改良LAMP快速檢測酸土脂環酸芽胞桿菌的研究

楊粵，張蘊哲，張先舟，馬曉燕，張偉

（河北農業大學食品科技學院，河北保定071000）

改良LAMP快速檢測酸土脂環酸芽胞桿菌的研究

楊粵，張蘊哲，張先舟，馬曉燕，張偉*

（河北農業大學食品科技學院，河北保定071000）

建立改良環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）檢測酸土脂環酸芽胞桿菌的方法。以酸土脂環酸芽胞桿菌的16S rRNA基因保守區域設計4條特異性引物，優化反應體系，通過熒光曲線、瓊脂糖凝膠電泳和白色沉淀判定擴增結果。同時，對LAMP引物特異性、靈敏度、檢出限進行研究。LAMP法在61℃，60 min內完成酸土脂環酸芽胞桿菌的檢測。2株酸土脂環酸芽胞桿菌呈陽性結果，17株非酸土脂環酸芽胞桿菌呈陰性結果，表明該種檢測方法具有高特異性。檢測純菌靈敏度為7.2 CFU/mL，對人工污染蘋果汁樣品中酸土脂環酸芽胞桿菌的檢出限是18 CFU/mL。LAMP法檢測酸土脂環酸芽胞桿有操作簡單、靈敏度高、特異性強等優點，應用前景廣闊。

環介導等溫擴增；酸土脂環酸芽胞桿菌；16S rRNA；檢測

酸土脂環酸芽胞桿菌（Alicyclobacillus acidoterrestris，A.acidoterrestris）是引起果汁腐敗的主要菌種，是一種嗜酸耐熱、好氧型的革蘭氏陽性菌，其生存能力強，能經受酸性條件下的巴氏殺菌過程而存活[1]。A. acidoterrestris在生長代謝時能產生愈創木酚、2-6-二氯苯酚和2-6-二溴苯酚等物質，影響果汁口感。嚴重的會在包裝物底部出現霧狀渾濁或白色沉淀，破壞果汁質量和營養價值[2]。A.acidoterrestris在低濃度時很難檢出，因此一般在果汁產品流通后才會被發現[3]。在國際貿易中，果汁產品經常會因A.acidoterrestris的污染而被大量的退貨，索賠的事件時有發生，這不但損害了國家的形象，而且給濃縮果汁產業帶來了巨大的經濟損失[4]。現在研究人員對A.acidoterrestris的研究主要集中在是利用防腐劑[1]，天然抗菌劑[5]，物理處理[6]等方法，在加工的過程中控制A.acidoterrestris在果汁中的生長，但是這些方法并不能保證果汁中不存在A.acidoterrestris。因此，建立一種高效、快速的檢測A.acidoterrestris的方法對于我國濃縮果汁產業的健康可持續發展具有重要的意義[7]。

傳統的微生物培養法是目前A.acidoterrestris在果汁行業公認的檢測方法[8]，該種檢測方法程序復雜，勞動密集，至少需要3 d～5 d[9]。快速檢測A.acidoterrestris的方法有儀器檢測和分子檢測。其中，儀器檢測包括傅里葉紅外光譜[10]、高效液相色譜指紋圖譜法[11]和電子鼻技術[12]，儀器檢測實現了檢測的快速準確，但是需要專業的操作人，且樣品前處理復雜。分子檢測包括酶聯免疫吸附技術（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）[13]、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）[14]。ELISA檢測靈敏度低且容易出現交叉反應。PCR技術需要精密的溫度循環裝置，操作僅限于實驗室。

環介導等溫擴增技術（loop－mediated isothermal amplification，LAMP）是2000年由日本生物學家Notomi T等[15]發明的一種新型的體外等溫擴增特異核酸片段技術。該種檢測方法是針對靶基因的6個區域設計4條特異的引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在恒溫條件（65℃左右）保溫幾十分鐘，即可完成核酸的高效擴增。整個擴增反應在30 min～60 min內可以擴增出109～1010[16]倍靶序列拷貝。本試驗是在普通LAMP的基礎上，針對A.acidoterrestris的16S rRNA基因保守區域設計引物，在反應體系中添加了結合雙鏈DNA的熒光染料SYBR GreenⅠ，利用實時熒光監測儀對反應進行實時監測，建立了A.acidoterrestris快速的檢測方法，為檢測A. acidoterrestris提供了一種更加新型、便捷的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株

