活性氧介導的植物蛋白質氧化修飾研究進展

周文菲 白娟 龔春梅

（西北農林科技大學生命科學學院，楊凌 712100）

活性氧介導的植物蛋白質氧化修飾研究進展

周文菲 白娟 龔春梅

（西北農林科技大學生命科學學院，楊凌 712100）

蛋白質翻譯后修飾是機體蛋白發(fā)揮各種功能的重要先行步驟。逆境脅迫下活性氧可對氧化還原敏感的蛋白質進行可逆和不可逆的氧化修飾?？赡嫜趸揎棇δ婢诚轮参锷锕δ艿恼０l(fā)揮乃至適應都至關重要，目前對活性氧調節(jié)植物蛋白質的可逆氧化修飾研究取得了相應進展。綜述了植物蛋白質氧化修飾的方式位點及參與蛋白的調節(jié)機理，旨在闡明蛋白質可逆氧化修飾對植物抵御逆境造成的氧化脅迫的重大意義，同時概括對蛋白質可逆氧化修飾研究的有效方法。當前可以通過特定位點的突變實驗和蛋白質組學的方法確定有無可逆氧化修飾并測定氧化修飾程度；未來以期通過綜合實驗控制參與反應的蛋白質來解析其還原及再生機理。

活性氧；蛋白質；翻譯后修飾；甲硫氨酸；半胱氨酸

蛋白質作為基因功能執(zhí)行者，有必要通過蛋白質的翻譯后修飾（post-translational modification，PTM）形成結構更復雜、功能更多樣的能夠更精準更專一發(fā)揮作用的蛋白質。PTM就是通過給一個或多個氨基酸殘基加上修飾基團對翻譯后的蛋白質進行共價加工的過程，改變蛋白質的理化性質，影響蛋白質的空間構象和活性狀態(tài)，亞細胞定位、折疊及其穩(wěn)定性以及蛋白質互作［1，2］。常見的PTM有磷酸化修飾、甲基化修飾和泛素化修飾等。蛋白質通過磷酸化與去磷酸化，調控信號轉導、基因表達和細胞周期等諸多生命過程，是生物體內最重要的共價修飾方式之一。人類超過50%的蛋白質發(fā)生過磷酸化修飾，有100 000個潛在的磷酸化位點［3］。組蛋白的甲基化修飾既可抑制也可增強基因表達，是重要的表觀遺傳學調控方式［4］。泛素化是細胞蛋白質在發(fā)揮降解功能中非常重要的翻譯后修飾，重要性亦堪比磷酸化。這類修飾在動物和人體的研究較多且進展較快。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是化學性質活潑、氧化能力很強的含氧代謝產物，在植物體內具有雙重功能，即可通過氧化生物大分子等方式損害植物正常的生命活動，也可發(fā)揮如信號傳遞等生理功能［5］。隨著對ROS作為信號分子研究的深入發(fā)現(xiàn)，其可在植物細胞內擴散，作為第二信使介導多種信號通路，與蛋白巰基狀態(tài)、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、多種抗氧化酶類和激素及轉錄因子等相關，對激素或者環(huán)境脅迫做出多種應答［5］。ROS對蛋白質的這種翻譯后修飾，可以通過氧化產生羰基化蛋白等不可逆氧化修飾破壞蛋白結構進而危害植物體的正常生命活動，也可以通過自身的調節(jié)機制來適應這種氧化脅迫，特別是通過蛋白質的可逆氧化修飾實現(xiàn)適應?？梢娭参镌诃h(huán)境適應性進化中通過ROS促進蛋白質氧化還原修飾，達到既有效降低氧化脅迫，又保護蛋白的目的。但是目前對植物蛋白質氧化修飾的研究還處于初始階段，有關具體修飾位點的研究也不多見。鑒于蛋白質的PTM，特別是可逆氧化修飾對逆境下植物生物功能的正常發(fā)揮乃至適應和存活都至關重要，ROS調節(jié)蛋白質的可逆氧化修飾研究越來越受到人們的重視，在機理和研究手段上都取得了一定進展。各種常見的ROS有H2O2、O2-和1O2、·OH等，它們的半衰期分別以毫秒、微秒、納秒來計量，且O2-、1O2和·OH的氧化活性強于H2O2［6］，所以H2O2相對更為穩(wěn)定；相較于另外3種ROS，H2O2可穿梭過膜，其作用范圍更廣。這些ROS都可對氨基酸進行氧化修飾，但鑒于H2O2的穩(wěn)定性和可跨膜性，目前植物蛋白質氧化修飾的研究主要集中在H2O2造成的氧化修飾上［7-10］。有人以野生型擬南芥為對照組，過氧化氫酶（catalase，CAT）突變型為脅迫處理組，利用蛋白質組對植物甲硫氨酸亞砜（met sulfoxide，Met-SO）的動態(tài)進行觀察進而分析甲硫氨酸（methionine，Met）的氧化程度［11］。本文根據(jù)近年來國內外主要相關研究進展，就ROS對植物蛋白質氧化修飾的方式位點以及可逆氧化修飾的調節(jié)機理及對植物抗逆的重要意義進行綜述，著重探討ROS對植物蛋白質可逆氧化修飾的機理、在植物信號轉導中的作用及研究方法。

