解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7菌株高產抗菌物質的發酵條件優化

裘紀瑩　陳相艷　吳發萍　劉孝永　周慶新　王軍華　王未名　陳蕾蕾

摘要：研究了解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7發酵產胞外抗菌物質的發酵條件，以無菌發酵液對西瓜枯萎病菌的抑菌圈直徑為指標，探討了發酵溫度、裝液量、接種量、搖床轉速和發酵時間對發酵液抑菌活性的影響。通過單因素試驗、Plackett-Burman設計及Box-Behnken響應面法優化并確定了最佳發酵條件為發酵溫度為33.82℃，接種量為4.06%，搖床轉速為152.46 r/min，裝液量為100 mL/250 mL三角瓶，發酵時間為6 d。在最適發酵條件下預測無菌發酵液的抑菌圈直徑為25.65 mm，優化后的發酵條件大大提高了發酵液的抑菌活性。

關鍵詞：解淀粉芽孢桿菌；抗菌物質；Plackett-Burman設計；響應面法；發酵條件優化；抑菌活性

中圖分類號：TQ920.1 文獻標志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0311—04

解淀粉芽孢桿菌是一類重要的生防菌，能夠分泌脂肽、抗菌蛋白及類細菌素等抗菌物質。目前關于解淀粉芽孢桿菌抗菌活性的研究比較熱門，如張寶研究了解淀粉芽孢桿菌K103所產脂肽的分子結構、生化特性、抗菌機理及植物生防作用；趙東洋研究了解淀粉芽孢桿菌SWB16菌株脂肽類代謝產物對球孢白僵菌的拮抗作用；安俊瑩等采用響應面法優化了解淀粉芽孢桿菌ZJHD-06產類細菌素的發酵培養基；陳召亮等研究了解淀粉芽孢桿菌RY3產抗菌粗蛋白的理化性質及其對柑橘綠霉病菌的抑菌活性；蔡文韜等研究了解淀粉芽孢桿菌發酵液對提高辣椒采后品質的影響。

解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7是筆者所在實驗室自行篩選的1株廣譜拮抗菌株，對包括西瓜枯萎病菌、棗炭疽病菌、蘋果斑點落葉病菌和輪紋病菌、梨黑斑病菌、青霉病菌等典型果蔬病原真菌以及金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌等病原細菌有很好的抑制作用。同時，有研究表明，該菌產胞外抗菌物質對采后蘋果輪紋病具有良好的防治作用，防治效果與納他霉素相當，對梨采后青霉病的防治也有明顯效果，因此具有比較好的開發應用價值。在此基礎上，本研究采用單因素試驗、Plackett-Burman設計和響應面法對該菌產胞外抗菌物質的發酵條件進行了優化，從而提高了發酵液的抑菌活性。

1材料與方法

1.1菌種

解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7，由筆者所在實驗室分離；西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporium f.sp.niveum），由山東大學微生物技術國家重點實驗室惠贈。

1.2材料與試劑

牛肉膏蛋白胨培養基用于NCPSJ7菌株的培養和保存；PDA培養基用于病原菌的培養、保存和牛津杯法測定抑菌活性；發酵培養基用于拮抗菌胞外抗菌物質的發酵，具體配方為葡萄糖5 g，酵母浸膏7.5 g，蛋白胨7.5 g，（NH₄）₂SO₄ 5 g，NaCl 5 g，水1000 mL，pH值7.0。其他試劑均為分析純。

1.3儀器與設備

CR22Gm高速冷凍離心機（日本日立公司）；霉菌培養箱LRH-150-MS（廣東省韶關市泰宏醫療器械有限公司）；生化培養箱SHP-150（上海精宏試驗設備有限公司）；ZWY-2102恒溫搖床（上海智誠分析儀器制造有限公司）。

1.4試驗方法

1.4.1無菌發酵液的制備 菌種活化及種子液的制備：將解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7接種于牛肉膏蛋白胨平板，37℃培養24 h。挑取單菌落于牛肉膏蛋白胨液體培養基中，37℃、180 r/min搖床培養24 h，得種子液。發酵：將種子液按一定比例接種于發酵培養基，在一定的裝液量、搖床轉速和發酵溫度條件下搖床培養一定時間，既得NCPSJ7發酵液。無菌發酵液的制備：將發酵液于4℃、10 000 r/min離心20 min，棄菌體保留上清液，用0.45μm濾膜過濾，即得無菌發酵液。

1.4.2抑菌活性檢測 按文獻報道的方法，略有改動。病原指示菌菌懸液制備：將西瓜枯萎病菌活化后接種于PDA平板，按文獻報道的方法制成孢子菌懸液，4℃保存，備用。抑菌活性的檢測：取50μL的病原指示菌菌懸液均勻涂布于PDA平板培養基上，待干后在平板中央放置1個無菌牛津杯，向杯中加入200μL無菌發酵液，于28℃培養3 d，測定抑菌圈直徑。

1.4.3單因素試驗 以無菌發酵液對西瓜枯萎病菌的抑菌圈直徑為指標，分別考察培養溫度、裝液量、接種量、搖床轉速和發酵時間對無菌發酵液抑菌活性的影響，每組3個平行。

1.4.4 Plackett-Burman設計 在單因素試驗的基礎上，利用minitab軟件創建一個Factors=5、Runs=12的Plackett-Burman設計表，每個因素選取2個水平，低水平為單因素最佳培養條件，高水平為低水平的1.09～1.25倍，然后按設計開展試驗，考察各試驗因素的重要性。

1.4.5響應面法優化 采用Box-Behnken法，對Plackett-Burman試驗篩選出的較顯著因素進行進一步優化，每個因素選取3個水平，利用Design Expert 8.0軟件進行響應面及方差分析，并對數據進行二次回歸擬合，得到多元回歸方程，在一定水平范圍內求取最佳值，對發酵條件進行優化。

