春城里的再生夢

劉玉杰

李天晴，昆明理工大學靈長類轉化醫學研究院教授，云南中科靈長類生物醫學重點實驗室研究員，課題組長。長期從事干細胞與再生醫學方面的研究和應用，科研工作成績突出。回國4年就做出了多項原創性工作，特別是在靈長類干細胞的多能性方面取得了國際一流的成績：首次在世界上分離到Naive（原始態）靈長類胚胎干細胞，并證明這些靈長類干細胞可以產生嵌合體動物。該技術的突破在干細胞研究領域具有里程碑的意義。另外，在靈長類干細胞的規模化培養、定向分化以及應用方面也取得了重要的進展，建立了利用靈長類動物開展干細胞治療人類重大疾病的臨床前研究的技術平臺。目前作為課題負責人主持了國家重點基礎研究發展計劃項目、國家科技支撐項目、自然科學基金、云南省發改委等基金7項。研究成果以第一作者和通訊作者分別發表在Cell Stem Cell，Cell Research，Biomaterials，Stem Cells Reports，StemCells，Scientific Reports等國際一流或著名雜志。獲云南省科學技術獎二等獎1項，授權專利1項，申請2項。

1990年，諾貝爾生理學或醫學獎授予給了美國醫生J.E默里和E.D托馬斯，因為他們在醫學史上的重大貢獻——發明一種治療疾病的新方法，即細胞和器官移植。

毋庸置疑，器官和細胞移植是2。世紀生物醫學工程領域中具有劃時代意義的技術。它是人類改變傳統藥物治療方式，使衰竭器官恢復功能的一種新醫療模式，為醫學領域帶來了革命性變化。2013年，世界衛生組織調研顯示，全球一年實施了近12萬例器官移植手術。盡管無數病患因此獲得了新生，但令人憂心的是，這一數據仍只能滿足不到10%移植等待者的需求。并且，對于器官移植和捐獻領域起步較晚的我國而言，器官需求數量與供給數量的比例更加觸目驚心。

不過，科學家正在探尋新的方法，有可能在不久的將來，這一現狀就將得到革命性的變化。

除了公民自愿捐贈器官外，需要器官移植的病患或許又多了一種新選擇——選取自身的一點皮膚細胞，通過干細胞再造器官技術挽救自己的生命。為了這一夢想，昆明理工大學靈長類轉化醫學研究院教授李天晴，多年來不斷開拓創新、勇攀高峰，帶領團隊開展的靈長類多功能干細胞全能性研究取得了重大進展，為無數重病患者帶來了生的希望。

夢之源起——瞄準多功能干細胞研究

干細胞即為起源細胞，是一類具有增殖和分化潛能的細胞，具有自我更新復制的能力，在一定條件下能夠產生高度分化的功能細胞，醫學界稱之為“萬用細胞”。人類對干細胞的研究被認為開始于20世紀60年代。在幾個近親種系的小鼠睪丸畸胎瘤的研究中，表明其來源于胚胎生殖細胞。此工作確立了胚胎癌細胞是一種干細胞。

1998年，美國威斯康星大學教授詹姆斯，湯姆森利用人的胚胎建立了世界第一株人類胚胎干細胞系。而正是由于人胚胎干細胞系的建立才產生了再生醫學的概念，使干細胞研究顯示其巨大的應用價值，受到人們的廣泛關注。

21世紀初，當新千年的鐘聲敲響，還在中國科學院昆明動物研究所讀博士的李天晴，開始跟隨導師展開了靈長類干細胞的研究之旅。在意識到干細胞研究領域的無限發展前景后，2005年，博士畢業的李天晴就順理成章地留在了所里當了助理研究員。然而，隨著研究的日益深入，他也漸漸感覺到知識和研究手段的缺乏。為此，在2006年10月，李天晴毅然前往美國進行干細胞的博士后研究。并于2017年年底歸國，投入了干細胞與再生醫學的海洋。

