X線電離輻射通過上調c-Myc表達促進肺癌A549細胞上皮間質轉化*

劉曉媛， 白麗紅， 王冬輝， 林耿鵬， 楊惠玲， 郭禹標△

(中山大學 1附屬第一醫院呼吸內科， 2中山醫學院病理生理教研室，廣東 廣州 510080)

X線電離輻射通過上調c-Myc表達促進肺癌A549細胞上皮間質轉化*

劉曉媛1， 白麗紅1， 王冬輝2， 林耿鵬1， 楊惠玲2， 郭禹標1△

(中山大學1附屬第一醫院呼吸內科，2中山醫學院病理生理教研室，廣東 廣州 510080)

目的： 探討電離輻射對肺癌A549細胞上皮間質轉化(EMT)的影響及其可能機制。方法: 采用不同劑量(0 Gy、1 Gy、2 Gy、4 Gy和8 Gy)的X射線分別照射肺癌A549細胞不同時間，通過倒置顯微鏡觀察X射線照射12 h、24 h和48 h時肺癌A549細胞形態的改變；Western blot檢測X射線照射12 h與24 h時EMT相關蛋白vimentin、N-cadherin及E-cadherin和轉錄因子c-Myc的表達。結果: 照射后肺癌A549細胞輪廓不清，突起增多，邊緣不規則且呈煎蛋樣塌陷，以8 Gy X射線照射48 h時肺癌A549細胞上皮間質化形態最明顯。與0 Gy照射劑量對照組相比，vimentin雖然于4 Gy劑量照射12 h時下調，但是處理24 h時各劑量照射組vimentin均表現為上調，其中2 Gy劑量照射組其上調最明顯(P<0.01)；與0 Gy照射劑量對照組相比，1 Gy、2 Gy及4 Gy照射組照射肺癌A549細胞24 h后其N-cadherin表達上調(P<0.05)；各照射劑量對肺癌A549細胞E-cadherin表達沒有顯著影響。照射24 h后肺癌A549細胞c-Myc表達上調，以4 Gy劑量照射組表達差異最明顯(P<0.01)。結論: X線電離輻射可能通過上調c-Myc表達促進肺癌A549細胞發生上皮間質轉化。

電離輻射； 肺癌； 上皮間質轉化

肺癌居癌癥發病率之首，且據最新統計資料顯示，全球2012年因肺癌死亡病例數為160萬，中國肺癌患者死亡率為610.2/100 000，提示肺癌是癌癥患者死亡的最主要原因[1-2]。肺癌通常起病隱匿確診時患者多處晚期，因失去手術機會多被迫接受以放化療為主的綜合治療方案，尤其是放射治療，據報道超過50%腫瘤患者接受了放射治療。雖然放射治療是治療晚期腫瘤的主要手段，但臨床研究發現放療可能增加口咽部腫瘤、膀胱癌及宮頸癌的遠處轉移[3-4]，有體內外實驗結果顯示電離輻射(ionizing radiation，IR)包括X射線和γ射線等可促進腫瘤轉移及介導自身放療耐受[4]，由此嚴重影響放療的療效，然而其確切的作用及其機制尚未完全闡明。近期研究表明上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)參與腫瘤轉移或介導IR耐受[5]。IR是否可誘導腫瘤細胞EMT，促進轉移或介導IR耐受卻不清楚。本研究擬采用倒置顯微鏡觀察不同X線照射劑量及不同照射時間對肺癌A549細胞形態的改變，同時采用Western blot方法檢測不同劑量X線照射不同時間對肺癌A549細胞EMT相關蛋白vimentin、N-cadherin及E-cadherin和轉錄因子c-myc的影響，旨在探討X線照射對肺癌A549細胞EMT的影響及機制。

材 料 和 方 法

1 材料、試劑和儀器

肺癌A549細胞株由中山大學實驗中心提供。

試劑DMEM細胞培養基、胎牛血清、胰酶及青霉素/鏈霉素溶液均購自Gibco；抗β-actin單克隆抗體(Sigma)；抗E-cadherin多克隆抗體和抗vimentin多克隆抗體(ABclonal)；抗N-cadherin單克隆抗體、抗c-Myc單克隆抗體和HRP標記的Ⅱ抗(CST)；蛋白Marker(Thermo)。

