不同菌株發酵降解棉粕蛋白質的特性

敖維平　張蕾　周東年　盛鶴

摘要：為篩選降解棉籽粕大分子蛋白有效菌株，試驗選用假絲酵母菌（1630）、米曲霉（2174）、黑曲霉（2377）、混合菌（假絲酵母菌：米曲霉：黑曲霉=1：1：1）進行棉籽粕滅菌和未滅菌固體發酵。分別采用微量凱氏定氮法、甲醛滴定法測定棉籽粕發酵產品的酸溶蛋白氮、游離氨基氮，比較棉籽粕發酵產品的小分子肽氮含量、小分子肽氮提高率。結果表明，選用3株標準菌種及其混合菌液對棉粕發酵處理均可降解大分子棉蛋白，且混合菌株發酵表現出“協作效應”；由反映發酵棉蛋白特性的酸溶蛋白總氮、游離氨基氮、小肽含量可知，單菌株及混合菌株發酵處理時間以48 h為宜。

關鍵詞：棉籽粕；酸溶蛋白氮；游離氨基氮；小分子肽氮

中圖分類號：S816.43 文獻標志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0366—03

棉粕是我國飼料工業中一種重要的蛋白質原料，常年生產量超過600萬t，粗蛋白含量僅低于豆粕，但棉粕含游離棉酚、蛋白質品質差等不利因素限制了其在畜牧生產中的應用。對棉籽粕的開發利用中不僅要降低棉粕游離棉酚，提高棉粕蛋白質品質也極為重要。國內外學者采用有效菌種發酵改良棉粕營養特性，并取得了一定進展，發酵降低棉粕游離棉酚的研究較多，而關于發酵后棉粕蛋白質品質改良的研究仍有待深入。隨著動物營養研究的深入開展，小肽營養逐漸成為動物營養的研究熱點，利用低質飼料蛋白原料生產小分子營養肽備受關注，發酵法也成為降低蛋白分子質量、提高棉蛋白品質的有效方法。本研究選用黑曲霉、假絲酵母菌、米曲霉、混合菌液固體發酵降解棉粕，并分析棉粕發酵降解后的蛋白質組成特性，以期為棉粕在畜牧業生產中的合理利用提供依據。

1材料與方法

1.1材料

棉籽粕購自新疆維吾爾自治區阿拉爾市某油脂廠，經粉碎過40目篩，作為發酵基礎原料。假絲酵母菌（1630）、米曲霉（2 174）、黑曲霉（2 377）標準菌種均購自中國工業微生物菌種保藏管理中心。PDA液體培養基配方為：馬鈴薯200 g/L、蔗糖20 g/L，pH值自然；LB液體培養基配方為：酵母膏5 g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5 g/L，pH值7.0。

1.2試驗方法

1.2.1種子液的制備 取超低溫保存的菌種置于37℃使其解凍，挑取菌落并接種于液體培養基中，置于37℃使其復活，取復活的菌落進行2次以上斜面培養，獲得斜面菌種。

假絲酵母菌：取1環活化并經培養的斜面菌種接于LB液體培養基中，于37℃、200 r/min搖床培養12 h后，取2 mL轉接至另一LB液體培養基，并于37℃、200 r/min搖床培養12 h作為種子液。黑曲霉與米曲霉：取1環斜面菌種接于放有20顆玻璃株的PDA液體培養基中，于30℃、200 r/min搖床培養24 h后，取2 mL轉接至另一PDA液體培養基，并于30℃、200 r/min搖床培養24 h作為發酵種子液。

1.2.2棉籽粕發酵處理 稱取棉粕50 g置于500 mL三角瓶，按料水比1 g：1 mL充分攪勻，置于121℃高溫高壓滅菌30 min。試驗發酵分為未滅菌發酵、滅菌發酵，分別接種酵母菌、黑曲霉、米曲霉、混后菌（酵母菌：黑曲霉：米曲霉=1：1：1），接種量均為100 g/L，對照組（0 h）以重蒸水代替菌液，分別于發酵24、48、72 h時取樣，置于60℃烘箱12 h后，粉碎并過60目篩，置于4℃冰箱保存備用。

1.2.3指標測定 稱取過60目篩的發酵棉籽粉5 g，加入70 mL水并于恒溫振蕩器振蕩3 h，加入20 mL體積分數為10%的三氯乙酸，過濾并用體積分數為10%的三氯乙酸定容至100 mL，將濾液于4 000 r/min離心10 min，取上清液作為測定分析樣品。