一直以來，將人類胚胎干細胞投入醫學應用的障礙之一，正是在于它們極其具有前景的一個特征——天生能夠快速分化為各種類型的細胞。直到現在，科學家們仍然無法回答的一個重大科學問題是：靈長類（包括人）干細胞是否具有原始態的特性，即能嵌合到早期胚胎并產生嵌合體。這已經成為制約干細胞臨床應用的關鍵性科學問題之一。

然而，人多能干細胞（PSCs）與大、小鼠相比，表現出不同的特性以及調控機制。實驗表明，小鼠的胚胎干細胞容易在體外保持它們的原始態、未觸發狀態，而人類胚胎干細胞則很難在體外保持這種狀態。根據發育階段、克隆形態、信號依賴、線粒體代謝、嵌合能力、基因表達以及表觀遺傳等差異，哺乳動物干細胞多能性被分為原始態（Naive）和始發態（Primed）兩種狀態。Naive多能干細胞具有更好的體內分化發育能力，相似于囊胚前的早期胚胎卵裂球。當其注射到早期胚胎后，能夠參與胚胎的發育和分化，產生嵌合體動物，再生功能的組織器官，而Primed多能干細胞這樣的功能相當有限。

同大小鼠相比，人的胚胎干細胞研究存在的最大問題就是沒有一個統一的標準來衡量干細胞的多能性。傳統的體外分化和畸胎瘤等方法，只能對干細胞的分化能力進行定性分析，不能回答所有與人類多能性相關的問題，諸如人類多能性細胞是否具有正常的體內發育能力、這些已分化的細胞被移植后是否仍保持原來的細胞命運、這些細胞是不是會無控地增殖和遷移等。

由于缺乏統一的評價標準，導致不同實驗室建立的人ESC（胚胎干細胞）、iPSC（誘導多功能干細胞）差異很大，在基因表達以及分化傾向性方面存在較大差異，阻礙了干細胞的臨床應用。而由于小鼠ESCs具有Naive（原始態）特性，因此不同ESCs系之間的基因與分化能力差異較少，預示了獲得NaivePSCs是干細胞實現臨床轉化的關鍵條件之一。

然而，目前僅小鼠和大鼠上具有這種Naive PSCs。如何建立人的NaivePSCs以及干細胞的鑒定標準，仍是干細胞基礎研究和臨床應用需要解決的一個重大科學問題。這也是李天晴一直以來奮斗的目標。

由于倫理和條件的限制，無法直接在人類干細胞檢測其多能性。獼猴或食蟹猴作為與人類親緣關系很近的非人靈長類，在解剖、生理、遺傳，特別是在神經系統結構與功能上如認知、情緒、和社會行為等方面，表現出與人類的高度相似性。因此，猴被認為是多種人類神經系統類疾病唯一或最合適的實驗動物模型。更為重要的是，獼猴或食蟹猴與人類的PSCs極為類似，而與嚙齒類動物的PSCs差異巨大。利用靈長類疾病動物模型，建立干細胞治療疾病的技術標準和規范，促進干細胞在體內的安全性和有效性，將實現干細胞的臨床轉化。

同時，作為人類起源與發展的關鍵和核心地區之一，素有“動物王國”“植物王國”和“有色金屬王國”之美譽的云南，擁有豐富的靈長類資源。1965年，距今約170萬年的元謀人被發現于云南元謀縣上那蚌村西北小山崗上。這是迄今為止發現的亞洲最早人類。

2014年，在多年的靈長類研究基礎上，昆明理工大學靈長類轉化醫學研究院成立。成立之初，便以建成國際一流的靈長類轉化醫學研究院為目標，通過產學研結合，促進以非人靈長類動物作為技術平臺的生物醫學技術研究及其產業化應用。通過多學科交流與融合，結合中心自身的優勢條件，目前，研究院已開辟了干細胞與再生醫學等多個不同的研究發展方向，擁有干細胞培養、分離、分化以及鑒定等所需的各種大型儀器和實驗條件。其依托下的云南中科靈長類生物醫學重點實驗室，下設靈長類生殖與發育生物學實驗室、靈長類干細胞與再生醫學實驗室、靈長類神經生物學實驗室、病理實驗室、靈長類動物實驗和質量控制實驗室以及中心實驗室等，擁有豐富的靈長類資源的得天獨厚的地域和技術儲備優勢，依托靈長類等實驗動物養殖和動物實驗研究體系，開展靈長類生物醫學和人類重大疾病的靈長類動物模型相關的基礎和應用基礎研究。

