雌激素受體單核苷酸多態(tài)性與子宮頸癌的相關(guān)性研究

陳莉婷，彭 敏，莫菊玲

(佛山市婦幼保健院婦科，廣東 佛山 528000)

雌激素受體單核苷酸多態(tài)性與子宮頸癌的相關(guān)性研究

陳莉婷，彭 敏，莫菊玲

(佛山市婦幼保健院婦科，廣東 佛山 528000)

目的 探討雌激素受體(GPR30)單核苷酸多態(tài)性與子宮頸癌的相關(guān)性。方法 選取114例子宮頸癌患者為研究組，同數(shù)量子宮息肉及子宮肌瘤等良性疾病者為對(duì)照組，采用S-P免疫組化法測(cè)定子宮頸癌組織GPR30表達(dá)，PCR-RFLP法測(cè)定GPR30(rs3808351)位點(diǎn)基因多態(tài)性。結(jié)果 對(duì)照組與研究組在懷孕次數(shù)、首次性生活年齡、文化程度及HPV感染方面有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=20.64、14.05、10.11、39.71，P<0.05)；研究組GPR30陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組(χ2=12.65，P<0.05)；對(duì)照組與研究組GG、AA基因型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為6.14、5.89，均P<0.05)，G、A等位基因頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為5.63和5.76，均P<0.05)；Logistic回歸分析顯示，懷孕次數(shù)(OR=1.659，95%CI：1.231～4.964，P<0.05)、HPV感染(OR=1.778，95%CI：1.196～3.854，P<0.05)、G等位基因頻率(OR=2.239，95%CI：1.545～7.032，P<0.05)為子宮頸癌的危險(xiǎn)因素。結(jié)論 GPR30(rs2808350)位點(diǎn)G等位基因頻率可能為子宮頸癌的發(fā)生危險(xiǎn)因素。

G蛋白偶聯(lián)受體30；子宮頸癌；單核苷酸多態(tài)性；基因

宮頸癌是臨床上較為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)大量服用避孕藥與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。雌激素具有促進(jìn)敏感靶器官、組織或者細(xì)胞異常變化的作用[1]。有報(bào)道指出，雌激素能夠促進(jìn)宮頸靶細(xì)胞增殖，并且進(jìn)一步啟動(dòng)、促進(jìn)致癌過(guò)程[2]。G蛋白耦聯(lián)受體30(G protein coupled receptor 30，GPR30)是一種真正的雌激素膜性受體，其在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌及子宮頸癌中高度表達(dá)[3]。另有研究報(bào)道，雌激素受體基因(ERα、ERβ)與子宮頸癌顯著相關(guān)[4-5]。但目前對(duì)于GPR30基因多態(tài)性與子宮頸癌的關(guān)系研究報(bào)道較少。本研究旨在探討GPR30基因(rs3808351)位點(diǎn)基因多態(tài)性與子宮頸癌的關(guān)系，從而為宮頸癌的病因、發(fā)病機(jī)制提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1臨床資料

選取2013年3月至2016年3月在佛山市婦幼保健院婦科住院且行子宮頸癌切除術(shù)114例患者作為研究對(duì)象(研究組)，年齡在29～71歲，中位年齡48歲。患者均未在術(shù)前接受放療、化療。根據(jù)WGO(2003版)將子宮頸癌(cervical carcinoma，CC)行子宮頸癌組織學(xué)分類：高分化21例，中分化80例，低分化13例。按照國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO)標(biāo)準(zhǔn)行臨床分期：Ⅰ期93例，Ⅱ期21例；出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者24例，未出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者90例；肌層浸潤(rùn)深度≥1/2者62例，肌層浸潤(rùn)深度<1/2者52例；有脈管癌栓者47例，無(wú)脈管癌栓者67例；病理分類中子宮頸鱗癌92例，腺癌22例。選取同期婦女包括子宮息肉及子宮肌瘤等良性疾病者114例作為對(duì)照組，行子宮良性病變切除術(shù)。所有研究對(duì)象均簽訂知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)執(zhí)行。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本收集與處理

