ATP結合盒轉運體與肝癌化療耐藥相關性的研究進展

劉文斌+曹廣文

摘要：化療耐藥是當前肝癌治療的主要問題。ATP結合盒（ABC）轉運體家族通過誘導腫瘤細胞藥物外排導致耐藥。ABCB1是介導肝癌耐藥的主要ABC轉運體亞型，其表達與肝癌細胞的干性特征相關。炎癥和癌癥相關的多種信號通路關鍵分子協同調節了ABC轉運體的表達。維拉帕米可以通過抑制ABCB1功能而逆轉肝癌的耐藥性。對于ABC轉運體和肝癌耐藥性的深入研究可以進一步完善癌癥治療策略，降低患者死亡率。

關鍵詞：肝癌；耐藥；ATP結合盒轉運體；維拉帕米

1 肝癌的化療耐藥

我國是肝癌大國，肝癌患者數量和相關死亡人數均占世界總數的50% [1]。肝癌的惡性程度高、預后較差，發病率和死亡率的比值接近1：1 [1]。目前原發性肝癌的治療分為根治性策略（射頻消融術、肝部分切除術、肝移植術）和姑息性治療策略（化學栓塞療法、索拉非尼靶向治療）兩類。循證醫學研究證實，巴塞羅那臨床肝癌分期（Barcelona Clinic Liver Cancer，BCLC）的早期患者（BCLC-0和BCLC-A）可以接受根治性療法，但中晚期患者（BCLC-B和BCLC-C）接受根治性手術的收益不顯著，選擇姑息性治療策略可以明顯延長生存時間 [2]。但大部分患者在確診時已經處于中晚期，嚴格滿足國際推薦手術指征的患者僅有10% [3]，部分患者需進行輔助化療后才能獲得手術治療機會[9]。同時，HCC切除術后的復發率較高，國際數據顯示50%的患者在術后2年內復發，75%的患者在術后5年內復發，術后化療是防治復發的重要措施 [4]。因此，經典抗腫瘤化學藥物和靶向藥物治療是延長絕大多數手術和非手術肝癌患者生存時間的主要手段。然而，當前的肝癌化療效果仍嚴重受到腫瘤耐藥性的限制。臨床隨機對照研究的薈萃分析顯示，標準化療藥物在肝癌中的反應率僅有50%左右 [3]。索拉非尼是目前唯一由美國食品藥品安全管理局批準使用的肝癌靶向治療藥物，對患者生存期的延長也僅有3個月 [3]。基于我國社區人群的10年癌癥數據統計證實，肝癌患者的術后5年生存率僅為32.64% [5]。腫瘤的耐藥性可以分為2種：一是針對曾經接觸過的藥物，產生特異性的耐藥機制；二是對多種化學組成并不相似、腫瘤細胞也從未接觸過的藥物產生抵抗，稱為多藥物抵抗[l1]（multi-drug resistance，MDR）。單一藥物的耐藥機制多樣，比如靶蛋白改變、藥物代謝增加等，解決方法也相應更為困難。而MDR的機制則較為單一，是由ATP結合盒（ATP binding cassette，ABC）轉運體家族將藥物“外泵”，進而減少腫瘤細胞內藥物積累導致 [6]。

2 ABC轉運體誘導肝癌耐藥

2.1 ABC轉運體家族及基本結構功能

ABC轉運體家族分為7個亞型（A-G）共48種分子。其中發現最早、被證明與人類腫瘤耐藥性聯系最緊密的是B1亞型（ABCB1），稱多藥物抵抗蛋白1（MDR1）或P糖蛋白（P-glycoprotein，Pgp）。ABCB1也是目前蛋白質結構和功能最為明確的分子。該蛋白由4個功能性結構域組成：2個核甘酸結合結構域（nucleotide-binding domains，NBDs）以及2個跨膜螺旋結構域（transmembrane helice domains，TMDs），每個TMD包含6個跨膜螺旋。NBDs位于細胞內，通過水解ATP為ABCB1/MDR1/Pgp轉運底物分子提供能量。TMDs組成可閉合的通道結構，當疏水性的底物分子進入細胞脂質雙分子層的中間，尚未進入細胞質時，即可與TMDs結合并被“泵出” [7]。ABCB1/MDR1/Pgp的底物識別結構域很多，12個跨膜螺旋均含有底物結合位點，不同結合位點在空間位置上較為緊密，但識別和結合的藥理結構并不相同，因此可以同時誘發多種藥物的耐藥現象。肝癌細胞中的研究發現，該蛋白不僅在細胞膜上分布并增加藥物的外排，同時還分布在細胞囊泡和溶酶體表面，阻礙了進入細胞的藥物被隔離分解，從而增加肝癌耐藥性 [8]。其余ABC轉運體家族的結構與ABCB1相似，只是NBDs和TMDs數量有差異。ABC轉運體家族誘導的藥物抵抗種類廣泛。一項藥物基因組學研究利用包括肝癌細胞在內的60種細胞系進行了所有ABC轉運體亞型的mRNA表達水平檢測；結合這些細胞已經進行的藥物篩選數據，該研究發現共有1429種藥物的腫瘤敏感性與ABC轉運體的表達成負相關 [9]。