正是得益于云南省豐富的靈長類資源及世界一流的人類重大疾病靈長類動物模型研究技術和平臺，從2002年起，李天晴就在靈長類干細胞的科研之路上不斷攀登，并取得了多項重大突破：首先在國際上建立了猴子胚胎干細胞的同源飼養層培養以及獼猴胚胎干細胞定向分化為功能神經干細胞的體系；同時，通過長期的探索研究，他們還創造了干細胞領域里程碑式的成果——首次在世界上分離了原始態的靈長類干細胞，并證明這些細胞能夠產生嵌合體猴。這是第一次在世界上證明，高等動物的干細胞可以產生嵌合體動物。夢之基石一一“嵌合體猴”的誕生

在古希臘神話中，有一只脾氣十分暴虐的怪獸奇美拉（Chimera）。它長著獅子的頭，蛇的尾巴，背上還有一個會噴火的羊腦袋……這便是世界上最早出現的嵌合體動物。

簡單來講，所謂嵌合體就是指由不同基因型的細胞所構成的生物體。而嵌合體動物，就是將一個動物的胚胎干細胞注射到另一個動物的囊胚當中，隨后通過輔助生殖技術而獲得的產物。1907年，德國植物學家和遺傳學家㈠溫克勒把嵌合體比喻為希臘神話中獅首、羊身、蛇尾的奇美拉神獸，這也是嵌合體外文名Chimera的由來。

隨著技術的發展，目前，科研人員已經通過胚胎干細胞嵌合成功的嵌合體動物只有小鼠和大鼠。嵌合體的形成是評價干細胞Naive特性的金標準。然而，靈長類多能干細胞是否能夠產生靈長類嵌合體，一直是個世界性難題。2012年，美國Oregon國家靈長類中心的Shoukhrat等人在Cell雜志上發表文章表明，培養的猴PSCs不具有嵌合體產生的能力。

那么，靈長類多能干細胞究竟能否產生嵌合體動物呢？

盡管一次次試驗、一次次失敗，李天晴團隊依舊堅持不懈。面對外界不斷傳出的否定理論，他和研究隊伍不為所動，一心沉浸在自己的實驗世界中。最后通過改良的培養條件，他們改變了食蟹猴胚胎干細胞（cESCs）的生長特性、基因表達譜和維持自我更新的信號通路，將cESCs轉化為Naive-like cESCs（由于不清楚這些細胞能否在四倍體補償的條件下產生干細胞猴，因此李天晴團隊把他們稱為Naive-like細胞）。當這些細胞注入桑椹胚后，形成嵌合體囊胚。之后，李天晴團隊又將15個嵌合體囊胚移植到5只母猴體內，有2只成功懷孕。3個多月后，為了檢測各種組織器官的嵌合情況，他們對兩只胎兒終止了懷孕過程，檢測到兩只胎兒成功實現了嵌合，而這兩只采用的是同一種干細胞處理技術。

隨后，研究人員檢測了3月齡猴子的心臟、腎臟、胰臟、大腦、脾臟、肺、肝臟、睪丸、皮膚等18個器官，都檢測到了經過標記后的干細胞。這樣，就證明了嵌合進去的干細胞整合到了胚胎中，參與了機體各種器官的發育并分化成各種組織細胞。

2015年7月2曰，李天晴團隊的這一成果成功發表在國際一流期刊Cell StemCell雜志上。論文一經發表后便引起了巨大關注。李天晴團隊的研究，首次在世界上證明了利用靈長類ESCs獲得嵌合體猴是可行的，同時也證明了靈長類動物胚胎干細胞的全能型，具有重大的科學和應用價值：1、為建立靈長類（包括人）PSCs的鑒定標準提供了重要參考；2、實現對體內組織器官的再生，為最終體內再生功能器官用于病人器官移植提供重要的研究基礎；3、結合基因定向修飾技術，建立人類特定疾病的非人靈長類動物模型。