X光生物學輻射儀(RAD SOURCE)；全自動倒置顯微鏡(Zeiss)；化學發光成像系統(Bio-Rad)。

2 方法

2.1 細胞培養 培養液為含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素雙抗溶液的DMEM培養混合溶液，培養于5% CO2、37 ℃培養箱中。

2.2 X線電離輻射 取對數生長期A549細胞均勻接種在細胞培養皿中，使細胞分別接受X光生物學輻射儀0 Gy、1 Gy、2 Gy、4 Gy和8 Gy劑量的照射，照射12 h及24 h分別收取細胞蛋白進行Western blot分析。

2.3 顯微鏡觀察形態學變化 將照射后細胞及對照細胞放置于全自動倒置顯微鏡上，相差顯微鏡觀察照射后細胞及對照細胞形態學變化情況。

2.4 制備蛋白樣品 貼壁細胞棄去培養液，PBS清洗2遍后加全細胞裂解液及蛋白酶抑制劑cocktail放置冰上15 min，使用細胞刮刮取細胞蛋白，收集至離心管后4 ℃、12 000 r/min離心，提取上清液；BCA試劑盒(Thermo)測定蛋白濃度，以PBS配平細胞蛋白濃度，添加SDS上樣緩沖液后沸水加熱10 min，冷卻后備用。

2.5 Western blot實驗 常規配置5%濃縮膠及10%分離膠，進行SDS-PAGE(恒壓90 mV 30 min后更改為恒壓130 mV 60 min)；電泳后將凝膠轉移至濾紙上，覆蓋PVDF膜(Millipore)后裝入轉膜夾，濕法轉膜(恒流200 mV 110 min)，麗春紅預染后剪切目標條帶，用TBST(含吐溫0.5%)洗膜5 min、3次，5%脫脂奶粉封閉后加 I 抗(β-actin,稀釋度1∶10 000；E-cadherin稀釋度1∶2 000；vimentin稀釋度1∶2 000；N-cadherin稀釋度1∶1 000；c-Myc稀釋度1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST(含0.5%吐溫)漂洗后孵育HRP標記的Ⅱ抗，滴加ECL顯色，化學發光成像系統采集結果，用ImageLab 3.0軟件分析條帶。

3 統計學處理

所有數據采用SPSS 13.0分析軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，多組間分析采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 電離輻射對肺癌A549細胞形態的影響

為探討IR是否可誘導A549發生EMT形態改變，本實驗采用倒置顯微鏡觀察0 Gy、2 Gy、4 Gy及8 Gy劑量X線照射12 h、24 h和48 h時肺癌A549細胞形態的改變。結果表明未經照射的肺癌A549細胞透亮、邊緣整齊，呈橢圓多邊形；經2 Gy、4 Gy及8 Gy X線照射后12 h時細胞體積變大、折光度下降，24 h時細胞突起增多，48 h時細胞輪廓不清、邊緣呈煎蛋樣塌陷，8 Gy照射48 h時細胞上皮間質轉化的形態改變最明顯，見圖1。這提示電離輻射促使肺癌A549細胞由上皮型向間質型形態轉化。

2 電離輻射對肺癌A549細胞間質蛋白及上皮蛋白表達的影響

為進一步從分子層面探討IR是否可誘導肺癌A549細胞EMT，我們采用Western blot檢測方法觀察不同X線照射劑量對12 h和24 h時EMT相關蛋白vimentin表達的影響。結果表明，與0 Gy對照組相比，vimentin雖然于4 Gy照射12 h時下調，但是處理24 h時各劑量照射組vimentin表達均出現上調，其中2 Gy照射的上調作用最明顯(P<0.01)，見圖2。

Figure 1.The effects of different doses of X-ray irradiation for different time on the morphology of lung cancer A549 cells (×400).

圖1 不同劑量X線照射不同時間對肺癌A549細胞形態的影響

Figure 2.The effects of different doses of X-ray irradiation for different time on the expression of vimentin in the lung cancer A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 Gy.