1 植物蛋白質氧化修飾的方式和位點

1.1 ROS對植物蛋白質氧化修飾的信號調節(jié)機理

正常情況下植物細胞與胞外環(huán)境相比，細胞內環(huán)境主要靠GSH和硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）的半胱氨酸（cysteine，Cys）構成巰基氧化還原反應系統(tǒng)將其維持在強還原狀態(tài)［12］，不會受到氧化脅迫。而且植物也會利用酶促與非酶促的抗氧化系統(tǒng)［13］來清除一定量的ROS，但在干旱等脅迫條件下過量ROS的產生，使植物細胞處于氧化脅迫狀態(tài)，很多生物分子如糖類、不飽和脂類、蛋白質和核酸等都成為ROS攻擊的目標，引發(fā)膜脂過氧化、蛋白質氧化、核酸損傷和酶失活，甚至導致許多生物大分子尤其是蛋白質被氧化而失去功能，并激活程序性細胞死亡。相較于脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和脂類，蛋白質的氧化更普遍，占68%［14］，特別是含硫氨基酸如Met與Cys殘基最容易遭到破壞而導致蛋白質相關屬性變化和功能失常，可能都是因這兩種氨基酸殘基被氧化所致。

ROS和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）促進可逆的氧化還原PTM的發(fā)生，包括Cys、酪氨酸（tyrosine，Tyr）的亞硝基化，Cys、Met的氧化［15，16］。這種ROS對蛋白質進行的可逆氧化修飾，既保護了蛋白質不受損傷，在條件合適時繼續(xù)發(fā)揮生理功能；又起到抗氧化劑的作用，降低了ROS對機體的進一步損傷［17］。

1.2 ROS對蛋白質氧化修飾的方式和位點

蛋白質分子中起關鍵作用的氨基酸成分對ROS損害特別敏感，因而ROS以多種方式直接或間接地對蛋白質進行攻擊從而導致蛋白質修飾。直接修飾包括氨基酸殘基的氧化、含硫基團的氧化和二硫鍵形成以及谷胱甘肽化等；間接修飾主要是指蛋白與脂肪酸過氧化裂解產物結合形成羰基化蛋白。不同的ROS對特定氨基酸側鏈有特殊影響，以芳香氨基酸和含硫氨基酸最為突出。大多數(shù)蛋白質的氧化作用是不可逆的，經常與蛋白質功能的永久喪失相關，可以導致?lián)p害蛋白質的消除或積累；只有一些含硫氨基酸的蛋白質氧化是可逆的［5］，如Cys、Met的氧化，可以起到保護Cys避免發(fā)生不可逆氧化修飾和調節(jié)蛋白功能的雙重作用［18］。目前ROS對植物蛋白質氨基酸可逆氧化修飾的研究主要集中在Met和Cys上，本文參考相關文獻并梳理了ROS對Cys和Met的氧化修飾，如圖1［19］。除此之外，Cys的亞硝基化和谷胱甘肽化也是常見的氧化修飾方式。