本試驗共用菌19株，試驗菌株見表1。

表1 實驗菌株Table 1 Strains in this study

1.1.2 主要儀器與試劑

實時熒光監測儀（ESE Quant Tube Scanner）：德國Stockach公司；PCR擴增儀（Whatman T Gradient基因擴增儀）：德國Biometra公司。

Bst DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）、限制性內切酶、基因組DNA提取試劑盒：均購自于上海生工生物工程有限公司；SYBR GreenⅠ：購自北京天恩澤基因科技有限公司；Taq DNA polymerase、MgSO4、dNTPs：均購自北京全式金有限公司；LAMP和PCR引物合成：北京華大基因；所有的培養基均購自北京陸橋技術有限責任公司。

1.1.3 培養基與果汁樣品

K氏培養基（酵母粉2.5 g、蛋白胨5.0 g、瓊脂粉15.0 g、葡萄糖1.0 g、吐溫80 1.0 mL，溶于1 L無菌蒸餾水中，用蘋果酸調節pH（3.7+0.1），115℃滅菌30 min）；濃縮蘋果汁購自保定大型超市并經PCR檢測為A.acidoterrestris陰性。

1.2 方法

1.2.1 酸土脂環酸芽胞桿菌的培養與基因組DNA的提取

取保藏的A.acidoterrestris（CICC10374）在K氏瓊脂培養基上進行劃線，44°C培養24 h，傳代培養2次。挑取傳代培養的單菌落接種至新鮮無菌的K氏液體培養基中，44°C，200 r/min搖床培養12 h。

采用試劑盒法提取 A.acidoterrestris的基因組DNA，按照說明書操作。

1.2.2 引物設計

引物是LAMP反應成功的關鍵[17]，本試驗根據Genebank中A.acidoterrestris 16S rRNA基因組已知序列（基因號：KC193183.1），利用在線軟件（http：//primerexplorer.jp/e/）設計了4條特異性引物，即F3、B3、FIP和BIP。

F3 GCTTGACATCCCTCTGACC B3 CGCCTTCCTCCGACTTAC

FIPCGACAACCAT GCACCACCT-GGTGCAGAGATGTACCTTC

BIP AGCTCGTGTCGTGAGATGTTG-AGTCCCCACCTCTACGTG

1.2.3 酸土脂環酸芽胞桿菌實時熒光LAMP反應體系的優化

建立A.acidoterrestris實時熒光LAMP檢測25 μL反應體系，分別對反應體系中的溫度、引物濃度、Bst DNA polymerase添加量、dNTPs添加量進行優化。反應溫度分別設置為：59、60、61、62、63℃；內外引物比分別設置為2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1；Bst DNA polymerase添加量分別設置為 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 μL；dNTPs添加量分別設置為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μL。確定最適反應體系和反應條件。

1.2.4 擴增產物的分析

實時熒光LAMP可以通過三種方法分析擴增產物：（1）利用實時熒光監測儀，根據擴增曲線判定反應結果；（2）瓊脂糖凝膠電泳；（3）觀察反應管底部白色沉淀。

1.2.5 特異性分析

本試驗對2株A.acidoterrestris和17株非A.acidoterrestris進行檢測。分別取表1中19株細菌過夜培養的菌懸液1 mL，用試劑盒法提取各個菌株基因組DNA作為模板，根據1.2.4建立的反應體系和反應條件進行檢測，對LAMP引物進行特異性分析。

1.2.6 靈敏度試驗

將A.acidoterrestris的標準菌經K氏液體培養基培養12 h后，利用平板菌落計數法，測得原菌液濃度為7.2×106CFU/mL。用無菌生理鹽水進行10倍系列稀釋，并分別取各個稀釋倍數菌懸液1 mL，使用試劑盒法提取A.acidoterrestris基因組DNA，進行LAMP和PCR靈敏性試驗。

1.2.7 人工污染蘋果汁樣品檢出限分析

人工污染果汁前，經PCR法鑒定果汁中不含A. acidoterrestris。挑取K氏培養基上44°C培養12 h的A.acidoterrestris單菌落，制成一定濃度的菌懸液。選取菌懸液1 mL添加到蘋果汁中（25 mL蘋果汁樣品已溶于225 mL無菌生理鹽水中）。利用平板菌落計數法，測得人工污染蘋果汁樣品混合液中A.acidoterrestris的活菌數為1.8×105CFU/mL，用無菌生理鹽水進行10倍系列稀釋。分別取各個稀釋倍數污染樣品均質液1 mL，使用試劑盒法提取A.acidoterrestris基因組DNA，進行LAMP檢測，確定檢出限。

