微波協同復合酶法提取猴頭菇多糖工藝研究

周小偉，陳勇輝，葉若松，熊艷，劉惠欣，葉曉瑜，鐘瑞敏，*

（1.韶關學院英東食品科學與工程學院，廣東韶關512005；2.江西生物科技職業學院，江西南昌330200；3.江西科技師范大學生命科學學院，江西南昌330013；4.江西省農業科學院質量安全與標準研究所，江西南昌330200）

微波協同復合酶法提取猴頭菇多糖工藝研究

周小偉1，陳勇輝2，葉若松3，熊艷4，劉惠欣1，葉曉瑜1，鐘瑞敏1，*

（1.韶關學院英東食品科學與工程學院，廣東韶關512005；2.江西生物科技職業學院，江西南昌330200；3.江西科技師范大學生命科學學院，江西南昌330013；4.江西省農業科學院質量安全與標準研究所，江西南昌330200）

以猴頭菇子實體為原料，研究微波協同復合酶法提取猴頭菇多糖的工藝，并將復合酶法與微波協同復合酶法提取猴頭菇多糖的得率進行對比。微波協同復合酶法提取猴頭菇多糖的最佳工藝條件為酶添加量2.0%，酶解pH4.5，酶解時間150 min，酶解溫度50℃，微波功率119 W，料液比1∶15（g/mL），微波時間150 s，該條件下猴頭菇多糖提取率達到19.13%。

猴頭菇；多糖；復合酶；微波酶法

猴頭菇又名猴頭蘑、猴頭菌等，是著名的藥食兩用菌，因其子實體形狀神似猴子頭部而得名。猴頭菌中最主要的活性物質即為猴頭菇多糖，它是生命有機體內非常重要的組成部分。猴頭菇多糖不僅具有合成高分子所不具備的特殊生物活性，還具有各種各樣的生物學功能[1]。研究表明，猴頭菇多糖具有降低血脂、防止衰老、抑制腫瘤、提高免疫力等特殊生理功能，可普遍應用在醫藥范疇及保健食品領域。

目前報道的對猴頭菇多糖提取的方法主要有熱水浸提法[2-4]、酶法[5-6]、超聲波提取法[7-8]、超聲酶法[9]等。但是熱水浸提法所需時間較長，提取率較低。近年來，酶制劑由于其獨特的安全性及高效性，越來越多的被應用于食用菌的功能活性提取方面。本文以猴頭菇為原料，采用微波協同復合酶，利用正交試驗方法對提取工藝進行優化，并和復合酶提取多糖對比，分析兩種方法對于猴頭菇多糖得率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干猴頭菇：購自韶關五馬寨菌業有限公司；葡萄糖、蒸餾水、無水乙醇、苯酚、氯仿、正丁醇、濃硫酸、檸檬酸、檸檬酸鈉等試劑均為國產分析純；纖維素酶（100 000 U/g）和果膠酶（100 000 U/g）為食品級。

1.2 儀器設備

主要儀器與設備見表1。

表1 儀器與設備Table 1 Instruments and equipments

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將猴頭菇子實體切成小塊，放入電熱恒溫鼓風干燥箱中，在60℃條件下干燥24 h，至恒重后放入高速粉碎機中粉碎，過30目篩，備用。

1.3.2 提取方法

猴頭菇粉→精確稱重→加復合酶—纖維素酶/果膠酶=1∶1（質量比）→按料液比1∶15（g/mL）加入一定量蒸餾水→過濾→乙醇沉淀→復溶→除蛋白→醇沉→冷凍干燥→猴頭菇多糖→測定。

1.3.3 標準曲線建立

準確稱取無水葡萄糖1.25 g定容至250 mL，再從中吸取5 mL樣液至250 mL的容量瓶，稀釋至刻度，配得濃度為100 mg/L標準葡萄糖樣液。往5支試管中分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的標準樣液，再向試管依次加入蒸餾水，使最終體積均為1 mL。另取蒸餾水1 mL作空白試驗。用移液管向每支試管各加1 mL質量分數為5%的苯酚溶液，搖晃至均勻；緊接著向每支試管內用移液管緩慢加入5 mL濃硫酸，搖勻待測樣品，溫度冷卻至室溫[4]。