圖1 ROS對甲硫氨酸和半胱氨酸的可逆氧化修飾

1.2.1 芳香族氨基酸的不可逆氧化修飾起著抗氧化和信號傳遞的作用 芳香族氨基酸是最容易被氧化損傷的氨基酸［20］，如Tyr很容易發(fā)生苯環(huán)間交聯(lián)形成二酪氨基酸或其酚環(huán)的3位上加1個硝基（-NO2）形成硝化氨基酸，而被作為蛋白質氧化損傷的指標［21］；ROS對色氨酸（tryptophan，Trp）殘基的氧化修飾是不可逆的非隨機過程［14］，近年來也有文獻說明Trp的氧化修飾是可逆的［16］，所以厘清其中的抗氧化機制非常重要。芳香族氨基酸（Trp和Tyr）被氧化后，疏水性發(fā)生改變，進而影響蛋白質的結構；Tyr磷酸化在信號轉導上起著重要的作用；在ROS參與下，Tyr很容易發(fā)生苯環(huán)間交聯(lián)而形成二酪氨基酸，可被作為蛋白質氧化損傷的指標［21］。芳香族氨基酸的氧化產物在酸水解環(huán)境中也很穩(wěn)定，通常作為蛋白質氧化的生物標志物，如Moller以Trp作為蛋白質標志物研究了蛋白質組的氧化［14］。Tyr氧化修飾可以作為脅迫條件下的生物標志，Aulak等［22］和Kanski等［23］采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/Ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）、十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和串聯(lián)液相色譜四級桿質譜聯(lián)用（liquid chromatography-liquid chromatography quadrupole，LCLCQ）等蛋白質組學技術對硝化Tyr進行了研究。Tyr的硝基化氧化修飾和Met殘基可逆氧化修飾一樣具有抗氧化劑的功能。

1.2.2 ROS對某些蛋白質的不可逆羰基化修飾 蛋白質的羰基化修飾主要包括特定位點氨基酸的修飾、肽鏈斷裂、交聯(lián)和聚合、電荷改變以及對蛋白水解作用的敏感度增加，從而使蛋白結構改變、功能失常和降解。羰基化的主要方式有：ROS介導的賴氨酸（lysine，Lys）、脯氨酸（proline，Pro）、精氨酸（arginine，Arg）和蘇氨酸（threonine，Thr）殘基的氧化［16］；脂質過氧化裂解產物（主要為活性醛類如4-羥基烯醛）與蛋白質氨基酸殘基（組氨酸（histidine，His）、Cys、Lys）的側鏈基團發(fā)生米歇爾加成（michaeI addition）和/或希夫堿（schiff base）反應［5］；Lys等的糖基化［24］。由于蛋白質羰基化不能被細胞中的酶系統(tǒng)修復，這些作用對蛋白質造成的損傷也是一個不可逆過程。環(huán)境脅迫下植物組織羰基化蛋白含量增多，已被廣泛用作檢測蛋白質氧化損傷的標志。

1.2.3 ROS對Met的可逆氧化修飾

1.2.3.1 ROS對Met可逆氧化修飾過程 Met是生物體必需氨基酸之一，無論游離態(tài)還是暴露在蛋白質表面的Met都極易被ROS氧化形成Met-SO、更強的氧化劑還可將Met-SO進一步氧化成甲硫氨酸砜（methionine sulfone，Met-SO2）導致氨基酸結構改變和蛋白質功能受損［25］。Met-SO可以被生物體內Met亞砜還原酶（methionine sulfoxide reductase，Msr）家族逆轉［26］，還原亞砜結構并恢復受損蛋白質的活性，以抵御逆境造成的各種氧化脅迫［27］，保證機體的正常運轉；然而Met-SO2不能被Msr系統(tǒng)還原，屬于不可逆的氧化修飾。

1.2.3.2 Msr在Met可逆氧化修飾中的作用 根據(jù)多篇文獻總結并繪制Msr在蛋白質可逆氧化修飾過程中的作用機制如圖2［17，25，28］。Msr參與被氧化破壞的蛋白質或多肽中Met的修復過程［26，28］，可以使氧化的Met-SO還原為Met，進而恢復蛋白質的天然構象與功能，為該還原過程提供還原力的主要為Trx［29］，其次是谷氧還蛋白（glutaredoxin，Grx）以及抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)（ascorbate-glutathione cycle，AsA-GSH cycle）系統(tǒng)中的GSH或還原型輔酶 Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）等［17］。Met-SO具有手性，以對映異構體（Met-S-SO與Met-R-SO）形式混合存在。Msr的催化過程需要Cys殘基的參與，當用絲氨酸（serine， Ser）取代其上的Cys時，Msr的活性完全被抑制，但是當Cys上的硫元素被硒元素取代時可以保持Msr的酶活性［30-32］。Msr有MsrA和MsrB兩種類型，它們催化不同異構體的Met-SO還原為Met，從而恢復蛋白質的天然構象與功能［27］。Msr催化游離及多肽鏈中Met-SO的還原類型有3種，分別為：1-Cys-Msr、2-Cys-Msr、3-Cys-Msr［28］，其中以2-Cys-Msr的應用最為普遍。2-Cys-Msr含有兩個Cys殘基，其中一個為催化Cys殘基；另一個為循環(huán)Cys殘基。2-Cys-Msr的催化機制具體如下：首先，催化Cys殘基對Met-SO的硫原子進行親核攻擊，產生Msr-MetSO復合體；其次，由Msr上的循環(huán)Cys殘基對此復合物的硫原子進行親核攻擊，產生含分子內二硫鍵的Msr、Met和水分子；最后，由還原劑Trx實現(xiàn)Msr的還原再生，整個循環(huán)結束。