2 結果與分析

2.1 LAMP反應體系和反應條件的建立。

按1.2.4所述對LAMP反應體系和反應條件的優化。溫度優化結果如圖1所示，當反應溫度為61°C時，出峰最早；引物比優化結果如圖2所示，當內外引物比為4∶1時，出峰最早；Bst DNA聚合酶優化結果如圖3所示，當添加量為1.0 μL時，出峰最早；dNTPs優化結果如圖4所示，當dNTPs添加量為2.5 μL時，出峰最早。經過對反應體系和反應條件的優化，確定最適反應體系為：10 μmol/L FIP和BIP各1.6 μL，10 μmol/L F3和B3各0.4 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，8 000 U/mL的Bst DNA聚合酶1.0 μL，50 mmol/L Mg－SO4 2.5 μL，10×Bst DNA聚合酶緩沖液2.5 μL，DNA模板1 μL，SYBR GreenⅠ（400×稀釋）0.5 μL，用滅菌雙蒸水補足25 μL反應體系。最佳反應溫度61℃，反應時間為90 min（根據擴增情況，反應可隨時終止）。

擴增產物的判定可以通過實時熒光監測儀、瓊脂糖凝膠電泳和觀察反應管底部白色沉淀。首先利用實時熒光監測儀可以隨時觀看擴增結果，陰性無起峰現象，陽性會有明顯的擴增曲線（如圖5 A）。其次通過瓊脂糖凝膠電泳觀看擴增結果，陽性會有梯形條帶（如圖5 B）。最后可以通過觀察反應管底部白色沉淀，判斷擴增結果，陽性結果反應管會變渾濁或有少量白色沉淀產生（如圖5 C）。3種判定結果一樣，證明反應管1未發生擴增，反應管2發生了擴增反應。

圖1 反應溫度優化Fig.1 Optimization of temperature

圖2 引物優化Fig.2 Optimization of primer

圖3 Bst DNA聚合酶優化Fig.3 Optimization of Bst DNA polymerase

圖4 dNTPs優化Fig.4 Optimization of dNTPs

2.2 LAMP產物的酶切分析結果

通過理論推導可知，對LAMP擴增產物進行酶切，產生的片段大小應為270 bp和180 bp。本實驗中，選用限制性內切酶NaeI對擴增產物進行酶切得到的片段大小與理論值相符（如圖6）。

2.2 LAMP引物特異性分析

圖5 LAMP擴增結果Fig.5 The results of amplification by LAMP

圖6 LAMP產物酶切結果分析Fig.6 Enzyme digestion analysis of LAMP

采用2.1建立的反應體系，對2株A.acidoterrestris以及17株非A.acidoterrestris進行檢測，結果如圖7所示。通過實時熒光曲線可知僅有2株A.acidoterrestris有明顯的擴增曲線，即發生特異性擴增，其他菌株均無明顯的擴增曲線（如圖7A～7C）。通過瓊脂糖凝膠電泳可知，僅2株A.acidoterrestris出現梯形條帶，其他菌株均沒有出現梯形條帶（如圖7D）。通過觀察沉淀可知，僅2株A.acidoterrestris有白色沉淀產生，其他菌株無白色沉淀（如圖7E）。3種檢測方法得到結果相同，證明本實驗中的LAMP引物具有特異性。

2.3 酸土脂環酸芽胞桿菌LAMP檢測的靈敏性試驗

酸土脂環酸芽胞桿菌LAMP檢測的靈敏性試驗見圖8。

如圖8所示，A.acidoterrestris（CICC10374）濃度為7.2×106CFU/mL～7.2×100 CFU/mL時，反應呈現典型的擴增曲線（圖8 A），瓊脂糖凝膠電泳有梯形條帶產生（圖8 B），反應管底部有白色沉淀產生（圖8 C）。當A.acidoterrestris的濃度為7.2×10－1CFU/mL時，反應無典型的擴增曲線（圖8 A），瓊脂糖凝膠電泳無梯形條帶產生（圖8 B），反應管底部無白色沉淀產生（圖8 C）。同時采用PCR法對A.acidoterrestris的靈敏度進行檢測，結果如圖8D所示。當A.acidoterrestris（CICC10374）濃度為7.2×106CFU/mL～7.2×102CFU/mL時，有擴增條帶，當A.acidoterrestris（CICC10374）濃度為7.2×101CFU/mL～7.2×10－1CFU/mL時，無擴增條帶。因此，LAMP法檢測A.acidoterrestris的靈敏度為7.2× 100 CFU/mL，是PCR檢測法的100倍。

