抑制miR-421表達增強宮頸癌細胞放療敏感性*

潘雨露， 吳淑霞， 石翠格， 任興業△

(1濟南市第五人民醫院婦產科， 山東 濟南 250022； 2中國計劃生育研究所細胞生物學實驗室， 北京 100081)

抑制miR-421表達增強宮頸癌細胞放療敏感性*

潘雨露1， 吳淑霞1， 石翠格2， 任興業1△

(1濟南市第五人民醫院婦產科， 山東 濟南 250022；2中國計劃生育研究所細胞生物學實驗室， 北京 100081)

目的： 研究抑制miR-421表達增強宮頸癌細胞放療敏感性的分子機制。方法: 運用脂質體2000將miR-421 inhibitor轉染4株宮頸癌細胞系HeLa、SiHa、C33A和CaSki，以轉染陰性核苷酸為對照，real-time PCR檢測子宮內膜上皮細胞ESC細胞和4株宮頸癌細胞中miR-421的表達水平；轉染的細胞經不同劑量電離輻射(0、2、4、6和8 Gy)處理48 h后運用MTT法、ELISA和Annexin V-FITC/PI染色法聯合流式細胞術分別測定細胞活力、乳酸脫氫酶(LDH)漏出率和細胞凋亡率；運用Western blot檢測細胞中cleaved caspase-9、caspase-9、cleaved PARP、PARP、Bcl-2和Bax蛋白的水平。結果: miR421在ESC細胞中低表達，而在4株宮頸癌細胞中高表達，轉染miR-421 inhibitor后miR-421顯著低于陰性對照組(P<0.05)。相同條件下，輻照后低表達miR-421的宮頸癌細胞活力和LDH漏出率顯著低于陰性對照組，72 h的細胞凋亡率明顯增加(P<0.05)。Western blot結果顯示，電離輻射后與陰性對照組比較，低表達miR-421的宮頸癌細胞中cleaved caspase-9、cleaved PARP和Bcl-2的蛋白水平明顯增高，而Bax蛋白水平顯著降低(P<0.05)。結論: miR-421在正常子宮內膜上皮ESC細胞中低表達，而在宮頸癌細胞系中高表達；下調miR-421表達能抑制宮頸癌細胞的活力，顯著增強宮頸癌細胞的輻射敏感性，其機制至少部分通過激活caspase-9細胞凋亡通路進而促進抗凋亡蛋白Bcl-2表達和抑制促凋亡蛋白Bax表達而實現。

宮頸癌； miR-421； 電離輻射； 放療敏感性； 細胞凋亡

宮頸癌是一種嚴重威脅婦女健康與生命的惡性腫瘤，其發病率和死亡率位居所有腫瘤的第2位。資料顯示全球每年約有50萬新增病例，其中我國每年有約13.1萬宮頸癌患者[1-2]，發病率和死亡率呈逐年增加及年輕化趨勢[3]。目前手術和放療是宮頸癌的主要治療方案，但轉移、放療耐受的宮頸癌卻很難徹底根治。因此,尋找和研發增強宮頸癌放療敏感性的靶向藥物迫在眉睫。

微小RNAs(microRNAs, miRNAs，miR)是一類長度約21～25 nt的非編碼小RNA分子，在細胞增殖、分化、凋亡和腫瘤發生等生理或病理學進程中扮演著重要的角色[4]。大量的研究表明miRNAs的異常表達與多種腫瘤的發生發展密切相關[5-7]。已有研究證實，miR-210[8]、miR-193b[9]和miR-221/miR-222[10]異常表達與多種腫瘤細胞的放療耐受有關。研究證實miR-421在神經母細胞瘤、胰腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤中高表達[11-12]，表明miR-421是一種腫瘤促進因子。Zhou等[13]發現下調miR-421表達顯著抑制胃癌細胞異種移植腫瘤的生長。最新研究發現miR-421在MCF-7/ADR耐藥細胞中的表達明顯降低[14]。目前，miR-421在宮頸癌發生發展中的生物學功能以及下調miR-421的表達能否增強宮頸癌細胞的放療敏感性尚無報道。本研究旨在觀察下調miR-421表達對宮頸癌細胞放療敏感性的影響，并探討其分子機制，為以miR-421為靶點聯合放療的宮頸癌治療方案提供科學依據。