圖2 Trx、Srx、Msr等在蛋白質可逆氧化修飾過程中發(fā)揮作用的機理及再生機制

1.2.4 ROS對Cys的可逆氧化修飾

1.2.4.1 ROS對Cys的巰基亞硝基化修飾 Stamler［33］首先提出了蛋白質巰基亞硝基化修飾，認為一氧化氮（nitric oxide，NO）作用于蛋白質疏水區(qū)的Cys巰基使之由-SH變成-SNO。根據(jù)作用于巰基的程度又可將亞硝基化分為兩種：一種是蛋白質巰基被NO直接亞硝基化作用；另一種是由低分子質量巰基亞硝基化化合物向蛋白質的轉亞硝基化作用［34］。作用位點多在蛋白質Cys上，又分單亞硝基化修飾和多亞硝基化修飾［35-37］。此種修飾包括亞硝基化和去亞硝基化，是一種可逆修飾。蛋白質巰基亞硝基化產物一旦形成后比較穩(wěn)定，能活化鈣離子通道［38］。

1.2.4.2 ROS對Cys的谷胱甘肽化修飾 谷胱甘肽化（glutathionylation）即GSH在谷氧還蛋白酶（glutaredoxin protease，GrxP）的催化下與蛋白質的Cys形成二硫鍵，該過程是可逆的［1］。GSH修飾對酶活性造成的影響可以由還原劑逆轉，而氧化作用則會導致氧化還原酶的不可逆失活［39］。目前可以采用與S-亞硝?；嗨频姆治龇椒ǎ谏锼貥擞浀鞍赘患皩Φ鞍走M行酶解，富集谷胱甘肽化肽段，從而鑒定到發(fā)生修飾的位點［40］。氧化應激過程和正常生理狀態(tài)下都可發(fā)生谷胱甘肽化與去谷胱甘肽化，谷胱甘肽化是由Grx、Trx和蛋白質二硫鍵異構酶（protein disulfide isomerase，PDI）等催化產生的，其中Grx催化活性及特異性最強［41］。

1.2.4.3 ROS對Cys的可逆氧化修飾及各種氧化還原蛋白的作用 Cys的可逆氧化還原作用機制如圖2所示，Cys在氧化條件下可形成二硫鍵、亞氧硫基（-SOH）、亞硫酸基（-SO2H）、硫酸基（-SO3H），其中硫酸基是Cys的不可逆氧化形式，可能與生物活性的喪失有關；另外3種均為可逆過程，其可逆過程主要依賴3種氧還蛋白：Trx、硫氧還蛋白（sulfiredoxin，Srx）和Grx。值得注意的是，Trx、Grx、Srx的靶目標是氧化修飾后的Cys殘基，過氧化物氧化還原酶（peroxiredoxin，Prx）也是Cys氧化修飾經常出現(xiàn)的氧還蛋白［42］，雖然其作用底物主要是過氧化物酶，但也有研究發(fā)現(xiàn)Prx也可以參與可逆反應，催化Cys-SO2H的可逆氧化［43］，因此本文將Prx列入蛋白質中Cys殘基可逆氧化修飾的氧化還原蛋白中。Trx與Srx的中文翻譯名字相同，均為硫氧還蛋白［44，45］，但就兩者依賴的再生機制不同可以看出，Trx是依賴NADPH還原的硫氧還蛋白，Srx是依賴腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）再生的硫氧還蛋白。硫氧還蛋白系統(tǒng)（thioredoxin system，Trxs）和谷氧還蛋白系統(tǒng)（glutaredoxin system，Grxs）是目前已知的胞內負責還原二硫化物的主要系統(tǒng)。Trx和Grx上都含有Cys殘基，其上的2個Cys殘基可通過轉移2個電子和2個質子可逆地形成二硫化合物，使巰基和二硫化合物相互轉換，為一系列生理反應提供氧化還原對能可逆地催化許多氧化還原反應。Trxs是由Trx、NADPH和硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase，TR）3部分組成的，還原態(tài)的Trx通過巰基供氫使其它含有二硫鍵的蛋白被還原；氧化態(tài)的Trx被NADPH還原，繼續(xù)發(fā)揮作用。該系統(tǒng)能夠穩(wěn)定細胞內環(huán)境，調節(jié)細胞生長及信號傳導過程來保護細胞［46］。通常在Trxs中電子傳遞路徑為：NADPH→TR→Trx→含二硫鍵的靶蛋白。Grxs包括NADPH、GSH、谷胱甘肽還原酶（glutaredoxin reductase，GR）和Grx。Grx系統(tǒng)中，電子傳遞路徑為：NADPH→GR→GSH→Grx→含二硫鍵的靶蛋白。