2.2 ABC轉運體表達與肝癌細胞耐藥

細胞和動物模型研究中已經明確與肝癌相關的亞型是ABCB1/MDR1/Pgp [10]。該亞型可以主動轉運的腫瘤化療藥物種類最多，包括經典的細胞毒藥物，如蒽環類（柔紅霉素、多柔比星、表阿霉素）、蒽類（比生群、米托蒽醌）、生物堿類（長春堿、長春新堿、喜樹堿）和微管蛋白聚合抑制劑（紫杉醇、秋水仙素、多西他賽）以及新一代靶向藥物，如伊馬替尼、厄洛替尼和舒尼替尼等 [9]。使用上述藥物選擇出的耐藥細胞株中ABCB1/MDR1/Pgp均顯著高表達 [11]。

耐藥細胞株的構建維持需要藥物持續刺激。值得注意的是，在藥物刺激后期，耐藥細胞株會還會高表達ABCB1/MDR1/Pgp以外的家族類似物，比如ABCA2、ABCC1、ABCC2、ABCC4和ABCG2。同時，一些ABC轉運體亞型從未發現在耐藥細胞系中高表達，但轉染正常細胞后同樣可以導致MDR，比如ABCB11、ABCC3、ABCC5、ABCC6、ABCC10和ABCC11 [9]。雖然上述研究并不都是在肝癌細胞模型下完成，但也提示實際肝組織中的MDR可能并不是ABCB1/MDR1/Pgp單獨作用的結果，而且長期藥物壓力選擇下，主要驅動MDR現象的ABC轉運體亞型也會出現改變。

2.3 ABC轉運體是肝癌干細胞的標志性分子

ABCB1/MDR1/Pgp 及其家族類似物的表達水平不僅誘導了腫瘤耐藥，還促進了侵襲、增殖和低分化等惡性表型。未治療過的原發性HCC組織中ABCB1/MDR1/Pgp顯著高表達，而且與分化水平、癌癥分級、腫瘤大小、血管侵襲、淋巴節轉移以及預后相關 [12]。同時，ABCB1/MDR1/Pgp也在肝祖細胞和CD434+肝干細胞中高表達，含有致癌性突變K7/K19的肝祖細胞中還同時高表達ABCC1和ABCG2 [12] [13]。ABCC1與前列腺癌、肺癌和乳腺癌化療耐藥有關，ABCG2則與乳腺癌和白血病的耐藥性有關 [13]。機制研究發現，ABCB1/MDR1/Pgp可以激活抗凋亡蛋白BCL-2和BCL-XL以抑制正常細胞和癌癥細胞對凋亡信號的反應，使用ABCB1/MDR1/Pgp抗體可以逆轉這一作用 [13]。ABC相關的遺傳多態性也促進了肝癌的發生風險，比如基于北歐人群的全基因組分析發現ABCB4上的單堿基突變與肝臟疾病的發生有關 [14]。因此可以推測，除了直接誘導藥物外排，ABCB1/MDR1/Pgp作為腫瘤干性分子，還在化療后促進新的肝癌干細胞亞型增殖形成再發腫瘤。

2.4 ABC轉運體的藥物代謝功能

ABC轉運體是進化十分保守的分子，其“外泵”作用不僅與腫瘤耐藥性有關，也維持了細胞自身的穩態，參與了多種正常的生理功能，包括化合物的經腸道外排和肝腎代謝 [9]。正常情況下，該蛋白在全身各組織中低劑量表達，但會顯著集中在個別器官，比如肝小管周圍的肝細胞、腎小管細胞和腸道細胞。這些組織細胞的ABC轉運體通過向體外分泌化合物，加速藥物外排，降低血藥濃度和體液環境中的藥物濃度，影響化療效果。ABCB1/MDR1/Pgp敲除小鼠的口服藥物血液濃度要高于正常小鼠；聯合使用ABCB1/MDR1/Pgp抑制劑可以提高口服藥的生物有效率 [15]。意大利人群研究發現，ABCB11和ABCB4的單核苷酸多態性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）低頻基因型會導致這兩種基因的表達沉默，其上游調控通路MAPK和JNK通路的擴增突變也會抑制ABCB11和ABCB4的表達，進而阻礙膽汁酸鹽的外排，引發肝細胞的慢性炎癥，增加肝癌的發生風險 [16]。