材 料 和 方 法

1 細胞系與試劑

子宮內膜上皮細胞系ESC購自ATCC；宮頸癌細胞系HeLa、SiHa、C33A和CaSki購自中國科學院上海細胞生物研究所；DMEM培養基(Gibco)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和胰酶購自北京同立海源生物科技有限公司；雙抗、MTT和DMSO購自Sigma；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH) ELISA試劑盒和Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自南京博泰生物技術有限公司；miR-421 inhibitor和陰性對照核苷酸片段購自Sigma；microRNA提取試劑盒和TaqMan? miRNA試劑盒購自Applied Biosystems；脂質體2000購自Invitrogen；抗cleaved caspase-9、caspase-9、cleaved PARP和PARP抗體購自Cell Signaling Technology；抗Bcl-2和Bax抗體購自Abcam；抗β-actin抗體購自Santa Curz；BCA試劑盒購自Thermo。

2 方法

2.1 細胞培養 ESC、HeLa、SiHa、C33A和CaSki細胞培養于含10% FBS、1%青霉素和1%鏈霉素的DMEM培養基中，置于37 ℃、5% CO2及95%濕度的培養箱，細胞融合度達到80%～90%時進行細胞傳代。

2.2 細胞轉染 將生長良好的HeLa、C33A、SiHa和CaSki細胞消化計數后，以細胞密度為每孔2.5×104個接種到6孔板中，置于CO2培養箱中待細胞融合度達到60%時按照脂質體2000說明書進行miR-421 inhibitor細胞轉染。轉染的細胞培養4 h后換成完全培養基；以轉染陰性對照核苷酸片段為陰性對照，細胞置于培養箱中培養用于后續實驗。

2.3 Real-time PCR 轉染的細胞培養48 h時刮下細胞、離心收集，按照mirVanaTMmiRNA分離試劑盒提取細胞miRNA；運用TaqMan? miRNA檢測試劑盒檢測miR-421的表達水平，采用SYBR GreenⅡ熒光染料法和IQ5TMReal-Time PCR Detection System(Bio-Rad)進行real-time PCR數據分析，內參照采用U6，miR-421的相對表達量用2-ΔΔCt表示。進行3次獨立重復實驗。

2.4 電離輻射 采用X射線照射，放射劑量率為2.0 Gy/min。運用0.5 mm鋁過濾器對X射線進行過濾。實驗分為3種細胞：未轉染對照細胞、轉染miR-421 inhibitor的細胞和陰性對照細胞。細胞經不同劑量(0、2、4、6和8 Gy)輻射處理，用于后續研究。

2.5 MTT實驗檢測細胞活性 放射處理的細胞經消化計數后，以細胞密度為每孔2.5×104個接種到96孔板中，置于 CO2培養箱中培養48 h后進行MTT實驗，同時設空白對照組。每孔加入20 μL 5 g/L MTT，37 ℃繼續培養4 h，棄掉培養液，每孔加入150 μL DMSO，置于搖床上室溫振蕩5 min，用酶標儀測定490 nm處的吸光度(A)值，按下式計算細胞活力抑制率：細胞增殖抑制率(%)=(對照組A值-實驗組A值)/實驗組A值×100%。

2.6 測定LDH漏出率 放射處理的細胞以每孔2.5×104個接種于96孔板中，同時設細胞自然釋放對照組(DMEM培養基)和最大釋放對照組(0.8% Triton X-100)，每組各設5個復孔。37 ℃、5% CO2溫箱中培養48 h，最大釋放孔在結束培養前加入終濃度為0.8%的Triton X-100，作用45 min。分別從對應的培養板中取100 μL上清加入ELISA板中，37 ℃孵育10 min后, 加入新鮮配制的100 μL LDH底物溶液，室溫避光反應15 min，每孔加入1 mol/L 檸檬酸終止液30 μL，用酶標儀在490 nm 處讀取各孔A值, 并計算LDH漏出率：LDH漏出率(%)=(實驗組A值-自然釋放對照組A值)/(最大釋放對照組A值-自然釋放對照組A值)×100%。