Srx是一類多功能酸性蛋白［12］，在實現(xiàn)Cys亞磺酸的還原中起著重要的作用，其作用機理主要是：（1）ATP與亞磺酸反應并使亞磺酸磷酸化；（2）Srx與磷酸化產物作用生成中間復合體；（3）利用Trx/GSH等還原上述中間產物，生成次磺酸，Srx的還原是在Srx的特異性誘導劑的作用下實現(xiàn)的；（4）次磺酸通過形成二硫鍵被Trx/GSH等進一步還原為Cys。其電子傳遞路徑如下式所述：Cys-SO2H（+ATP）→ Cys-SO2-PO32-（+Srx）→ Cys-SO-S-Srx（+Trx/GSH）→ Cys-SOH。

總而言之，目前對這些氧化還原蛋白Trx、Grx、Srx和Prx的研究各有側重，四者的關系應是各行其道，互相輔助。ROS脅迫下，Prx發(fā)揮清除ROS的功能，Srx在還原亞磺酸時需要Trx輔助，Trx與Grx需要共同的還原力NADPH。由此可見，Cys的可逆氧化修飾中各種氧化還原蛋白有兩種類型（圖2），一種是直接參與氧化型Cys殘基還原過程的氧還蛋白類，如Trx、Grx和Srx等；另一種是間接參與氧化型Cys還原過程的氧還蛋白還原酶類，如GR和TR。

1.2.5 ROS對Cys的不可逆氧化修飾 Cys在氧化條件下可形成二硫鍵、亞氧硫基（-SOH）、亞硫酸基（-SO2H）、硫酸基（-SO3H），其中亞硫酸基和硫酸基是Cys的不可逆氧化形式，可能與生物活性的喪失有關［47］。為了系統(tǒng)地研究細胞的氧化還原調節(jié)，Yano等［48］采用硫醇特異的熒光標記，并結合兩種類型的雙向電泳非還原雙向電泳（non-reducing reducing two-dimensional electrophoresis）和等電聚焦十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（isoelectric focusing Sodium dodecyl salt-polyacrylamide gel electrophoresis，IEF SDS-PAGE），成功鑒定到花生中受Trx調控的20多個蛋白。Lee等［47］對一種含有二硫鍵的植物蛋白質進行了研究，采用硫醇親和色譜方法富集目的蛋白，共鑒定到65個公認的含二硫鍵的蛋白質。Moan等［49］則采用雙標記法對啤酒酵母中的硫醇氧化蛋白進行富集和定量，質譜鑒定到64個蛋白質。這些都是ROS對Cys進行了不可逆氧化修飾的佐證。

2 植物蛋白質可逆氧化修飾的意義和方法

2.1 植物蛋白質可逆氧化修飾提高植物抗逆性

植物蛋白質的可逆氧化修飾主要發(fā)生在含硫氨基酸（Met、Cys）上，ROS可促進含硫氨基酸殘基的氧化，主要依賴Trx、Grx、Prx、Srx、Msr等酶類［26，46，50］產生相應的氧化產物。