發酵前棉粕蛋白氮、發酵棉粕酸溶蛋白總氮均采用凱氏定氮法測定；游離氨基氮采用甲醛滴定法測定。小分子肽氮含量（mg/g占干基）：酸溶蛋白氮與游離氨基氮之差。

小分子肽氮提高率=（發酵后小肽氮-發酵前小肽氮）×100%÷發酵前小肽氮。

1.3數據分析

采用Excel 2007軟件進行數據整理，采用DPS軟件進行完全隨機單因素分析，采用LSD軟件進行多重比較，數據以“平均值±標準差”表示。

2結果與分析

2.1黑曲霉發酵前后棉籽粕產品的蛋白質特性

由黑曲霉發酵前后棉籽粕產品的蛋白質特性（表1）可知，發酵處理棉籽粕后，酸溶蛋白總氮、小肽氮含量、小肽氮提高率均高于發酵前，且發酵48h時小肽氮含量均達到最大值，48 h后呈降低趨勢，這與李全豐等的研究結論相似。試驗結果表明，黑曲霉對滅菌、未滅菌的棉籽粕蛋白均有降解作用，且小分子肽氮含量顯著提高。

2.2假絲酵母發酵前后棉籽粕產品的蛋白質特性

由假絲酵母發酵前后棉籽粕產品的蛋白質特性（表2）可知，假絲酵母發酵棉蛋白后，酸溶蛋白總氮含量、小肽氮含量、小肽氮提高率均高于發酵前，而游離氨基氮則呈降低趨勢，與黑曲霉發酵棉粕游離氨基氮的趨勢相反。試驗結果表明，假絲酵母具有降解大分子棉蛋白的作用。

2.3米曲霉發酵前后棉籽粕產品的蛋白質特性

由米曲霉發酵前后棉籽粕產品的蛋白質特性（表3）可知，米曲霉發酵棉蛋白后，酸溶蛋白總氮含量、小肽氮含量均高于發酵前，并隨發酵時間的推移呈上升趨勢，但發酵48 h后呈下降趨勢；發酵棉蛋白的游離氨基氮較發酵前均減少。

2.4混菌發酵前后棉籽粕產品的蛋白質特性

由混菌發酵前后棉籽粕產品的蛋白質特性（表4）可知，混合菌種發酵棉蛋白后，酸溶蛋白總氮含量、小肽氮含量均高于發酵前，并隨發酵時間的推移呈上升趨勢，但發酵48 h后呈降低趨勢；混菌發酵棉粕蛋白的小分子肽氮含量最佳，而游離氨基氮均低于發酵前。試驗結果表明，混菌發酵降解棉粕大分蛋白的效果優于單菌種發酵。

2.5不同菌種降解棉粕產生小分子肽的效果

由不同菌種降解棉粕大分子蛋白質產生小分子肽的效果（圖1、圖2、表5）可知，采用3種菌株及其混合菌液發酵處理均可不同程度降解棉粕大分子蛋白質，且滅菌發酵與未滅菌發酵的變化趨勢相似，除假絲酵母菌外，多以發酵48 h產生的小分子肽氮含量最多。然而菌種之間仍存在差異，以混菌發酵產生的小肽氮含量提高最為明顯，可見菌株混合發酵對降解棉粕大分子蛋白質具有“協同效應”，這與諸葛斌等的研究結論[2，4]一致。對單菌種的發酵效果進行比較，米曲霉最佳，黑曲霉次之，假絲酵母最差。

3結論與討論

棉粕是優質蛋白質原料之一，尤其在我國主要產棉地區。然而，產棉地區棉粕在畜禽飼料中的利用比例有限，這與棉粕游離棉酚的毒性、棉蛋白的吸收利用率有關。采用有益菌株發酵法降解不易被利用的棉粕大分子蛋白，提高可直接吸收利用的小肽含量，已成為提高棉蛋白消化吸收利用率的一種有效方法。本試驗選用3種工業微生物標準菌種及其混合菌液固體發酵處理棉粕，酸溶蛋白總氮、小分子肽含量均大幅提高。綜合分析表明，3個菌株混合發酵的效果最佳，小分子肽氮可提高至6.37 mg/g（若蛋白系數取6.25，小肽含量可提高3.98%），比諸葛斌等的試驗結果低，而比李旺軍等的試驗結果高，這可能與發酵選用的菌株和發酵底物有關。本試驗以單一棉粕為發酵底物，比較滅菌發酵與未滅菌發酵對降解棉粕大分子蛋白的效果。結果表明，發酵前未滅菌棉粕的小肽氮含量很低，僅為0.24 mg/g，而高溫滅菌使小肽氮含量提高至2.24 mg/g；高溫滅菌使酸溶蛋白總氮增加，而使游離氨基氮降低，可能由于高溫滅菌使部分大分子蛋白質肽鍵斷裂而形成小分子肽，因游離氨基酸發生“美拉德反應”導致游離氨基氮減少。比較滅菌與未滅菌發酵對小肽氮提高率的影響可知，未滅菌發酵降解棉粕大分子蛋白質的效果優于滅菌發酵，但滅菌發酵的小肽氮含量較高。

試驗采用3株標準菌種對棉粕發酵處理，均有降解大分子棉蛋白的作用，且混合菌株發酵表現出“協作效應”。由反映發酵棉蛋白特性的酸溶蛋白總氮、游離氨基氮、小肽含量可知，單菌株及混合菌株的發酵處理時間以48 h為宜。