2.7 細胞凋亡的檢測 轉染的細胞消化計數后接種到6孔板中，培養24 h后經5 Gy輻射處理；細胞培養72 h后棄掉培養基，PBS洗滌，細胞經無EDTA的胰酶消化收集細胞，加入PBS制成細胞懸液。按照Annexin V試劑盒說明書操作，先加入500 μL的binding buffer重懸細胞，再加入5 μL FITC標記的Annexin V和5 μL PI混勻，室溫下避光孵育15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

2.8 Western blot實驗 照射處理的細胞經消化，離心收集細胞，加入RIPA(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，150 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1% SDS)重懸細胞，超聲破碎、12 000 r/min，4 ℃離心10 min，按照BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度。取30 μg進行SDS-PAGE，將蛋白轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉，孵育 I 抗(cleaved caspase-9、caspase-9、cleaved PARP、PARP、Bcl-2和Bax抗體)，以β-actin為內參照，4 ℃過夜。洗膜、孵育 II 抗，室溫1 h。ECL顯影后掃描，蛋白相對表達量經內參照校正后經ImageJ軟件分析。

3 統計學處理

每個實驗進行3次獨立重復試驗。應用SPSS 17.0統計軟件進行相關數據分析，結果用平均值±標準差(mean±SD)表示，兩組間的比較采用t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 miR-421在宮頸癌細胞中的表達

如圖1所示，miR-421在HeLa、SiHa、C33A和CaSki細胞中高表達，而在ESC細胞中低表達，分別與4株宮頸癌細胞比較差異具有統計學意義(P<0.01)；當宮頸癌細胞轉染miR421 inhibitor后miR-421顯著降低，與陰性對照組比較差異具有統計學意義(P<0.01)。

Figure 1.The level of miR-421 expression was detected by real-time PCR in the cervical cancer cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsESC;##P<0.01vsnegative control.

圖1 Real-time PCR檢測宮頸癌細胞中miR-421的表達水平

2 電離輻射對低表達miR-421宮頸癌細胞活性的影響

如圖2所示，隨著輻射劑量的增加4株宮頸癌細胞活性逐漸降低；相同條件下，轉染miR-421 inhibitor的宮頸癌細胞經不同劑量電離輻射后，細胞活性顯著低于陰性對照組，其差異具有統計學意義(P<0.05)。這提示抑制miR-421的表達可提高宮頸癌細胞對電離輻射的敏感性。

3 電離輻射對低表達miR-421宮頸癌細胞LDH漏出率的影響

如圖3所示，隨著輻射劑量的增加，4株宮頸癌細胞中LDH漏出率逐漸降低；相同條件下，轉染miR-421 inhibitor的宮頸癌細胞經不同劑量電離輻射后，LDH漏出率顯著低于陰性對照組，其差異具有統計學意義(P<0.05)。結果提示抑制miR-421表達能抑制宮頸癌細胞增殖以及明顯提高宮頸癌細胞對電離輻射敏感性。

4 電離輻射對低表達miR-421宮頸癌細胞凋亡的影響

如圖4所示，5 Gy電離輻射能誘導4株宮頸癌細胞凋亡，HeLa、SiHa、C33A和CaSki細胞凋亡率分別為(24.7±3.3)%、(20.8±2.8)%、(19.9±3.0)%和(18.9±2.2)%；相同條件下，下調miR-421表達后HeLa、SiHa、C33A和CaSki細胞凋亡率分別為(46.1±5.5)%、(68.7±7.8)%、(56.1±6.5)%和(45.7±4.8)%，均顯著低于陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。以上結果表明，抑制miR-421表達可促進電離輻射誘導的宮頸癌細胞凋亡。

Figure 2.The effect of various doses of ionizing radiation on the viability of cervical cancer cells with miR-421 low expression. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsnegative control.

圖2 不同劑量電離輻射對低表達miR-421宮頸癌細胞活力的影響

Figure 3.The effect of miR-421 down-regulation on the LDH leakage rate of cervical cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsnegative control.

圖3 下調miR-421表達對宮頸癌細胞LDH漏出率的影響

Figure 4.The effect of ionizing radiation on apoptosis of the cervical cancer cells with miR-421 low expression. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnegative control.