2.1.1 Met殘基的可逆氧化修飾起著抗氧化劑和信號傳遞的作用 ROS脅迫下，Met殘基可以直接消耗氧化劑，調節(jié)氧化還原反應進行，起抗氧化劑作用［51］。Valley等［52］提出了Met-芳香族氨基酸模型：Met在蛋白質結構組成中位于易于被氧化的芳香族氨基酸如Trp、Tyr和苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）等氨基酸的周圍，并營造出疏水環(huán)境穩(wěn)定蛋白質的結構，在ROS的脅迫下，可以通過犧牲Met實現(xiàn)對芳香族氨基酸的保護，從而實現(xiàn)其抗氧化的功能。在α2巨球蛋白（α2macroglobulin，A2M）、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）［51］和熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）［53］等蛋白質中證明存在這種結構并發(fā)揮抗氧化功能［51］。Msr在Met可逆氧化修飾中起著重要作用，部分Msr基因敲除實驗發(fā)現(xiàn)Msr在植物抗性方面的表現(xiàn)，進一步證明了Met的抗氧化作用［54，55］。

ROS脅迫下，Met也可通過與Met-SO的可逆氧化還原過程調節(jié)細胞氧化還原狀態(tài)。Met殘基位于Ser/Thr磷酸化位點附近，起著疏水識別作用，它的氧化與還原參與細胞信號轉導［56］。Tarafdar等［57］研究證明MsrA可以促進Met與Met-SO之間的可逆氧化還原反應，進而實現(xiàn)細胞氧化還原的調節(jié)。Met殘基在被氧化后會致使蛋白質相關屬性如結構和疏水性等方面發(fā)生變化，抑制激酶的識別和磷酸化從而將氧化信號傳遞到目標蛋白上，調節(jié)激酶的活性，從而將氧化脅迫信號與蛋白質磷酸化偶聯(lián)起來［28，31，58］。Met氧化后可以改變鉀離子通道的功能。Met殘基被氧化后會使鉀離子通道的通道蛋白失活，這一過程可以被Msr逆轉恢復［59］。Met殘基氧化后會使依賴Ca2+/鈣調素（calmodulin，CaM）的蛋白激酶 2（calcium/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII）的酶活性上調，該活性也可被Msr逆轉恢復；CaM與鈣調素結合蛋白（calmodulin-binding protein，CaMBP）的親和力下降［27，60］。

2.1.2 Cys殘基的氧化修飾起著抗氧化和信號傳遞的作用 Met的抗氧化機制即為位于易于氧化的氨基酸周圍保護它們，自身的可逆從而實現(xiàn)了對氧化能力的抵抗；Cys的抗氧化機理即為參與可逆氧化氨基酸的還原過程，保護可逆氨基酸的正?？赡?，自己對其他可逆氨基酸的恢復過程從而實現(xiàn)對氧化脅迫的抵抗能力。如Met的可逆還原主要依賴Msr的作用，Msr的作用機制需要依賴Cys殘基的輔助；Cys的可逆還原依賴Trx、Srx以及Prx的作用，這3種氧還蛋白均含有Cys［42，44，61，62］殘基，作用機制同樣也需要Cys殘基的輔助作用。

Cys殘基的可逆氧化修飾在植物中也起著信號傳遞控制開關的作用和控制蛋白質轉錄和穩(wěn)定性的作用［63］，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）級聯(lián)信號在植物信號傳遞中發(fā)揮重要的作用，ROS通過氧化蛋白質Tyr磷酸酶（protein tyrosine phosphatases，PTPs）上的Cys殘基使其失活，進而將氧化還原信號傳遞到MAPKs并使其活化［64］。