2結果與分析

2.1單因素試驗結果與分析

2.1.1發酵溫度對無菌發酵液抑菌效果的影響 在31～43℃之間選取5個不同水平的發酵溫度進行試驗，結果如圖1所示。發酵溫度34℃時，無菌發酵液的抑菌圈直徑最大，即抑菌活性最強。

2.1.2裝液量對無菌發酵液抑菌效果的影響 5個水平裝液量對抑菌效果的影響結果如圖2所示。發酵培養基的裝液量為100 mL/250 mL三角瓶時，無菌發酵液的抑菌圈直徑最大，即抑菌活性最強。

2.1.3搖床轉速對無菌發酵液抑菌效果的影響 5個不同水平的搖床轉速對抑菌效果的影響如圖3所示。搖床轉速為150 r/min時，無菌發酵液的抑菌圈直徑最大，即抑菌活性最強。

2.1.4接種量對無菌發酵液抑菌效果的影響 不同的接種量對抑菌效果的影響結果如圖4所示。接種量為3.0%時，無菌發酵液的抑菌圈直徑最大，即抑菌活性最強。

2.1.5發酵時間對無菌發酵液抑菌效果的影響 不同發酵時間對抑菌效果的影響結果如圖5所示。隨著發酵時間的延長，無菌發酵液的抑菌效果也隨之增強，當發酵6 d時，無菌發酵液的抑菌效果最好，之后抑菌效果呈下降趨勢。

2.2 Plackett-Burman試驗篩選顯著因素

在單因素試驗基礎上，采用Plackett-Burman設計顯著因素篩選方案，對5個因素進行考察。各因素的參數、水平見表1，試驗設計與測定結果見表2。

對上述結果進行t檢驗和方差分析，結果（表3）表明，置信度大于95%的因素被認為是顯著因素?？梢?，5種因素影響的顯著性順序為發酵溫度>接種量>搖床轉速>發酵時間>裝液量。發酵溫度和接種量對無菌發酵液的抑菌活性具有顯著影響，搖床轉速的影響雖不顯著，但影響也較大，作為進一步優化的因素。裝液量和發酵時間對結果的影響較小，選取單因素試驗中的最適值：裝液量100 mL/250 mL三角瓶，發酵時間6 d。

2.3響應面分析法優化發酵條件

選取對無菌發酵液抑菌活性影響較大的3個因素（發酵溫度、接種量和搖床轉速）進行Box-Behnken響應面法優化，其編碼水平見表4，試驗設計與測定結果見表5。

通過上述多元回歸方程作3組響應面和等高線圖，結果見圖6。由圖6-a可以看出，當發酵溫度由低到高逐漸變化，接種量也由低到高逐漸變化時，抑菌圈直徑呈現先上升后下降的趨勢；由圖中等高線形狀接近圓形可知，發酵溫度和接種量對抑菌圈直徑影響的交互作用不顯著。由圖6-b可以看出，當發酵溫度由低到高逐漸變化，搖床轉速也由低到高逐漸變化時，抑菌圈直徑呈現先上升后下降的趨勢；由圖中等高線形狀接近圓形可知，發酵溫度和搖床轉速對抑菌圈直徑影響的交互作用不顯著。由圖6-c可以看出，當接種量由低到高逐漸變化，搖床轉速也由低到高逐漸變化時，抑菌圈直徑呈現先上升后下降的趨勢；由圖中等高線形狀接近圓形可知，接種量和搖床轉速對抑菌圈直徑影響的交互作用不顯著。

2.4模型驗證試驗

根據響應面優化回歸方程求得解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7發酵產胞外抗菌物質的最適發酵條件為發酵溫度33.82℃，接種量4.06%，搖床轉速152.46 r/min，裝液量100 mL/250 mL三角瓶，發酵時間6 d，預測的最大抑菌圈直徑為25.65 mm。

為了方便試驗，選取發酵溫度34℃、接種量4.06%、轉速155 r/min、裝液量100 mL/250 mL三角瓶、發酵時間6 d，作3組平行，進行驗證試驗。結果抑菌圈直徑的平均值為25.30 mm，接近預測值，說明該模型能夠較好地預測發酵液抑菌活性情況。

3討論與結論

本試驗對解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7產胞外抗菌物質的發酵條件進行了優化。首先采用單因素試驗優化了發酵溫度、裝液量、接種量、搖床轉速和發酵時間這5個因素，在此基礎上采用Plackett-Burman設計篩選出發酵溫度、接種量和搖床轉速這3個較顯著因素，然后通過響應面法研究了各顯著因素及其交互作用對發酵產抗菌物質的影響。通過對試驗結果進行分析，建立了解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7無菌發酵液的抑菌圈直徑與發酵溫度、接種量和搖床轉速這3個較顯著因素的多項式模型，并確定了最適發酵條件：發酵溫度33.82℃，接種量4.06%，搖床轉速152.46 r/min，裝液量100 mL/250 mL三角瓶，發酵時間6 d，預測的最大抑菌圈直徑為25.65 mm。同時驗證試驗結果表明試驗值與預測值接近，說明該模型能夠較好地反映實際發酵情況，可用于預測發酵液抑菌圈直徑與發酵條件的關系。

對于拮抗菌NCPSJ7，本試驗只是從發酵條件方面進行了優化，培養基的組成、發酵液中主要抗菌物質的組成、分子結構等均未進行研究。同時如果能夠對發酵過程中產生抗菌活性物質的中間代謝產物、關鍵酶等進行調控，或者將菌種進行基因改造，將有望獲得更高的抑菌活性，這對拮抗菌劑的產業化生產和應用具有重大意義。