微生物檢測法測定多抗菌素發酵液生物效價

胡永紅　楊洋　張棋　王濟奎　楊文革

摘要：以多抗菌素生產菌（Streptomyces aureochromogenes NJYHWG66382）為試驗菌株，水稻紋枯菌為指示菌株，用管碟法測量不同濃度多抗菌素標準品抑菌圈大小，多抗菌素標準品在質量濃度為200～2 400μg/mL范圍內線性擬合度良好，其線性回歸方程為：y=138.23x-2 058.46，r²=0.998 4。確定牛津杯最適裝液量為200μL，精密度相對標準偏差RSD為1.51%，穩定性良好。該法能快速檢測多抗菌素效價且靈敏度高，操作簡便，回收率高。

關鍵詞：多抗菌素；管碟法；精密度；穩定性

中圖分類號：S188 文獻標志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0306—02

多抗菌素（polyoxins）也被稱為多抗霉素、多效霉素、多氧霉素，能夠抑制真菌細胞壁幾丁質的合成，已經被廣泛應用于治療番茄灰霉病、水稻紋枯病和梨黑斑病等植物真菌病害，是一種抗真菌核苷類抗生素和能夠有效防治植物真菌病害的生物農藥。多抗菌素不是一種純凈物，由于其碳鏈上R1、R2、R3 3個位點上官能團的變化，使多抗菌素的組分有多抗菌素A至多抗菌素N 14種之多。由于其成分的復雜性，導致了高效液相色譜法（HPLC）檢測需要很復雜的預處理，同時，考慮到HPLC檢測的成本、周期等因素，因此，用多抗菌素微生物檢測法探索具有重要意義。本研究以多抗菌素生產菌（Streptomyces aureochromogenes NJYHWG66382）為試驗菌株，采用管碟法測量多抗菌素效價，同時進行了精確度、穩定性試驗，顯示出了良好的效果。

1材料與方法

1.1試驗菌種

多抗菌素產生菌Streptomyces aureochromogenes NJYH-WG66382，由課題組保藏。水稻紋枯菌：由課題組保藏。多抗菌素標準品是由江蘇豐源生物有限公司提供。

1.4試驗萬法

1.4.1標準溶液配制 精確稱取60 mg多抗菌素標準品置于容量瓶中，用蒸餾水溶解，振蕩，定容至25 mL，得到濃度為2 400μg/mL的標準溶液，置于4℃冰箱備用。

1.4.2發酵液前處理 取發酵培養基，倒入50 mL離心管，10 000 r/min，4℃離心15 min，取上清液，用0.45μm微孔濾膜過濾，收集，置于4℃冰箱備用。

1.4.3管碟法檢測多抗菌素含量 取直徑90 mm、高16 mm的平板，向平板中倒入15 mL加熱融化的PDA培養基，使其在碟內均勻分布，放置在水平工作臺上，凝固。取直徑約為2 mm的水稻紋枯菌苔，置于平板1/3處，在平板相對位置放置牛津杯[內徑（6.0±0.1）mm，外徑（8.0±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm]，靜置15 min，使其在培養基上沉降穩定后，使用移液槍向牛津杯中添加200μL發酵液。放置在28℃培養箱中培養24 h后，在平板底部墊上1張白紙，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，并記錄。

1.4.4線性試驗 將標準品分別稀釋至不同濃度，分別為200、800、1 000、1 600、2 000、2 400μg/mL，使用管碟法（牛津杯法）測定不同濃度多抗菌素標準品的抑菌圈大小（表1），以抑菌圈直徑（mm）為橫坐標，多抗菌素濃度（μg/mL）為縱坐標繪制標準曲線（圖1）。

1.4.5穩定性試驗 取“1.4.4”節中發酵液6份，分別在0、6、12、18、24 h按“1.4.3”節方法檢測多抗菌素含量。

1.4.6精密度試驗 準確吸取多抗菌素標準品儲備液，按“1.4.3”節方法進行檢測，做6組平行試驗。

1.4.7回收率試驗 取已知多抗菌素含量的發酵液5份，分別加入同等體積、相同濃度的多抗菌素標準品溶液，按“1.4.4”節方法進行測定，計算回收率。

2結果與討論

2.1標準曲線

根據抑菌圈大小繪制標準曲線，從圖1可以看出，多抗菌素濃度在200～2 400μg/mL范圍內線性擬合度良好，其回歸方程為：y=138.23x-2 058.46，r²=0.998 4。

2.2牛津杯最佳裝液量

分別通過添加100、150、200、250μL的多抗菌素標準溶液，來觀察抑菌圈大小。當牛津杯裝液量為250μL時，由于液體表面張力，在牛津杯上方會形成一個曲面弧度，發酵液會因為接觸培養皿上蓋而造成損失，影響檢測結果。隨著裝液量的減少，平板上抑菌圈逐漸變小，因此選擇200μL的裝液量最為合適。

2.3穩定性試驗

對發酵液在24 h內穩定性進行抑菌圈觀察分析。結果（圖2）表明，發酵液在24 h內多抗菌素含量基本穩定，未發生顯著變化。

2.4精密度試驗

選擇2400μg/mL的標準品溶液進行6次平行試驗，分別測量抑菌圈大小，RSD為1.51%（n=6），表明該方法精密度較好（表3）。

2.5回收率試驗

通過回收率試驗，測量混合液形成的抑菌圈直徑，結果見表4，試樣回收率分別為99.3%～101.4%，其RSD值為1.87%～2.15%，其平均回收率為100.1%，回收率效果較好。

3結論

本研究建立了管碟法測量發酵液中多抗菌素含量的方法，使用水稻紋枯菌為指示菌株。多抗菌素標準品在質量濃度為200～2 400μg/mL范圍內線性擬合度良好，其線性回歸方程為：y=138.23x-2 058.46，r²=0.998 4。并驗證了該法的穩定性和精密度，證明回收率較高。由于微生物檢測法操作簡便、成本低，相對于HPLC法對于儀器設備的要求低，因此，可采用微生物檢測法代替HPLC法檢測發酵液中多抗菌素的含量。