2.2 基于蛋白質組學的氧化修飾研究方法

2.2.1 一般蛋白質氧化修飾研究方法 蛋白質組學通過研究整體蛋白質活動來揭示生命運動規(guī)律，是解析功能基因組表達的必要手段［65］。存在的問題主要有兩個：即PTM蛋白的富集分離問題和二級質譜的裂解效率問題。目前廣泛使用的肽段裂解技術包括碰撞誘導解離（collision induced dissociation，CID）和源后衰變（post-source decay，PSD）兩種［1］。蛋白質組學研究技術的主要手段是使用色譜或者凝膠方式進行富集，使用質譜或者凝膠方式進行分析檢測。PTM蛋白質具有不均一性及相對豐度低的特性，對PTM蛋白質進行富集分離十分必要。色譜分離的原理有3類：依據(jù)分子量差異進行色譜分離；依據(jù)蛋白質的親疏水性進行反相色譜分離富集過程中；依據(jù)電荷差異進行色譜分離。一些常見的蛋白質組學研究方法如圖3。一些非蛋白質組學的研究方法也可應用于PTM研究中，圖3列出了3種常用的方法。隨著蛋白質組表達譜研究技術的日益成熟和規(guī)模化，PTM蛋白質組學研究技術已經取得了可喜的進展。目前蛋白質組學研究平臺側重在磷酸化、泛素化和乙酰化修飾的研究，同時為蛋白質可逆氧化修飾的研究提供了重要的思路和手段，可逆蛋白質氧化修飾方興未艾。

圖3 蛋白質研究一般方法與蛋白質組方法的比較

2.2.2 可逆氧化修飾蛋白質組學研究方法 考慮生物體的代謝變化常常是由于修飾程度的改變引起的，因而定量研究PTM尤為重要。定量研究的方法主要是基于凝膠的定量蛋白質組學和基于質譜的定量蛋白質組學?；谀z的定量蛋白質組學技術的核心在染色上，鑒于雙向電泳染全蛋白，染料與蛋白質疏水作用結合和膠上差示電泳技術（differential ingel electrophoresis，DIGE）熒光染料，只標記Lys的染色原理，不適用于蛋白質可逆氧化修飾的研究。基于質譜的定量蛋白質組學又分為相對定量和絕對定量。相對定量的方法包括用同位素標記肽段氨基酸的同位素標記相對和絕對定量（isobaric tags for relative for relative and absolute quantification，iTRAQ）技術，因對蛋白質的選擇性很低，標記所有的氨基末端，前提是將可逆修飾的蛋白質用合適的方法分離出來，再用iTRAQ技術來分析是可行的；同位素編碼的親和標簽（isotope coded affinity tags，ICAT）技術也利用同位素標記氨基酸，ICAT技術本身標記的就是Cys，所以可以用來研究可逆氧化修飾蛋白質，但是ICAT技術不能用來研究不可逆的氧化修飾，原因是Cys的大基團特性使ICAT修飾有困難；因此發(fā)展出絕對定量的三重四級桿質多重反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）技術，用烷基化試劑標記Cys，烷基化修飾蛋白質，還原后再修飾，做質譜，同時結合親和層析，此法可用于Cys可逆和不可逆氧化修飾的研究中。細胞培養(yǎng)氨基酸穩(wěn)定同位素標記（stable isotope labeling with amino acids in cell cultures，SILAC）技術采用體內同位素標記，比較依賴細胞的培養(yǎng)，在植物中應用不多；因此進行體內同位素標記的定量蛋白質組學技術，對細胞培養(yǎng)的依賴性很強，不太適宜在植物上應用。由此可知，將一般蛋白質組學研究技術直接應用于可逆氧化修飾蛋白質組學研究上有一定的局限性，應該結合蛋白質組學技術的原理和科研目的，發(fā)展出適于Met、Cys等可逆氧化修飾及硝化修飾的蛋白質組學研究技術。

Met氧化生成Met亞砜后分子量增加16 Da，可以據(jù)此特性進行色譜分離［65］；Met氧化后從疏水性的Met變?yōu)橛H水性強的Met-SO［66］，利用此特性可使用對角線色譜法（combined fractional diagonal chromatography，COFRADIC）對氧化型氨基酸殘基進行富集［67］；利用Msr對Met亞砜的親和性也可達到對Met可逆氧化修飾的研究目的［67］。由于不同研究對象其氨基酸特性不同，有時需要進行一定的標記或者修飾便于目標蛋白的富集。半胱氨酸的蛋白質組學研究技術即是如此。目前應用蛋白質組學技術鑒定半胱氨酸殘基的可逆氧化修飾時，MRM方法應用的最多，常使用N-乙?；R來酰亞胺（N-acetyl-Maleimide，NEM）等烷化劑對自由巰基進行保護，再利用還原劑如二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）等對氧化型半胱氨酸殘基進行還原，以及利用熒光試劑等便于富集分離，再結合質譜檢測手段進行鑒定及定量［47-49，68］。Yano等［48］采用硫醇特異的熒光標記，并結合兩種類型的雙向電泳（non-reducing/reducing 2-DE和IEF/SDS-PAGE），成功鑒定到花生中受硫氧還蛋白調控的20多個蛋白［1，48］。Lee等［47］對擬南芥含有二硫鍵的蛋白質進行了研究，采用硫醇親和色譜富集目的蛋白，共鑒定到65個公認的含二硫鍵的蛋白［1，47］。Moan等［49］采用雙標記的方法對啤酒酵母中的硫醇氧化蛋白分別進行富集和定量，總共鑒定出64個蛋白質［1，49］。