在器官移植領域，早在一百多年前，國內外一些科研人員就開始研究異種器官移植。1905年，法國進行了世界第一例異種器官移植手術，把兔腎臟植入腎功能衰竭兒童體內，手術很成功，但16天后由于排異反應，這名兒童死于肺部感染。

為了減少異種移植中的排異反應，科研人員嘗試敲除供體的某些基因，取得了一些研究進展，但還沒有完全突破。

而嵌合體猴的研究，則希望用另一種方式解決排異反應。將靈長類動物中的食蟹猴作為研究對象，利用它的胚胎干細胞成功獲得嵌合體猴。理論上，通過此胚胎干細胞生長出來的各項組織器官與原來的食蟹猴應當是一致的，將嵌合體猴的器官移植到原來的食蟹猴中，就很好地解決了異種移植帶來的排斥反應。

如果研究不斷獲得進展，在大量再生器官的安全性和功能性評價基礎上，未來還可以用病人自身的皮膚細胞，經過重新編程后成為全能干細胞，然后將全能干細胞注射到豬或其他動物的胚胎中去再生出病人自身的器官，最終為挽救病人的生命做出貢獻。

一分耕耘一分收獲。李天晴團隊堅持不懈的努力也為他們帶來了豐厚的回報。2016年2月，該研究成果被評為云南省2015年的十大科技成果；李天晴本人也因此被中國干細胞生物學分會授予“干細胞青年研究員獎”。同時，以色列威茲曼科學院的國際著名多能干細胞研究專家Jacob Hanna也對他們的工作進行了高度評價，認為具有里程碑意義。

夢之鍛造——在奮斗中前行

產生“嵌合體猴”究竟意味著什么？撇開這項技術在國際干細胞領域產生的極大影響，對于李天晴而言，“目前，這個工作僅僅是宏偉目標的一小步，意味著還有很多工作要做”。

作為新的醫學革命，以干細胞治療為核心的再生醫學，已成為繼藥物治療、手術治療后的另一種疾病治療途徑。然而，大多數類型的干細胞，缺乏對干細胞治療的安全性和有效性方面的科學評估。因此，利用與人高度相似靈長類疾病動物模型，建立干細胞治療神經疾病的技術標準和規范，促進干細胞在體內的安全性和有效性，即促進干細胞臨床轉化，是李天晴的另外一個夢想。然而，干細胞臨床前研究需要解決以下幾個重大的問題：1）干細胞的規模化培養，滿足臨床的大量需求；2）將PSCs定向分化為高純度特定的、安全的功能細胞；3）促進功能細胞在體內的存活和功能的重建。

為了解答這些問題，李天晴團隊又展開了一系列研究計劃。

首先是實現了多能干細胞的可規模化培養。干細胞的規模化培養是干細胞領域的一個比較關鍵性的技術，傳統的采用二維的培養方法無法滿足臨床和藥物篩選的大量需求。為此，李天晴團隊設計了一套簡單的三維懸浮培養體系，通過細胞篩，將人和猴子的多能干細胞切割成大小均質的團塊，通過懸浮培養為均質的細胞球，并通過細胞篩切割進行連續傳代。采用這種簡單的方法，團隊實現了人和猴PSCs的長期傳代，并保持干細胞的多能性。5天內干細胞可以實現19倍的擴增，其增值速度是二維培養體系下的2-2.5倍，該培養體系不僅簡單，而且容易進行規模化培養，目前已經獲得國家專利的批準。

并且，在神經干細胞、特定神經細胞培養以及分化等方面，李天晴團隊也建立了一系列成熟的系統：建立了單個神經上皮干細胞的擴增系統和神經疾病與發育的研究系統，可以促進對神經管發育的理解，并進而開發為治療神經系統的細胞產品；首次證明人多能干細胞高效分化為功能的、可移植的人大腦皮層投射神經元，該體系為干細胞治療腦損傷以及為研究CfuPNs（皮層投射神經元）和中間神經元發育的典型細胞模型。