圖4 電離輻射對低表達miR-421宮頸癌細胞凋亡的影響

5 電離輻射對miR-421低表達宮頸癌細胞凋亡通路的影響

Western blot結果顯示，抑制miR-421表達促進caspase-9和PARP蛋白發生裂解，提示caspase-9通路被激活；促凋亡蛋白Bcl-2的表達水平顯著增加，而抗凋亡蛋白Bax的表達水平顯著降低，提示抑制miR-421表達激活細胞凋亡通路，電離輻射能增強miR-421下調介導的細胞凋亡通路活性，調控Bcl-2/Bax表達，從而促進細胞凋亡，見圖5、表1。本研究結果提示，抑制miR-421表達可能通過激活細胞凋亡通路誘導細胞凋亡從而增強宮頸癌細胞對放療的敏感性。

討 論

宮頸癌細胞對放療產生耐受嚴重影響患者預后和生存率，鱗狀宮頸癌是宮頸癌的主要類型，80%的宮頸癌患者屬于鱗狀宮頸癌，這類腫瘤對放療敏感，但是宮頸癌細胞群中的小部分惡性腺瘤或腫瘤干細胞對放療耐受是導致腫瘤復發和預后不良的主要原因[15-16]。研究發現局部或遠距離轉移性宮頸癌患者對放療產生抗性，導致預后不良[15]。因此，增強宮頸癌細胞的放療敏感性是改善患者預后的重要手段，尋找和研發增強腫瘤細胞對放療敏感性藥物迫在眉睫。

大量研究表明microRNA異常表達與腫瘤細胞放療耐受密切相關。研究發現let-7 miRNA過表達通過調控RAS和DNA損傷修復基因的表達增強肺癌細胞的放療敏感性[17]；miR-218低表達與宮頸癌惡性程度和預后不良相關[18]。因此，以micoRNA為靶點研發特異性增強宮頸癌細胞的放療敏感性是宮頸癌治療的熱點研究領域。目前以miR-34為靶點的原發性肝癌靶向藥物(NCT01829971)和以miR-122為靶點的慢性丙型肝炎靶向藥物(NCT01872936)正在進行臨床I期和II期試驗[19-20]。研究發現miR-421在胃癌組織中的表達水平顯著高于正常非癌旁組織，其在早期胃癌發生過程中扮演著重要作用[21]。本研究結果顯示，miR-421在正常子宮內膜上皮細胞ESC中低表達，而在4株宮頸癌細胞系中高表達，提示miR-421在宮頸癌發生發展中具有重要作用。最新研究發現miR-421低表達與MCF-7/ADR細胞耐藥密切相關[14]。本研究發現，低表達miR-421的宮頸癌細胞經電離輻射后細胞活性和LDH漏出率顯著低于陰性對照組，提示抑制miR-421表達能增強宮頸癌細胞的放療敏感性。

Figure 5.The effect of ionizing radiation on apoptosis pathway in the cervical cancer cells with miR-421 low expression.

圖5 電離輻射對miR-421低表達宮頸癌細胞凋亡通路的影響

表1 電離輻射對miR-421低表達宮頸癌細胞中細胞凋亡相關蛋白表達的影響

Table 1.The effect of ionizing radiation on expression of apoptosis-associated proteins in the cervical cancer cells with miR-421 low expression (Mean±SD.n=3)

Cellline GroupCleavedcaspase-9Caspase-9CleavedPARPPARPBcl-2BaxHeLaNegativecontrol0.17±0.021.02±0.120.34±0.051.10±0.060.31±0.021.05±0.07miR-421inhibition0.86±0.11**1.13±0.091.16±0.07**1.14±0.031.20±0.08**0.18±0.03**SiHaNegativecontrol0.11±0.010.90±0.070.25±0.070.89±0.110.58±0.081.82±0.11miR-421inhibition0.76±0.04**0.93±0.081.07±0.04**1.02±0.091.04±0.10*0.20±0.05**C33ANegativecontrol0.15±0.080.82±0.020.37±0.081.12±0.050.40±0.030.73±0.02miR-421inhibition0.88±0.05**0.89±0.072.04±0.22**1.08±0.081.42±0.10**0.12±0.08**CaSkiNegativecontrol0.09±0.010.60±0.050.18±0.060.70±0.070.08±0.000.66±0.02miR-421inhibition0.67±0.03**0.58±0.092.15±0.12**0.75±0.012.18±0.14**0.11±0.01**

*P<0.05，**P<0.01vsnegative control.