采用醫(yī)院自制的調(diào)查問(wèn)卷收集所有研究對(duì)象的一般人口學(xué)特征，包括身高、體重、月經(jīng)史、性生活史、生育史等，以及HPV感染等子宮頸癌相關(guān)危險(xiǎn)因素。在此基礎(chǔ)上，采集未絕經(jīng)者的月經(jīng)周期的第8～10天肘靜脈血5mL，絕經(jīng)者在入院后次日清晨抽取肘靜脈血5mL，以3 000r/min離心15min，分離血清及血塊，血清置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｊ占訉m頸癌患者和對(duì)照組宮頸組織。

1.2.2雌激素受體GPR30檢測(cè)

采用S-P免疫組化法檢測(cè)研究組、對(duì)照組宮頸組織的GPR30。所有標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定、石蠟包埋，切成每張4μm厚。切片經(jīng)脫蠟、酒精梯度水化后，經(jīng)PBS沖洗3次。加入過(guò)氧化氫酶37℃孵育30min后，加入檸檬酸緩沖液高溫修復(fù)7min，冷卻后采用PBS沖洗。滴加血清封閉液室溫孵育。滴加一抗(GPR30均為1:500)，4℃過(guò)夜。PBS沖洗3次，二抗37℃孵育30min，PBS沖洗3次后，采用DAB染色。經(jīng)蘇木復(fù)染，清水返藍(lán)。脫水，透明樹(shù)脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞。結(jié)果判定：GPR30陽(yáng)性細(xì)胞多染色位于細(xì)胞質(zhì)，可見(jiàn)棕黃色細(xì)顆粒，偶見(jiàn)細(xì)胞膜、核膜著色為棕黃色。采用半定量評(píng)分方法評(píng)估染色結(jié)果。每例隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，觀察細(xì)胞著色程度及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，其中陽(yáng)性細(xì)胞著色程度評(píng)分：無(wú)色計(jì)為0分，淡黃色計(jì)為1分，棕黃色計(jì)為2分，黃褐色計(jì)為3分。陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分： 5%及以內(nèi)計(jì)為0分，6%～25%計(jì)為1分，26%～50%計(jì)為2分，51%～75%計(jì)為3分，大于75%計(jì)為4分。將著色程度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比兩者評(píng)分相乘，其中陰性(-)為0分，弱陽(yáng)性(+)為1～4分，中度陽(yáng)性(++)為5～8分，強(qiáng)陽(yáng)性(+++)為9～12分。所有標(biāo)本均由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師診斷證實(shí)。

1.2.3采用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增技術(shù)(PCR)基因單核苷酸多態(tài)性

采用酚氯仿異戊醇法測(cè)定患者外周血細(xì)胞基因組中的DNA。采用Light Scanner Primer Design軟件設(shè)計(jì)GPR30基因相應(yīng)位點(diǎn)引物，均采用小片段擴(kuò)增引物。PCR引物：其中GPR30(rs3808351)(G)上游5′-CTGACGTATT￣CTACGGGTCCATA-3′，下游5′-ACTGAG￣CGGGTCGTTTACGA-3′。引物合成由上海生工生物工程有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系為25L，其中含有5L PCR Mix，上、下游引物各0.5L，1L LC Green和1L DNA模板，剩余加入雙蒸水。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2min，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，94℃變性30s，30℃退火30s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)，完成后采用73℃延伸5min。PCR產(chǎn)物純化采用小牛腸堿性磷酸酶和外切酶bs-13119R。全部測(cè)序均由ABI3100測(cè)序分析儀完成。為準(zhǔn)確測(cè)定基因分型結(jié)果，隨機(jī)選取10%的樣本采用直接測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)。群體基因型采用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。SNP位點(diǎn)與子宮頸癌的遺傳效應(yīng)之間的相關(guān)性采用非條件Logistic回歸分析，并經(jīng)多重檢驗(yàn)，P值經(jīng)Bonferroni進(jìn)行校正。所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析所得，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1子宮頸癌發(fā)生相關(guān)因素

對(duì)照組與研究組在BMI、年齡方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在懷孕次數(shù)、首次性生活年齡、文化程度及HPV感染方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為20.64、14.05、10.11、39.71，均P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 子宮頸癌發(fā)生相關(guān)因素分析[n(%)]