圖2 不同劑量X線照射不同時間對肺癌A549細胞vimentin表達的影響

進一步觀察IR對肺癌A549細胞另一間質蛋白N-cadherin表達的影響，Western blot結果表明，與0 Gy照射組相比，1 Gy、2 Gy及4 Gy照射均上調N-cadherin表達(P<0.05)，但各組別之間沒有顯著差異，見圖3。

為觀察IR是否能下調肺癌A549細胞上皮蛋白E-cadherin表達，我們同樣采用Western blot方法檢測0 Gy、1 Gy、2 Gy及4 Gy X線照射A549細胞24 h后E-cadherin的表達，結果表明，與0 Gy對照組相比，IR并不下調E-cadherin表達，見圖4。

Figure 3.The effects of different doses of X-ray irradiation for 24 h on the expression of N-cadherin in the lung cancer A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 Gy.

圖3 不同劑量X線照射肺癌A549細胞24 h對N-cadherin表達的影響

Figure 4.The effects of different doses of X-ray irradiation for 24 h on the expression of E-Cadherin in the lung cancer A549 cells. Mean±SD.n=3.

圖4 不同劑量X線照射肺癌A549細胞24 h對E-cadherin表達的影響

3 電離輻射對肺癌A549細胞轉錄因子c-myc蛋白表達的影響

為進一步了解IR誘導肺癌A549細胞 EMT的可能機制，本實驗通過Western blot檢測方法觀察不同劑量X線照射A549細胞12 h和24 h時對轉錄因子c-Myc表達的影響。結果顯示，經2 Gy、4 Gy及8 Gy X線照射12 h和24 h后c-Myc表達均有不同程度的上調；其中，與0 Gy對照組相比，4 Gy照射24 h時c-Myc表達上調有統計學意義(P<0.01)，見圖5。這提示電離輻射可能通過上調c-Myc表達促進肺癌A549細胞上皮間質轉化。

Figure 5.The effects of different doses of X-ray irradiation for different time on the expression of c-Myc in the lung cancer A549 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 Gy.

圖5 不同劑量X線照射不同時間對肺癌A549細胞c-Myc表達的影響

討 論

已有研究表明IR通過多種機制促進多種腫瘤的轉移[4, 6-7]：如募集循環腫瘤細胞向其它臟器播散、增強腫瘤細胞變形能力使其易于轉移、直接破壞腫瘤血管壁為腫瘤細胞提供轉移窗口，和上調腫瘤轉移相關分子表達。近期EMT與肺癌轉移的相關性備受關注。Reka 等[8]研究顯示EMT與肺癌淋巴結轉移率呈正相關；Soltermann 等[9]研究顯示EMT間質表型標記是進展期肺癌預后不良的預測因子；Yang 等[10]則通過動物實驗證實EMT參與肺癌的轉移，提示EMT與肺癌的轉移及預后相關。同時已有研究結果顯示IR通過誘導結腸癌、乳腺癌、鼻咽癌細胞EMT參與腫瘤轉移[11-13]，但IR是否誘導肺癌細胞EMT促進肺癌轉移值得探討。

本研究采用倒置顯微鏡及Western blot實驗方法觀察不同X線照射劑量照射不同時點對肺癌A549細胞EMT的影響，結果表明IR可誘導肺癌A549細胞由上皮型向間質型形態過渡，并與X線照射劑量及時間相關，照射劑量越大、時間越長則細胞形態學變化越明顯；同時證實IR上調肺癌A549細胞vimentin和N-cadherin蛋白表達，結果提示IR可誘導肺癌A549細胞EMT，與其它學者的研究結果相似。Yang 等[14]采用γ射線照射A549及H460進行RNAseq組學分析，結果發現IR上調367個基因表達，其中包含參與細胞變形、介導EMT(如TGF-β/BMP、細絲蛋白及激活素等)等相關基因；同時結果提示IR影響肺癌A549細胞 EMT相關分子表達的影響，經照射后細胞不表達E-cadherin，而vimentin表達上調[15]，但該實驗采用的射線和輻射方式與本實驗不同，且未探討γ射線與EMT的時間、劑量效應之間的關系。Kang 等[16]為觀察鼠李黃素及條葉薊素逆轉IR耐受效應，采用γ射線照射肺癌細胞株H1299及H460后成功構建IR耐受模型，構建模型時發現γ射線可誘導2株細胞發生EMT。另外，Gomez-Casal 等[17]證實γ射線通過誘導肺癌A549及H460干細胞生成介導IR耐受，僅通過熒光定量方法分析干細胞表型發現γ射線誘導其EMT。既往研究過于簡化EMT為上皮標志物E-cadherin表達缺失而間質標志物vimentin及N-cadherin表達上調；但Nieto等[5]根據近期研究總結指出細胞可在表達上皮標志物的同時表達間質標志物，此中間狀態稱之為部分EMT。本研究結果發現電離輻射并不下調E-cadherin表達，支持Nieto 等的部分EMT理論。由此可見，本研究從形態及分子層次揭示X線電離輻射可誘導肺癌A549細胞上皮間質轉化，并呈一定的時間及劑量依賴性。