電離輻射殺死腫瘤細胞可能的分子機制在于激活細胞凋亡通路誘導細胞凋亡[22]。凋亡相關基因表達異常或功能缺失導致細胞對外界刺激失敏，從而產生抗性。本研究發現miR-421低表達的宮頸癌細胞發生了細胞凋亡，經電離輻射后細胞凋亡率顯著高于陰性對照組細胞，提示抑制miR-421表達能增強電離輻射介導的細胞凋亡，宮頸癌細胞對電離輻射的敏感性增加。死亡受體和線粒體介導的細胞凋亡是細胞凋亡主要的信號通路，caspase家族在細胞凋亡中具有重要作用，胞外死亡受體與相應配體結合、DNA損傷、缺氧及生長因子等激活caspase通路，導致細胞內重要蛋白質降解從而誘導細胞凋亡[23]。本研究發現miR-421低表達促進caspase-9和PARP蛋白降解，提示caspase通路被激活；經電離輻射后cleaved caspase-9和cleaved PARP蛋白表達水平顯著升高，抗凋亡蛋白Blc-2表達升高，而促凋亡蛋白Bax表達降低，細胞凋亡率明顯增高，提示抑制miR-421表達通過激活細胞凋亡通路誘導細胞凋亡，最終增強宮頸癌細胞對放療敏感性。基于以上研究，以miR-421為靶向藥物聯合放療有望成為miR-421高表達宮頸癌患者的新型治療方案。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Inhibition of miR-421 expression enhances radiosensitivity of cervical cancer cells

PAN Yu-lu1, WU Shu-xia1, SHI Cui-ge2, REN Xing-ye1

(1DepartmentofObstetrics&Gynecology,TheFifthPeople’sHospitalofJinan,Jinan250022,China;2LaboratoryofCellBiology,InstituteofFamilyPlanninginChina,Beijing100081,China.E-mail:wuyuanrenxingye@163.com)

AIM: To investigate the molecular mechanism of inhibition of miR-421 expression promoting radiosensitivity in the cervical cancer cells. METHODS: Cervical cancer lines HeLa, SiHa, C33A and CaSki were transfected with miR-421 inhibitor or negative control nucleotide using Lipofectamine 2000 kit, and the levels of miR-421 expression in the cervical cancer lines and endometrial epithelium cell line ESC were detected by real-time PCR. These cells with transfection were exposed to various doses of X-ray (0, 2, 4, 6 and 8 Gy). After 48 h, the cell viability, LDH leakage rate and apoptotic rate were measured respectively by MTT assay, ELISA and flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining. The protein levels of cleaved caspase-9, caspase-9, cleaved PARP, PARP, Bcl-2 and Bax were monitored by Western blot. RESULTS: Low miR-421 levels was found in the ESC cells, while high miR-421 levels were observed in the HeLa, SiHa, C33A and CaSki cells. The level of miR-421 in the cells transfected with miR-421 inhibitor was significantly lower than that in negative control group (P<0.05). The viability and LDH leakage rate of the cervical cancer cells with low miR-421 expression were notablely lower than those in negative control group, and the apoptotic rate at 72 h was remarkablely increased (P<0.05) under the same conditions. The results of Western blot indicated that, after exposure to ionizing radiation, the protein levels of cleaved caspase-9, cleaved PARP and Bcl-2 were significantly increased, while the protein level of Bax was significantly decreased in the cervical cancer cells with low miR-421 expression compared with negative control group (P<0.05). CONCLUSION: miR-421 is lowly expressed in the normal endometrial epithelial cells, but highly expressed in the cervical cancer cells. Down-regulation of miR-421 expression significantly inhibits the growth and enhances the radiosensitivity of cervical cancer cells at least partly via activating caspase-9 apoptosis pathway, thus promoting Bcl-2 and inhibiting Bax expression.

Cervical cancer; miR-421; Ionizing radiation; Radiosensitivity; Apoptosis

1000- 4718(2017)05- 0798- 07

2016- 11- 02

2017- 01- 16

山東省醫藥衛生資助項目(No. 2013WS0010)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.006

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