2.2 GPR30表達(dá)情況

免疫組化結(jié)果顯示，研究組GPR30陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組(χ2=12.65，P<0.05)，見(jiàn)表2、圖1。

表2 兩組患者GPR30表達(dá)情況[n(%)]

Table 2 Expression of GPR30 in two groups[n(%)]

組別 例數(shù)(n)(-)(+)(++)(+++)陽(yáng)性率(%)對(duì)照組11484(73．68)21(18．42)6(5．26)3(2．64)26．32研究組11421(18．42)24(21．05)39(34．21)30(26．31)81．58χ212．65P0．000

注：A：對(duì)照組；B：研究組

圖1 免疫組化檢測(cè)GPR30表達(dá)情況(×400)

Fig.1 Immunohistochemical detection of GPR30 expression(×400)

2.3 GPR30(rs3808351)位點(diǎn)基因型及擴(kuò)增結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為231bp，GPR30(rs3808351)位點(diǎn)酶切中呈現(xiàn)一條亮的且長(zhǎng)度為231bp的條帶為GG型；出現(xiàn)196bp、231bp兩條亮帶的為GA型，出現(xiàn)在196bp的一條條帶為AA型。隨機(jī)選取GPR30基因型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行基因測(cè)序，結(jié)果顯示堿基的改變與酶切結(jié)果一致，見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 GPR30基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

Fig.2 GPR30 gene amplification product electrophoresis

圖3 GPR30基因聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)序結(jié)果

Fig.3 Results of polymerase chain reaction of GPR30 gene

2.4 GPR30(rs3808351)位點(diǎn)基因型分布

對(duì)照組與研究組GPR30(rs3808351)位點(diǎn)G、A等位基因頻率分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，說(shuō)明符合群體代表性。對(duì)照組與研究組GG、AA基因型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為6.14、5.89，均P<0.05)，G、A等位基因頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為5.63、5.76，均P<0.05)，詳見(jiàn)表3。

表3 GPR30(rs3808351)位點(diǎn)基因型分布[n(%)]

2.5 子宮頸癌危險(xiǎn)因素的多變量回歸分析

將單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素行多變量的Logistic回歸分析，以子宮頸癌為因變量，以年齡、懷孕次數(shù)、首次懷孕年齡、文化程度、HPV感染及G等位基因頻率為自變量。結(jié)果顯示，懷孕次數(shù)(OR=1.659，95%CI：1.231～4.964，P<0.05)、HPV感染(OR=1.778，95%CI：1.196～3.854，P<0.05)、G等位基因頻率(OR=2.239，95%CI：1.545～7.032，P<0.05)為子宮頸癌的危險(xiǎn)因素。

3討論

3.1 GPR30受體與宮頸癌的關(guān)系

宮頸癌是婦女中較為常見(jiàn)的生殖道惡性腫瘤之一，且有年輕化趨勢(shì)。Shulman[6]于2000年研究發(fā)現(xiàn)，口服避孕藥有增加宮頸癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。宮頸癌的發(fā)生發(fā)展與性激素之間關(guān)系的研究日益引起廣泛的重視。激素是調(diào)節(jié)機(jī)體生理功能的重要化學(xué)物質(zhì)，任何原因?qū)е录に胤置谖蓙y、內(nèi)分泌失調(diào)都有可能使敏感的器官、組織或者細(xì)胞發(fā)生異常變化，如細(xì)胞異常增殖甚至出現(xiàn)癌變等[7]。受體是激素發(fā)揮生理效應(yīng)的重要介質(zhì)，也是激素與腫瘤發(fā)生關(guān)系的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。GPR30是一種真正的雌激素膜性受體，能夠在多種細(xì)胞中快速調(diào)節(jié)雌激素依賴性轉(zhuǎn)錄[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，GPR30參與多個(gè)信號(hào)途徑介導(dǎo)雌激素快速非基因組效應(yīng)及基因組的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)，同時(shí)也參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，如子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌及乳腺癌等[9]。羅浩軍等[10]于2009年研究報(bào)道指出，GPR30參與細(xì)胞的作用機(jī)制可能有以下幾個(gè)方面：①調(diào)節(jié)激酶的活性；②生成第二信使；③調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。目前已經(jīng)有報(bào)道指出，GPR30在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)[11]；同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)，GPR30在子宮內(nèi)膜癌及乳腺癌中高度表達(dá)。本研究采用免疫組化檢測(cè)子宮頸組織，結(jié)果顯示研究組子宮頸癌組織中GPR30陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組[12]。這也印證了符敏等[13]的研究報(bào)道。

