培根分泌物的程序升溫條件：初始溫度60℃，以10℃/min升溫到300℃，保持16 min；土培根分泌物程序升溫條件：初始溫度100℃，以5℃/min升溫到150℃，再以3～C/min升溫到270℃，然后以5℃/min升溫到300℃，保持10 min。質譜條件：電離方式：EI，電子能量：70 eV，離子源溫度：230℃；四極桿溫度：150℃；質量掃描范圍：20～500 amu；采集方式：SCAN掃描。

2結果與分析

2.1組培苗根系分泌物的提取方法

按“1.3.3”節中的GC—MS條件對3種不同提取方法得到的丹參組培苗根系分泌物進行分析，并扣除空白試液，得其總離子流圖（圖1）。由圖1可見，3種提取液中均能檢測出丹參組培根系分泌物，但從其所含組分的種類及含量上比較，乙酸乙酯回流提取法（S1）檢測出的組分最多，各組分含量更高；其次是乙酸乙酯超聲提取法（S2）；而甲醇超聲提取法（S3）檢測出的組分最少。因此，確定乙酸乙酯回流提取法（S1）用于本試驗丹參組培苗根系分泌物的樣品制備方法。

2.2丹參組培苗根系分泌物的組成分析

按“1.3.3”節中的GC-MS條件對3個不同地理種源丹參組培苗根系分泌物進行分析，并扣除相應的空白試液，得到其總離子流圖（圖2）；對各成分的質譜圖進行計算機質譜庫（NIST08）檢索及人工解析，確定化合物結構，根據質譜離子流圖的峰面積，應用峰面積歸一化法確定各化合物的相對含量。3個不同種源的丹參組培苗根系分泌物共鑒定了19種成分，主要包括7大類成分，均以酯、酚類成分最為豐富，相對含量較高，其次分別是烴、醇、胺類（表1）。但各類組分的組成和含量有所不同，其中山東組培苗根系分泌物中酯類成分最為豐富，占總檢出量的28.02%，其次是酚類（22.78%），主要以4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、硬脂酸油醇酯、十六烷棕櫚酸等酚、酯類成分為主，含量高達41.48%。十六烷棕櫚酸成分在山東種源的組培苗根際含量較高，約為河南和四川的2倍，而鄰苯二甲酸二甲酯則相反，在河南省和四川省種源組培丹參根際含量為山東的2倍左右，硬脂酸油醇酯為山東省和四川省組培苗根系分泌物共有組分，但在山東種源組培丹參根際中的含量約為四川的3倍。2-（4-甲基-3-環己烯基）-2-丙醇（松油醇）為山東和河南根際培養基的共有組分，含量相近。而河南省、四川省組培苗根系分泌物中均以酚類成分含量最大，分別高達25.11%、25.53%；其次是酯類成分，相對含量分別為15.14%、21.23%，均以4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、鄰苯二甲酸二甲酯、6，10，14-三甲基-2-十五烷酮、二十六烷、N，N-二甲基芐胺等組分含量較高，9-十八碳烯酰胺僅存在于河南和四川根際培養基中，而正十五烷為河南省特有組分，但含量較低。

2.3土培丹參根系分泌物的組成分析

按“1.3.3”節中的GC-MS條件對3個產地丹參沙土盆栽苗根系分泌物進行分析，并扣除相應的空白試液值，得到其總離子流圖（圖3）；對各化學成分質譜圖進行計算機質譜庫（NIST08）檢索及人工解析，確定化合物結構，根據質譜離子流圖的峰面積，應用峰面積歸一化法確定各化合物的相對含量（表2）。