圖7 LAMP引物特異性檢測結果Fig.7 The specificity of the LAMP primer

圖8 酸土脂環酸芽胞桿菌靈敏性試驗Fig.8 The sensitivity of A.acidoterrestris

2.4 人工污染檢出限的確定

當人工污染果汁樣品中A.acidoterrestris濃度為1.8×105CFU/mL～18 CFU/mL時，反應呈現出典型的擴增曲線（圖9 A），瓊脂糖凝膠電泳有梯形條帶產生（圖9 B），反應管底部有白色沉淀（圖9 C）。當A.acidoterrestris濃度為1.8×100 CFU/mL時，反應無擴增曲線（圖9 A），瓊脂糖凝膠電泳無梯形條帶產生（圖9 B），試管無白色沉淀（圖9 C）。結果表明，LAMP法檢測人工污染蘋果汁中A.acidoterrestris污染果汁的檢出限為1.8×101CFU/mL。

3 結論

圖9 蘋果汁酸土脂環酸芽胞桿菌的檢出限分析Fig.9 Detection limit of LAMP for A.acidoterrestris in apple juice

酸土脂環酸芽胞桿菌被稱為嗜酸嗜熱細菌，可以經受巴氏殺菌而在果汁中存活，給果汁行業帶來一系列問題[18]。因此，建立一種快速檢測A.acidoterrestris方法勢在必行。李建科等[13]建立的酶聯免疫吸附技術檢測蘋果汁中A.acidoterrestris檢出限為105CFU/mL。2014年王周立等[14]基于PCR法建立了快速檢測A. acidoterrestris的研究，確定在檢出限低于10 CFU/mL。陳靜等[19]采用普通的LAMP技術，實現了檢測靈敏度為4.5×101CFU/mL。本實驗建立的改良LAMP檢測A. acidoterrestris與上述幾種快速檢測方法具有明顯的優勢。首先在普通LAMP反應基礎上添加熒光染料SYBR GreenⅠ，使得檢測的靈敏度明顯提高；其次該種檢測方法對擴增產物的判定可以通過熒光曲線，瓊脂糖凝膠電泳和裸眼觀察擴增反應副產物-白色焦磷酸鎂沉淀，鑒定結果簡單，可依據各個檢測機構的條件而選擇不同的判定方法。另外，LAMP引物的設計是針對靶基因DNA上6個特定的區域而設計的4條引物，保證了擴增的特異性。但是，在操作時需要注意防污染，避免出現假陽性結果。

從研究結果可知，基于LAMP技術改良的檢測方法靈敏度為7.2×100CFU/mL，是普通PCR檢測的10倍。對人工污染蘋果的檢出限為1.8×101CFU/mL，實現了快速高效的檢測。因此，改良的LAMP法檢測酸土脂環酸芽胞桿菌操作簡便、耗時少、特異性強、靈敏度高的優勢，適合在食品部門得到推廣和應用。

[1] Cai R,Yuan Y,Wang Z,et al.Effects of preservatives on Alicyclobacillus acidoterrestris,growth and guaiacol production[J].International Journal of Food Microbiology,2015,214:145-150

[2] Molva C,Baysal A H.The effect of sporulation medium on Alicyclobacillus acidoterrestris guaiacol production in apple juice[J]. LWT-Food Science and Technology,2016,69:454-457

[3] Chang S S,Kang D H.Alicyclobacillus spp.in the Fruit Juice Industry:History,Characteristics,and Current Isolation/Detection Procedures[J].Critical Reviews in Microbiology,2004,30(2):55

[4] Zhang J,Yue T,Yuan Y.Alicyclobacillus contamination in the production lineofkiwi productsin China[J].PlosOne,2013,8(7):e67704

[5] Huertas J P,Esteban M D,Antolinos V,et al.Combined effect of natural antimicrobials and thermal treatments on Alicyclobacillus acidoterrestris,spores[J].Food Control,2014,35(1):73-78