在490 nm下，測定不同質量濃度葡萄糖樣品的吸光度。最后，以所測樣品吸光度為縱坐標，以葡萄糖濃度為橫坐標，繪制葡萄糖標準曲線[4]，如圖1所示。葡萄糖標準曲線的線性回歸方程：y=0.998 6x+0.081 4，R2=0.998 8。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 The standard curve of glucose

1.3.4 猴頭菇多糖含量測定

以苯酚-硫酸法測定猴頭菇多糖含量[10]，以葡萄糖作為標準樣品。猴頭菇多糖的得率以式（1）表示。

式中：W為猴頭菇多糖提取率，%；Y為標準曲線所得多糖濃度，mg/mL；n為猴頭菇多糖溶液的稀釋倍數；V為樣品的體積，mL；m為原料質量，mg。

2 結果分析

2.1 復合酶法

2.1.1 酶添加量對猴頭菇多糖提取率的影響

不同酶添加量對猴頭菇多糖提取率的影響見圖2。

圖2 復合酶添加量對多糖提取率的影響Fig.2 The effect of the amount of combined-enzyme on the yield of polysaccharide

由圖2可知，隨著酶添加量的增多，猴頭菇多糖的得率呈不斷上升的趨勢，當酶添加量為2%時，猴頭菇多糖得率最高。之后得率呈略微下降趨勢，這是因為猴頭菇的細胞壁結構主要為纖維素和果膠，當纖維素酶和果膠酶含量適當時，能夠裂解纖維素和果膠，反之，當酶添加量過多時，溶質和溶劑比值也相應升高，從而降低酶解效果。

2.1.2 酶解時間對猴頭菇多糖提取率的影響

酶解時間對猴頭菇多糖提取率的影響見圖3。

圖3 酶解時間對多糖提取率的影響Fig.3 The effect of enzymolysis time on the yield of polysaccharide

從圖3可知，猴頭菇多糖得率隨著酶解時間的延長不斷增加，當酶解時間達到120 min時，可以達到14%的得率，但是隨著酶解時間繼續延長，猴頭菇多糖的得率沒有得到多少提高，這是因為酶解所需的酶消耗的原因。

2.1.3 酶解pH值對猴頭菇多糖提取率的影響

在設定復合酶添加量2%，酶解溫度50℃，酶解時間90 min的前提下，探究不同的酶解pH值對猴頭菇多糖提取率的影響，試驗結果見圖4。

圖4 酶解pH對多糖提取率的影響Fig.4 The effect of pH value on the yield of polysaccharide

由圖4可知，當溶液pH值為4時，酶解效果最好，得到的猴頭菇多糖得率也最高，pH值過低或過高均對酶解效果產生不利影響。這充分說明復合酶的最佳酶活pH條件為4。

2.1.4 酶解溫度對猴頭菇多糖提取率的影響

在設定復合酶添加量2%，復合酶酶解pH 4.0，酶解時間90 min的前提下[11]，探究不同的酶解溫度對猴頭菇多糖提取率的影響，試驗結果見圖5。

由圖5可知，45℃為復合酶的最適作用溫度，此時猴頭菇的多糖提取率達最大值。當酶解溫度低于45℃，復合酶的活性會受到抑制，致使猴頭菇多糖的提取率偏低；隨著酶解溫度的升高，復合酶又容易受熱發生變性，從而降低酶活，導致多糖的提取率也偏低。因此，當酶解溫度在45℃～60℃的范圍內時，溫度越高，猴頭菇多糖提取率越低。試驗確定40℃～50℃為復合酶適宜的酶解溫度。

圖5 酶解溫度對多糖提取率的影響Fig.5 The effect of enzymolysis temperature on the yield of polysaccharide

2.1.5 正交試驗

在復合酶法單因素試驗的基礎上設計正交試驗，優化復合酶法提取猴頭菇多糖的工藝，從而確定最佳提取工藝參數，并且考察各因素對猴頭菇多糖提取率影響的主次順序。選擇對多糖得率影響較大的4個因素（酶添加量、酶解時間、酶解pH值、酶解溫度）設計L9（34）的正交試驗，所有試驗均重復3次，所測多糖得率取平均值。復合酶法正交試驗結果見表2。