為了實現個性化醫療和精準治療，避免移植后的免疫排斥反應，傳統的方法是將病人的體細胞重編程為iPSCs細胞，然后再分化為特定的細胞，但由于iPSCs的低效率以及安全性問題，阻礙了其臨床轉化。為此，李天晴團隊開發了靈長類成纖維細胞直接轉分化為功能端腦神經上皮干細胞的體系，通過體系的改進將猴子成纖維體細胞直接轉化為iNESCs（神經上皮干細胞），為干細胞的個性化醫療和精準治療提供了重要的研究基礎。

同時，他們還建立了3D條件下可規模化誘導人和猴多能干細胞定向分化為心肌細胞。干細胞治療需要大量的細胞，如心肌梗死等需要大約1x109的細胞數量。同樣，采用二維的分化體系，很難獲得足夠的心肌細胞。為了解決這個問題，李天晴團隊設計了一個三維的培養體系。該體系是在三維培養多能干細胞的基礎上進行的，整個培養體系非常簡單、無生長因子，全部采用小分子物質進行。并且，由該體系培養出來的心肌球具有正常心肌細胞的超微結構、鈣波、成熟基因的表達譜和對藥物的反應，可以作為一個藥物的篩選平臺。進一步研究發現，三維條件下產生的心肌細胞比二維條件下產生的心肌細胞具有更好的成熟功能。而該系統則非常適合規模化生產心肌細胞用于疾病的研究、細胞的治療和藥物的篩選。目前為止，相關的培養體系以及培養基已經申請國際專利，獲得了PCT授權，并進入了美國和中國的專利申請階段。

而在細胞治療和神經細胞再生方面，李天晴團隊也取得了多項突破，發現了成年動物的視網膜里存在干細胞，這些干細胞通過體外純化后，在體外能無限擴增，并分化為七種不同的視網膜細胞。在合適的分化條件下，視網膜干細胞能夠分化為高純度的感光細胞，移植到rdl突變的視網膜色素炎和rd7突變的夜盲癥的疾病動物的視網膜后能夠整合到視網膜，分化為視網膜感光細胞，并與體內的雙極細胞建立功能鏈接，恢復對光的感應能力，具有重大的臨床轉化價值。

此外，神經干細胞在小鼠腦內能夠很好整合，但在靈長類動物腦內的整合仍然是一個難題。通過長期的攻關探索，李天晴團隊成功地建立了神經上皮干細胞（NESCs），為了探索移植治療，將NESCs在移植前分別進行了幾種不同方法的分化，并分別將這些分化的細胞移植到成年獼猴的大腦皮層以及紋狀體部位。結果表明，不同分化條件下的細胞都能整合到大腦中，并分化為成熟神經元。但它們之間的整合能力存在顯著性差異。研究還發現，細胞的整合能力與細胞移植的位置具有重要的關系，如相比大腦皮層，NESCs更容易整合到紋狀體：而皮層的白質區域不利于細胞的存活。這些平臺和工作的建立，不僅多是原創性的工作，更為重要的是，這些NESCs移植到猴子的腦部后，能夠整合、遷移并分化為神經元和星型膠質細胞，并表達特異的神經遞質，為下一步干細胞治療奠定了重要的基礎。

夢之起航——從胰腺移植開始

2016年4月，世界衛生組織發布報告稱，全球糖尿病患者人數已經從1980年的1.08億增加到2014年的4.22億，而且世界上有8.5%的成年人均患有糖尿病。同時，由于我國人口基數大，人口老齡化加劇以及飲食結構等因素，導致我國糖尿病患者人數約1.1億人，位居世界第一。

糖尿病是由于胰腺細胞的胰島素分泌缺陷或其生物作用受損，或兩者兼有引起。近年來，隨著患病人數的激增，需要通過胰腺移植治療糖尿病及其并發術的病人也與日俱增。目前，在各種器官移植中，胰腺移植已經成為僅次于腎、肝臟與心臟以外，占第4位的器官移植。然而，目前我國每年約有15。萬人因末期器官功能衰竭需要進行器官移植，但最終只有1萬人完成了器官移植手術。如果采用傳統的器官捐獻方法，根本無法獲得足夠的胰腺器官數量。