硝基化氧化修飾與谷胱甘肽化修飾也是一種可逆氧化修飾。Jaffrey等［69］和Hao等［70］對硝基化氧化修飾研究技術進行了提出和發(fā)展，完善了S-亞硝?；鞍踪|的研究策略，大概包括以下步驟［71］：（1）封閉所有自由巰基，選擇性還原 S—NO鍵；（2）引入生物素標簽；（3）通過抗生物素蛋白富集目標蛋白質；（4）結合一維或二維凝膠電泳技術、液相色譜技術和質譜技術等手段進行亞硝?；鞍踪|的鑒定。與S-亞硝?；嗨?，谷胱甘肽化修飾的蛋白質可以采用相似的研究手段，蛋白酶解后用生物素標記蛋白從而完成谷胱甘肽化肽段的富集［1，40］。Cheng等［72］用生物素標記谷胱甘肽-S-轉移酶后采用一種類似免疫印跡的方法檢測谷胱甘肽化蛋白［1，72］；Klatt等［73］借助S-亞硝化谷胱甘肽（S-nitrosoglutathione，GSNO）是GS-供體，可以與蛋白質形成雜和的二硫鍵的特性，把GSNO與瓊脂糖凝膠相結合，通過GSNO柱來富集目標蛋白質［1，73］。

3 展望

植物蛋白質氧化修飾中，蛋白質可逆氧化修飾對植物抵御逆境造成的氧化脅迫意義重大，對它的研究分三個層面，一是通過特定位點的突變實驗來確定有無可逆氧化調控作用；二是利用蛋白質組學的方法測定氧化修飾的程度；三是利用綜合實驗通過控制氧化還原的蛋白酶等的氧化還原特性來解析還原機理及再生機理。

基于蛋白質可逆氧化的研究前景，認為在Trp的可逆氧化機理上值得挖掘；在Srx的再生機理上值得深究；對光合相關蛋白的可逆氧化還原的研究值得關注，特別是蛋白質可逆氧化修飾中還原性蛋白的再生與光合作用相偶聯(lián)，它們與ROS的復雜關系值得系統(tǒng)研究。

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（責任編輯 狄艷紅）

Research Progress on the Oxidative Modification of Plant Proteins Mediated by Reactive Oxygen Species

ZHOU Wen-fei BAI Juan GONG Chun-mei
（College of Life Sciences，Northwest A&F University，Yangling 712100）

Post-translational modification of protein is an important process for precursor protein to its carrying-out function. Some redoxsensitive proteins can be modified reversibly or irreversibly by reactive oxygen species in stress conditions. At present，research on oxidative modification of plants is still in the initial stage. With growing demand on plant developing the ability to defense the harsh environment，more attentions have been focused on the reversible oxidative modification of proteins caused by reactive oxygen species，and some corresponding progresses have been finished in its mechanism and research methods. This review describes the way and sites of oxidative modification of plant proteins and regulation mechanism of various oxidoreductase，aiming at illuminating the significance of reversible oxidative modification in the oxidative stress resulted from defensing the stress to plant. The review also summarizes the effective methods for studying the reversible oxidative modification of proteins. Currently，via mutations of specific sites and proteomics it is feasible to determine whether or not there are reversible oxidative modifications and in which extent the oxidative modification is. Moreover，in future，it is aimed to dissect the reduction and regeneration mechanism by comprehensive experiments to control the proteins involved in reactions.

reactive oxygen species；proteins；post-translational modification；methionine；cysteine

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.002

2016-09-16

國家自然科學基金面上項目（31370599）

周文菲，女，碩士研究生，研究方向：植物逆境生理學；E-mail：2464731587@qq.com

龔春梅，女，博士，副教授，研究方向：植物逆境生理與分子生物學；E-mail：gcm228@ nwsuaf.edu.cn