3.2 GPR30受體基因多態(tài)性與宮頸癌的關(guān)系

近年來(lái)，雌激素受體ERα基因Pvu Ⅱ和Xba Ⅰ基因多態(tài)性與子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌及子宮頸癌的易感性有關(guān)，ERβ與乳腺癌的易感性有關(guān)。有研究報(bào)道，GPR30基因(rs2808350)位點(diǎn)G等位基因頻率與子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9]。但目前對(duì)于GPR30基因多態(tài)性與子宮頸癌的關(guān)系研究報(bào)道較少。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組與研究組GG、AA基因型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，G、A等位基因頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，G等位基因頻率是子宮頸癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素(OR=2.239，95%CI：1.545～7.032)，表明G等位是子宮頸癌的易感基因。

3.3 HPV感染與GPR30的關(guān)系

在宮頸癌的發(fā)病中，HPV感染在致病因的研究中已經(jīng)得到公認(rèn)。研究表明，單純的HPV感染并不能導(dǎo)致宮頸癌變，在與其他因素協(xié)同作用下才會(huì)導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生[14]。大量口服避孕藥且有HPV感染者，宮頸癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)比例顯著增加。本研究顯示，HPV感染是子宮頸癌發(fā)生發(fā)展的危險(xiǎn)因素，其可能與GPR30高表達(dá)這一協(xié)同作用有關(guān)。

綜上所述，GPR30(rs2808350)位點(diǎn)G等位基因頻率可能為子宮頸癌的發(fā)生危險(xiǎn)因素。

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[專業(yè)責(zé)任編輯： 安瑞芳 ]

Association of estrogen receptor single nucleotide polymorphism with cervical cancer

CHEN Li-ting, PENG Min, MO Ju-ling

(DepartmentofGynecology,FoshanMaternalandChildHealthCareHospital,GuangdongFoshan528000,China)

Objective To investigate the association of single nucleotide polymorphism of estrogen receptor (GPR30) and cervical cancer. Methods Totally 114 cases of cervical cancer were selected in study group, while the same number of cases of uterine polyps, uterine fibroids and other benign diseases were in control group. GPR30 expression in cervical cancer tissues was determined by S-P immunohistochemical method, and PCR-RFLP method was used for the determination of GPR30 (rs3808351) gene polymorphism. Results There were statistical differences in the times of pregnancies, the first sex age, education level and HPV infection between the study group and the control group (χ2value was 20.64, 14.05. 10.11 and 39.71, respectively, allP<0.05). The positive rate of GPR30 in the study group was significantly higher than that in the control group (χ2=12.65,P<0.05). GG and AA genotypes were significantly different between the study group and the control group (χ2value was 6.14 and 5.89, respectively, bothP<0.05), so were the allele frequencies of G and A (χ2value was 5.63 and 5.76, respectively, bothP<0.05). Logistic regression analysis showed that the number of pregnancies (OR=1.659, 95%CI: 1.231-4.964,P<0.05), HPV infection (OR=1.778,95%CI: 1.196-3.854,P<0.05) and G allele (OR=2.239, 95%CI: 1.545-7.032,P<0.05) were the risk factors for cervical cancer. Conclusion G allele frequency on GPR30 (rs2808350) locus may be the risk factors for cervical cancer.

G-protein coupled receptor 30 (GPR30); cervical cancer; single nucleotide polymorphism; gene

2016-06-16

陳莉婷(1979-)，女，主治醫(yī)師，碩士研究生，主要從事婦科腫瘤、婦產(chǎn)科介入治療等研究。

彭 敏，主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.02.016

R711.74

A

1673-5293(2017)02-0145-04