2.5 ABC轉運體表達的調節

ABC轉運體的轉錄調控因子和表觀遺傳修飾位點眾多。ABCB1基因的啟動子無典型的“TATA盒”序列，而是以啟動元件（initiator，Inr）控制。多種轉錄因子結合位點重疊分布在Inr前的啟動子區域，主要可以分為3類：結合顛倒CCAAT盒（“Y”盒）的NF-Y和YB-1蛋白，結合CAAT盒的c-fos和NF-κB蛋白，以及結合GC盒的Sp1-3、EGR1和WT1蛋白 [9]。以Sp1-3與NF-Y為主，可以組成“MDR1增強子”元件，富集組蛋白乙酰化酶P/CAF，進而乙酰化近ABCB1啟動子的組蛋白，提高ABCB1的轉錄水平 [17]。與之相對應的是，甲基化DNA結合蛋白MeCP2可以識別并結合ABCB1啟動子上的甲基化位點，并富集組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC），使最近的組蛋白構象趨于緊密，進而抑制ABCB1轉錄 [18]。

ABC轉運體的表達是應激反應、炎癥和癌癥信號通路協同作用的結果。利用化合物誘導的小鼠肝臟炎癥模型中發現，IL-6可以激活CAAT增強子結合蛋白（C/EBPb）進而增強小鼠ABCB1基因的轉錄；糖皮質激素可以刺激倉鼠C/EBPb的同源受體，達到類似的效果 [19] 。ABCB1基因近段啟動子可以被p53調節，野生型p53可以抑制ABCB1轉錄，而突變型p53及p53家族的兩個亞型（p63和p73）則可以激活ABCB1轉錄，野生型和突變型p53結合的具體位點也不相同 [9]。人類腺病毒感染肺癌細胞會誘導ABCB1/MDR1/Pgp表達增高 [20]，乙肝病毒感染是否會有相似的作用尚不明確。

3 ABC轉運體抑制劑及其肝癌治療價值

ABC轉運體抑制劑的主要作用機理是結合TMD上的藥物識別位點，進而阻礙其“外泵”功能。奎寧、硝苯地平、利福平和維拉帕米等藥物均可以抑制ABCB1/MDR1/Pgp功能。其中，維拉帕米可以識別并結合的位點最多，因此逆轉腫瘤耐藥性的能力最突出 [7]。這最早在乳腺癌和卵巢癌的隊列研究中得到了驗證 [9， [21]。限制維拉帕米臨床應用的是其鈣通道抑制作用引發的心血管系統不良反應。體外實驗證明，維拉帕米濃度在6-10mol/L（2.94-4.91g/mL）時可以完全抑制ABCB1/MDR1/Pgp，并逆轉腫瘤細胞多耐藥情況。但是血清濃度僅1-2mol/L時即可產生心血管系統的不良反應，如低血壓、心動過緩等 [10]。之后的第二代藥物（如PSC833）和第三代藥物（LY335979）在研發時均以降低毒性為主要方向。雖然這些新藥在細胞和動物實驗室起到了良好的藥物抵抗作用，但在三期臨床試驗時卻都沒有顯著的療效[l2] [22]。因此，維拉帕米仍然是臨床研究驗證過的，目前最有效、也可以最快應用于臨床的ABCB1/MDR1/Pgp抑制劑。

在肝癌的臨床治療實踐中發現，維拉帕米抗耐藥治療的副作用可以通過改變給藥途徑解決。肝正常組織的營養由門靜脈提供，而HCC則依賴于肝動脈系統，利用這一特點的經動脈化學栓塞療法（transarterial chemoembolization，TACE）是當前主要的HCC藥物治療手段。隨著相關臨床和基礎研究的發展，肝臟定向藥物療法和手術治療在延長患者生存期上的差距大幅減小 [3]。使用TCGA 進行維拉帕米的肝定向給藥，局部微環境的維拉帕米濃度是血液的3-10倍，并遠超過抑制ABCB1/MDR1/Pgp活性的臨界值，進而可以實現避免心臟毒性條件下的抗肝癌耐藥治療，收到了較好的療效 [23]。

4小結

腫瘤多藥物抵抗現象是限制肝癌化療效果的主要原因。ABC轉運體家族是誘導MDR產生的核心分子，其主要機制包括：介導肝癌細胞的藥物外排、促進機體對藥物的代謝以及參與腫瘤干細胞導致的肝癌再發。ABC轉運體的表達受到炎-癌相關信號網絡的調節。維拉帕米可以抑制ABCB1功能，通過靶向腫瘤血管給藥可以實現無心臟毒副作用的維拉帕米抗肝癌耐藥治療。通過進一步的分子流行病學和機制研究，可以確定ABC轉運體及其核心調控分子在肝癌進化發育中后期的變化規律，揭示與肝癌耐藥風險相關的生物標志和治療靶點。從而進一步完善肝癌管理的第三級預防，有效延長患者生存時間。

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