從沙土盆栽丹參的根際土壤浸提液中共鑒定出35種物質（表2），其中山東丹參根際土壤浸提液中鑒定出24種成分，占總檢出成分的84.54%；河南丹參鑒定出30種，占86.11%；四川丹參鑒定出34種化合物，占88.57%。3種丹參的盆栽根際土壤浸提液中均包括烴、醇、酯、酚、醛、酸、酰胺、胺類成分，其中烴類成分最豐富，含量最高，主要為15～29個碳原子的直鏈烷烴，其中長鏈的烷烴（如二十六烷、二十九烷）為優勢組分，與楊先國等的報道相似。而正十八烷、正十九烷、環氧十六烷和稠環芳烴惹烯為四川丹參特有的根系分泌物組分，但含量均較低；正十五烷為河南丹參根系分泌物中特有組分，這與其組培苗根系分泌物相同；1-十六烯為山東和四川丹參共有的根系分泌成分。其次分別是酯類、醇類、酸類及酰胺類，酯類成分主要為苯甲酸酯類衍生物，其中鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸正丁異辛酯在3種源丹參根系分泌物含量較高，而鄰苯二甲酸二甲酯、己二酸二辛酯僅在河南和四川丹參中檢出，且含量均較低；3種丹參根系分泌物中都含有3種有機酸，均以棕櫚酸含量最高；而酰胺、酚類成分中芥酸酰胺、油酸酰胺兩烯酸酰胺及苯酚為三者共有組分，且含量較高，9-十八碳烯酰胺、2，6-二叔丁基對甲酚僅在河南和四川丹參根系分泌物中檢出，其余成分相對含量較低。此外，河南省和四川省丹參根系分泌物中均檢出了豆甾醇和植物甾醇，而山東丹參根系分泌物中未見此類成分。

2.4組培和土培丹參根系分泌物的比較

組培和土培丹參的根系分泌物中均以烴類、醇類、酯類最豐富，含量較大。除苯酚、苯甲醛、9-十八碳烯酰胺及部分直鏈烷烴（十五烷、二十二烷、二十六烷）外，其他類型的根系分泌物成分差異較大。從化合物種類來看，組培丹參根系分泌物中特有1種酮類（6，10，14-三甲基-2-十五烷酮）和3種脂肪胺類（N，N-二甲基芐胺、十二烷基二甲基叔胺、N-甲基-N-十四烷基芐胺）成分，且相對含量較大；而土培丹參根系分泌物中未檢出酮類，增加了2種有機酸（棕櫚酸、3-甲氧基壬酸）、2種酰胺（油酸酰胺、芥酸酰胺）和2種甾醇類（豆甾醇、植物甾醇），且含量較高。從各組分含量變化上，根系分泌物中烴類、醇類、醛類的種類及含量，土培較組培丹參均有所增加，而酚類、酯類組分土培較組培明顯減小，尤以酚類物質最明顯。

3討論

植物根系分泌物的研究方法種類繁多，但各有不足，原因在于植物根系分泌物含量較少，收集困難，組分復雜難以分離、純化。目前，已發現的植物根系分泌物主要包括烴類、酚酸及其衍生物類、醛酮類、萜類、生物堿類等，其復雜的種類和結構決定了其作用途徑的多樣性。本試驗采用無菌組培法和盆栽土培法培養不同種源丹參，比較分析了不同種源丹參在組培和土培條件下根系分泌物組成的差異。結果發現，丹參的根際分泌行為與遺傳和環境密切相關。無菌全營養組培條件下，以酯、酚類為主，但不同種源丹參還存在一些特有組分，這些主動分泌的物質其生物學意義有待進一步研究。沙土培養下，丹參根系分泌物增加了有機酸、酰胺及甾醇類成分，原因是植物在逆境脅迫條件下，導致植物生理代謝障礙或組織損傷，使植物主動或被動向根際環境釋放各種化學物質，增加根分泌物數量和種類以適應環境脅迫。其中有機酸的增加，與文獻報道營養脅迫下植物會分泌有機酸以活化根際養分結果一致，而酰胺及甾醇類與植物根際養分吸收的關系未見相關報道。

植物根分泌物組分復雜，其種類、數量與植物的種類、發育階段、營養狀況、根際微生態環境及生長環境等有密切關系，植物通過代謝產生的根分泌物，一部分作為化感物質影響植物的生長，如已有研究報道稱植物根系分泌的二十九烷（油菜）、十六酸（蒼術）、植醇、1-氯十六烷、二十烷（重茬大豆）、十六烷（橡樹）、十九烷（桉樹）、鄰苯二甲酸丁酯十一烷基酯（大蒜）。等對植物生長起著一定程度的抑制作用。另一部分主要用來適應不良環境，如植物缺磷時，植物根系可通過有機酸、質子或磷酸水解酶分泌量增加，大大提高根際土壤中難溶性養分的溶解度，從而提高養分的有效性，改善植物缺磷狀態。本試驗發現丹參在土培條件下，根系分泌物中新增有機酸、酰胺及甾醇類成分，且烴類、醇類、醛類組分含量均有所增加，其生態學意義有待進一步研究。