[6] Alberice J V,Funeshuacca M E,Guterres S B,et al.Inactivation of Alicyclobacillus acidoterrestris in orange juice by saponin extracts combined with heat-treatment.[J].International Journal of Food Microbiology,2012,159(2):130

[7] Steyn C E,Cameron M,Witthuhn R C.Occurrence of Alicyclobacillus in the fruit processing environment——a review.[J].International Journal of Food Microbiology,2011,147(1):1-11

[8] Henczka M,Djas M,Filipek K.Optimisation of a direct plating method for the detection and enumeration of Alicyclobacillus acidoterrestris spores.[J].Journal of Microbiological Methods,2013,92 (1):1-8

[9] Wang Z,Yue T,Yuan Y,et al.Development of Polyclonal Antibody-Based Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for the Detection of Alicyclobacillus,Strains in Apple Juice[J].Journal of Food Science,2012,77(11):643-9

[10]Lin M,Al-Holy M,Chang S S,et al.Rapid discrimination of Alicyclobacillus strains in apple juice by Fourier transform infrared spectroscopy[J].International Journal of Food Microbiology,2006,105 (3):369-376

[11]Rui A F U Y C.Application of lipase and esterase fingerprinting in the rapid identification of thermo-acidophilic bacteria[J].Journal of Northwest A&F University,2012,40(3):163-168

[12]Hartyáni P,Dalmadi I,Knorr D.Electronic nose investigation of Alicyclobacillus acidoterrestris,inoculated apple and orange juice treated by high hydrostatic pressure[J].Food Control,2013,32(1): 262-269

[13]Li J,Xia K,Yu C.Detection of Alicyclobacillus acidoterrestris,inapple juice concentrate by enzyme-linked immunosorbent assay[J]. Food Control,2013,30(1):251-254

[14]Wang Z,Cai R,Yuan Y,et al.An immunomagnetic separation-realtime PCR system for the detection of Alicyclobacillus acidoterrestris in fruit products.[J].International Journal of Food Microbiology, 2014,175(2):30-35

[15]Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Research,2000,28(12): E63

[16]Ye J,Coulouris G,Zaretskaya I,et al.Primer-BLAST:a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.[J].BMC Bioinformatics,2012,13(1):134

[17]Niessen L,Luo J,Denschlag C,et al.The application of loop-mediated isothermal amplification (LAMP)in food testing for bacterial pathogens and fungal contaminants.[J].Food Microbiology,2013,36 (2):191-206

[18]Piskernik S,Klancˇnik A,Dem?ar L,et al.Control of Alicyclobacillus,spp.vegetative cells and spores in apple juice with rosemary extracts[J].Food Control,2016,60:205-214

[19]Chen J,Ma X,Yuan Y,et al.Sensitive and rapid detection of Alicyclobacillus acidoterrestris using loop-mediated isothermal amplification.[J].Journal of the Science of Food&Agriculture,2011,91(6): 1070-1074

Development of Loop-mediated Isothermal Amplification Method for Rapid Detection of Alicyclobacillus acidoterrestris

YANG Yue，ZHANG Yun-zhe，ZHANG Xian-zhou，MA Xiao-yan，ZHANG Wei*
（College of Food Science and Technology，Agricultural University of Hebei，Baoding 071000，Hebei，China）

Development of loop-mediated isothermal amplification method was established to detect for Alicyclobacillus acidoterrestris（A.acidoterrestris）．Taking A.acidoterrestris 16S rRNA gene specific sequence as the target sequence，the primer sequence was designed.The reaction conditions were optimized and results observed by fluorescence curve，agarose gel electrophoresis and turbidity.The specificity，sensitivity and detection limit were detected by this method.The detection could be complished at 61°C within 60 min by LAMP.The specificity of the assay was confirmed using 2 A.acidoterrestris strains and 17 non-A.acidoterrestris strains.The detection sensitivity and detection limit were 7.2 CFU/mL，18 CFU/mL，respectively.The advantages of simple operation，high specificity and sensitivity of LAMP maked it to apply in future.

loop-mediated isothermal amplification（LAMP）；Alicyclobacillus acidoterrestris；16S rRNA；detection

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.038

2016-08-25

楊粵（1991—），女（漢），在讀研究生，研究方向：有害微生物檢測與控制。