表2 復合酶法正交試驗結果Table 2 Orthogonal experiment results of complex protease method

極差Rj分析表明，4個因素影響猴頭菇多糖提取率的主次關系為：酶解溫度（D）＞酶解時間（B）＞酶解pH值（C）＞酶添加量（A）。正交試驗結果顯示復合酶法最佳工藝條件為A2B3C3D3，在最佳工藝條件下進行驗證試驗，測得猴頭菇多糖提取率為15.62%，高于正交試驗中的最大值。即此次正交試驗確定采用復合酶法提取猴頭菇多糖的最佳工藝參數為酶添加量2.0%，酶解時間150 min，酶解pH4.5，酶解溫度50℃。

2.2 微波協同復合酶法

在復合酶添加量為2.0%（纖維素酶與果膠酶質量比為1∶1），酶解pH值為4.5，酶解溫度50℃條件下水浴酶解150 min，之后進行微波協同復合酶法的單因素及正交試驗。

2.2.1 微波功率對猴頭菇多糖提取率的影響

微波功率對提取率影響見圖6。

圖6 微波功率對提取率的影響Fig.6 The effect of microwave power on the yield of polysaccharide

由圖6可知，當微波功率在119 W～231 W范圍內，猴頭菇多糖提取率隨著微波功率的增大而增大；當微波功率為231 W時，多糖的提取率到達最大值；而后，多糖提取率隨著微波功率的繼續增大而降低。微波功率過大，容易使猴頭菇多糖發生降解，從而降低多糖提取率。試驗確定119 W～385 W為微波功率的考察范圍。

2.2.2 料液比對猴頭菇多糖提取率的影響

料液比對提取率的影響見圖7。

圖7 料液比對多糖提取率的影響Fig.7 The effect of the ratio of raw materials to water on the yield of polysaccharide

由圖7可知，用蒸餾水作為提取猴頭菇多糖的溶劑，當料液比為1∶20（g/mL）時，猴頭菇多糖提取率最高。隨著增大溶劑用量，猴頭菇的多糖提取率呈降低趨勢。為了節約成本，試驗確定1∶15（g/mL）～1∶25（g/ mL）為料液比的考察范圍。

2.2.3 微波時間對猴頭菇多糖提取率的影響

微波時間對提取率影響見圖8。

圖8 微波時間對多糖提取率的影響Fig.8 The effect of the microwave time on the yield of polysaccharide

由圖8可知，當微波時間在90 s～150 s范圍內時，猴頭菇多糖提取率隨著微波時間的延長而升高；當微波時間為150 s時，多糖提取率最高；而后，多糖提取率隨著微波時間的延長而下降。因此，確定微波時間的考察范圍為120 s～180 s。

2.2.4 正交試驗

微波協同復合酶正交試驗設計見表3。

表3 微波協同復合酶正交試驗設計Table 3 Orthogonal experiment design of microwave-enzyme synergistic

在微波協同復合酶法的單因素試驗基礎上，對微波功率、料液比、微波時間這3個因素開展正交試驗，從而確定最佳提取工藝參數，并考察各因素對猴頭菇多糖提取率影響的主次順序。所有試驗均重復3次，所測多糖得率取平均值微波協同復合酶法正交試驗結果見表4。

極差Rj分析表明，3個因素影響猴頭菇多糖提取率的主次關系為：料液比（B）＞微波時間（C）＞微波功率（A）。正交試驗結果顯示微波協同復合酶法最佳工藝條件為A1B1C2。即此次正交試驗確定了采用微波協同復合酶法提取猴頭菇多糖的最佳工藝參數為微波功率119 W，料液比1∶15（g/mL），微波時間150 s。

表4 微波協同復合酶法正交試驗結果Table 4 Orthogonal experiment results of microwave-enzyme synergistic

2.2.5 驗證性試驗

為了考察工藝的穩定性，按微波協同復合酶法的最佳工藝條件A1B1C2進行重復性試驗3次，多糖平均提取率為19.13%，高于按正交試驗中的最高值19.08%。該工藝重復性、穩定性良好。

3 結論

本試驗以猴頭菇子實體為原料，通過單因素試驗和正交試驗，對微波協同復合酶法和復合酶法提取猴頭菇多糖得率進行比較，確定了微波協同復合酶法提取猴頭菇多糖最佳工藝條件。確定微波協同復合酶法的最佳工藝條件為：微波功率119 W，微波時間150 s，料液比1∶15（g/mL）。復合酶提取猴頭菇多糖的最佳工藝條件為：酶添加量2%，酶解時間150 min，酶解pH為4.5，酶解溫度50℃。影響復合酶提取猴頭菇多糖得率的因素大小依次為酶解溫度＞酶解時間＞酶解pH值＞酶添加量。微波協同復合酶法最佳工藝條件下可得到19.13%的猴頭菇多糖得率，比單獨復合酶條件下所得多糖得率提高12.5%。復合酶法最佳工藝條件下可得到15.62%的猴頭菇多糖得率。