為此，李天晴團隊以前期工作為基礎，目前又開展了“利用靈長類多能干細胞體內再生胰腺器官”項目研究，以期通過對干細胞體內再生胰島組織器官關鍵性技術的突破，建立靈長類動物的體內再生組織器官的技術平臺，為最終再生人類器官提供重要的研究基礎。

Pdx1基因是胰腺早期發育的一個關鍵基因，其缺失將導致胰腺發育的缺陷。2010年，日本東京大學丁Kobayashi等人將小鼠的多能干細胞注射到Pdxl基因（即缺失Pdx1基因）的小鼠胚胎，發現出生小鼠的胰腺來自注射的Naive多能干細胞，并且將大鼠Naive多能干細胞移植到Pdx1基因小鼠的早期胚胎，在小鼠體內能夠再生大鼠的胰腺，實現了多能干細胞在同種動物間以及異種動物間胰腺器官的體內再生。其后，日本學者Kato Seiji Usui等人采用該方法將小鼠Naive多能干細胞注射到Sall1的小鼠胚胎（腎臟發育缺陷的胚胎），發現多能干細胞再生了小鼠的腎臟，實現了多能干細胞體內再生腎臟器官。這些突破性的研究結果表明Naive多能干細胞具有再生體內組織器官的能力，而組織器官的再生關鍵在于是否存在具有良好嵌合能力的多能干細胞。

以往的研究表明，當靈長類干細胞被注射到猴子早期胚胎后，發現細胞并不能有效地嵌合到猴的胚胎中，產生嵌合體猴，因此不具有器官再生的能力。

好在，這些技術瓶頸問題在前期的研究基礎中已經被李天晴團隊有效克服了。

2015年，李天晴團隊在世界上首次分離的能夠產生嵌合體猴的Naive猴子多能干細胞，在嵌合到猴子胚胎里后能伴隨胚胎在體內的發育，分化為機體內的各種組織細胞。其中，胰腺在所有的組織器官中，表現了較高的嵌合率。重要的是，Naive干細胞在胰腺分化為外分泌腺細胞和胰島細胞，其中分化的胰島細胞包括β細胞、α細胞以及胰島前體細胞。該技術的突破，為體內構建靈長類的組織器官奠定了重要的技術基礎。

同時，李天晴團隊所在的云南中科靈長類生物醫學重點實驗室，還于2013年利用目前世界最新的基因組編輯技術CRISPR/Cas9和TALENs，實現了獼猴和食蟹猴兩個物種的靶向基因修飾，首次在世界上建立了基因敲除的猴模型。

因此，在“利用靈長類多能干細胞體內再生胰腺器官”項目中，李天晴團隊選擇了胰腺組織作為研究的突破口，結合目前已經建立的靈長類動物基因敲除猴技術，通過TALEN等技術，敲除受體猴的胰島器官發育的關鍵性基因PdX1，阻止胚胎細胞發育為胰腺器官，然后將具有嵌合能力的Naive猴多能干細胞注射到Pdx1基因的猴胚胎里面，利用干細胞在體內對胰腺發育的補償作用，實現胰腺組織器官體內的再生；在此基礎上，通過優化細胞的注射時間、注射的細胞數量以及注射后胚胎的體外培養等方式，研究影響胰腺器官再生的一些因素。

作為檢驗靈長類多能性干細胞的最佳模型，“利用靈長類多能干細胞體內再生胰腺器官”項目對獼猴和食蟹猴的研究結果將為篩選出能夠具有Naive的人多能性干細胞，提供重要的研究基礎，進而為人類器官的體內獲得提供可能。

“科學家的天職叫我們應當繼續奮斗，徹底揭露自然界的奧秘，掌握這些奧秘便能在將來造福人類。”對于科研的目的，居里夫人曾如是說道。而這也同樣是李天晴團隊的終極目標。