本研究結果提示IR可誘導肺癌A549細胞EMT，但具體機制仍未明確。Chen 等[18]的動物研究表明c-Myc可通過介導EMT促進局部腫瘤病變，IR是否可上調c-Myc表達促進肺癌A549細胞EMT未有研究報道。本研究通過Western blot方法證實IR可上調肺癌A549細胞c-Myc表達，且與X線照射劑量及時間相關，這些結果與Popa 等[19]報道相似。Popa 等[19]觀察胸腺干細胞對胸腺破壞的修復效應時發現γ射線上調c-Myc表達；Chang 等[20]報道c-Myc是干細胞標志物之一。這些表明X線電離輻射通過上調c-Myc促進肺癌A549細胞EMT，另外提示其可能與放療耐受相關。

X線電離輻射誘導肺癌A549細胞發生上皮間質轉化可能與腫瘤轉移相關。波士頓大學醫學院通過對比聯合術前放療與單純手術治療口咽部腫瘤患者預后的隨機臨床試驗，結果提示放療并不改善患者預后，同時還增加了遠處轉移[3]；臨床研究發現接受放療的早期肺癌患者其遠處及原位復發率分別為19%及10%，遠處復發高于原位[21]；Yang 等[10]研究表明EMT是腫瘤轉移的重要機制，至于IR是否通過誘導肺癌EMT介導放療耐受并促進轉移，增加遠處轉移風險值得深入探討。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

X-ray ionizing radiation up-regulates c-Myc expression and promotes epithelial-mesenchymal transition in lung cancer cell line A549

LIU Xiao-yuan1, BAI Li-hong1, WANG Dong-hui2, LIN Geng-peng1, YANG Hui-ling2, GUO Yu-biao1

(1DepartmentofRespiratoryMedicine,TheFirstAffiliatedHospital，2DepartmentofPathophysiology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:guoyubiao@hotmail.com)

AIM: To investigate the effect of ionizing radiation on epithelial-mesenchymal transition in lung cancer cell line A549 and its possible mechanism.METHODS: The lung cancer A549 cells were irradiated with different doses (0 Gy, 1 Gy， 2 Gy, 4 Gy and 8 Gy) of X-ray for different time. The morphological changes of the cells were observed under inverted microscope at time points of 12 h, 24 h and 48 h. The expression of vimentin， N-cadherin， E-cadherin and transcription factor c-Myc was detected by Western blot at the time points of 12 h and 24 h.RESULTS: After ionizing radiation, the contours of the A549 cells were unclear, the protrusions increased， and the edges were irregular， with fried egg-like collapses. The mesenchymal morphology of the A549 cells was most obvious after irradiation at 8 Gy for 48 h. Compared with 0 Gy irradiation group, the expression of vimentin was down-regulated seemingly 12 h after irradiation， but up-regulated in 2 Gy, 4 Gy and 8 Gy irradiation groups for 24 h, and the most obvious effect was observed in 2 Gy irradiation group (P<0.01). Compared with 0 Gy irradiation group, the expression of N-cadherin was up-regulated in 1 Gy, 2 Gy and 4 Gy irradiation groups for 24 h (P<0.05)， while the expression of E-cadherin was not influenced. The up-regulation of vimentin expression in lung cancer cell line A549 was positively correlated with c-Myc expression. CONCLUSION: Ionizing radiation may promotes epithelial-mesenchymal transition in the lung cancer cell line A549 by up-regulating the c-Myc expression.

Ionizing radiation; Lung neoplasms; Epithelial-mesenchymal transition

1000- 4718(2017)05- 0788- 05

2017- 01- 06

2017- 04- 10

國家自然科學基金資助項目(No. 81502492)； 廣東省自然科學基金資助項目(No. 2016A030313839)

R363.1+2； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.004

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel： 020-87333133； E-mail: guoyubiao@hotmail.com