通過微波輔助，可以明顯加快猴頭菇子實體顆粒物質的振動，同時，微波對猴頭菇浸提液的加熱和破壞細胞的雙重作用，促使猴頭菇多糖溶出效率更高。

該研究在實驗室條件下通過正交試驗設計為規模提取猴頭菇多糖提供了一定的支撐依據。但是關于微波對復合酶的影響及底物的復合作用機制仍缺乏認知。

[1] 張素斌,黃勁崢.猴頭菇多糖提取方法的比較[J].食品與發酵工業,2014,40(4):233－237

[2] 吳志明,李公斌,辛秀蘭,等.猴頭菇多糖的提取工藝[J].食品研究與開發,2011,32(7):36－38

[3]張樹海.猴頭菇多糖提取及純化的研究[J].食品研究與開發, 2006,27(11):103－106

[4]梁華,李雪林,陸亞春.猴頭菇多糖提取工藝研究[J].食品與機械, 2006,22(1):35－38

[5]趙洪梅,孫君,謝春陽.響應面優化超聲波提取猴頭菇多糖工藝的研究[J].農產品加工(創新版),2011(11):73－77

[6] 胡斌杰,師兆忠.超聲法提取猴頭菇多糖最佳工藝優化研究[J].化學世界,2009(9):557－560

[7]吳美媛,周英,何慧明,等.猴頭菇多糖復合酶法提取及重金屬去除工藝研究[J].食品研究與開發,2013,34(16):15－17

[8] 張帥,沈楚燕,董基.酶法提取猴頭菇多糖的研究[J].河南工業大學學報(自然科學版),2010,31(2):76－79

[9] Chen S,Chen H,Tian J,et al.Enzymolysis－ultrasonic assisted extraction,chemical characteristics and bioactivities of polysaccharides from corn silk[J].Carbohydrate polymers,2014,101:332－341

[10]Zhu C,Liu X.Optimization of extraction process of crude polysaccharides from Pomegranate peel by response surface methodology[J]. Carbohydrate polymers,2013,92(2):1197－1202

[11]陳瑞平,陳瑞戰,張敏,等.復合酶法提取大蒜多糖及其抗氧化活性研究[J].分子科學學報,2012,28(1):47－52

Study on Hericium erinaceus Polysaccharide Extraction by Combined-enzyme Assistant with Microwave

ZHOU Xiao-wei1，CHEN Yong-hui2，YE Ruo-song3，XIONG Yan4，LIU Hui-xin1，YE Xiao-yu1，ZHONG Rui-min1，*
（1.Yingdong College of Food Science and Technology，Shaoguan University，Shaoguan 512005，Guangdong，China；2.Jiangxi Biotech Vocational College，Nanchang 330200，Jiangxi，China；3.School of Life Science，Jiangxi Science&Technology Normal University，Nanchang 330013，Jiangxi，China；4.Institute for Quality Safety and Standards of Agricultural Products，Jiangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanchang 330200，Jiangxi，China）

In order to achieve the promoted method of extracting Hericium erinaceus，combined-enzyme and microwave-enzymatic method was used in the technique of extracting polysaccharide from Hericium erinaceus. The results was revealed that the optimal extraction condition were：2.0%amount of enzyme，4.5 of pH value，150 min of enzymatic hydrolysis time；50℃of enzymatic hydrolysis temperature，119 W of microwave power，1∶15（g/mL）of material-liquid ratio and 150 s of microwave time，which the content of polysaccharide could reach 19.13%.

Hericium erinaceus；polysaccharide；combined-enzyme；microwave-enzymatic method

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.011

2016－09－04

廣東省公益研究與能力建設專項（2015A010107018）；韶關學院科研項目（SY2014KJ16）；韶關學院大學生創新創業訓練項目（Sycxcy2016-007）

周小偉（1986—），男（漢），講師，在讀博士，研究方向：食品中天然活性成分開發及工藝研究。

*通信作者：鐘瑞敏，男，教授，博士，研究方向：食品中天然產物及工藝研究。