植物4香豆酸：輔酶A連接酶研究進展

田曉明 顏立紅 向光鋒 蔣利媛

（湖南省森林植物園，長沙 410116）

植物4香豆酸：輔酶A連接酶研究進展

田曉明 顏立紅 向光鋒 蔣利媛

（湖南省森林植物園，長沙 410116）

4香豆酸：輔酶A連接酶（4-coumarate：coenzyme A ligase EC6.2.1.12，4CL）是木質素生物合成途徑中的一個關鍵酶，催化肉桂酸及其衍生物生成相應的硫酯。同時也是苯丙烷類代謝途徑中的第三個步驟，連接木質素前體和各個分支途徑的紐帶，在木質素合成過程中發揮了重要的調控作用。近年來利用基因工程手段調控木質素生物合成，降低木質素含量，減少制漿造紙過程中的污染已成為研究熱點。結合國內外關于4CL的研究成果，對植物4CL基因家族、酶學性質、晶體結構以及4CL在調控木質素生物合成中的作用等方面進行綜述，并對4CL的研究方向提出展望，旨為對該基因的研究提供參考。

4CL；木質素；酶學；晶體學；基因調控

木質素是植物體中僅次于纖維素的一種重要大分子有機物質，其總量占生物圈中有機碳含量的30%，占木本植物細胞壁干重的16%-35%［1］。陸生植物的木質素合成是其適應陸地生態環境的重要進化特征之一。細胞內合成的木質素單體滲入到一些特化的細胞壁中（如木質部的導管、厚壁組織和韌皮部纖維等）形成木質素的聚合體，對植物體維持完整的細胞結構、疏導水分和養料、防御病原菌侵害等方面有重要作用。由此可見，木質素在植物的生長發育和抗性方面具有重要的生物學功能［2，3］。

普遍認為，4-香豆酸：輔酶A連接酶（4-coumarate：coenzymeA ligase，4CL）作用于苯丙烷類代謝途徑的第3個步驟，是聯系木質素前體和各個分支途徑的紐帶，在木質素單體合成過程中發揮了重要的調控作用［4，5］。4CL催化肉桂酸及其羥基或甲氧基衍生物生成相應的輔酶A酯，這些中間產物隨后進入苯丙烷類衍生物支路合成途徑［6］。其中以p-香豆酸、阿魏酸和芥子酸為底物生成的香豆酰CoA、阿魏酰CoA、芥子酰CoA，被進一步轉化為肉桂醇衍生物，最終通過脫氫還原反應生成木質素單體［7］。由于木質素重要的生物學功能及生產價值，近年來對4CL酶基因的研究成為熱點。本文對植物4CL基因家族、4CL蛋白酶學、4CL蛋白晶體學、4CL調控木質素生物合成等方面進展展開綜述如下，旨為今后對該基因的研究提供參考。

1 植物4CL基因家族

近30年來，植物4CL基因序列被相繼克隆出來。 我 們 從NCBI（national centerfor biotechnology information）了解到，4CL基因的DNA或cDNA序列已從歐芹（Petroselinum crispum）［8］、水稻（Oryza. sativa）［9］、 擬 南 芥（Arabidopsis thaliana）［1］、 煙草（Nicotiana tabacum）［10］、 和 毛 白 楊（populus tomentosa carr）［11］等約40多種［12-21］植物中克隆出來（表1）。黃勝雄［22］等對已有的4CL序列進行系統進化分析，發現植物4CL基因主要聚為2 類：第1 類包括擬南芥、大豆、煙草、楊樹等大部分雙子葉植物的4CL基因；第2 類包括水稻、玉米、黑麥草這幾種單子葉植物和裸子植物的4CL基因。這表明在4CL 基因與植物的進化過程密切相關。同時，也表明單子葉植物和雙子葉植物分化之前，4CL 基因在植物中已經存在，而且4CL 基因在植物中的進化時間早于單子葉和雙子葉植物的分化時間。

隨著植物中分離鑒定到越來越多的4CL基因，研究人員發現4CL具有被多基因所編碼的特點，表明4CL基因在植物的進化過程中，隨著植物基因組的倍增產生了基因的多個拷貝，形成了同源的家族基因。目前已知，擬南芥［23，24］、大豆（Glycine max）［25］、覆盆子（Rubus idaeus L.）［26］、香鱗毛蕨（Dryopteris fragrans）［16］、 美 洲 山 楊（Populus tremuloides）［7］中存在2-4個4CL家族成員，這些4CL家族基因的出現，與植物進化過程中一些新功能的產生有著密切的聯系，因此各個家族成員在基因結構和功能上的相似度不盡相同。

盡管目前已從許多植物中分離鑒定了4CL基因，4CL基因家族的大小依然未知，甚至在擬南芥、楊樹等模式植物中，雖然已知全部基因組序列，4CL基因家族的真正范圍仍然未知［27］。造成這種現象的原因可能是因為4CL基因具有特異性的表達模式，在特定的時空低豐度表達某些家族成員，從而阻礙了基因家族的鑒定［28-30］。相信隨著功能基因組學和比較基因組學的不斷深入，研究人員將逐漸確定不同植物基因組中4CL基因的數目。

2 4CL酶學特性

在木質素生物合成過程中，4CL基因對羥基肉桂酸衍生物的偏好性及其表達模式有很大差異。例如，擬南芥中At4CLl和At4CL2編碼的同工酶與木質素單體合成密切相關［31］。而At4CL3主要在花中表達，激活p-香豆酸作為查耳酮合成酶的底物，參與類黃酮的生物合成；At4CL4在只在特定條件下低水平表達［32］，其發育和脅迫誘導的表達模式機理至今未知。大豆［33］中Gm4CL1和Gm4CL2參與植物生長和發育（包括木質化過程）。毛白楊［34］中，Ptc4CL1參與木質部的木質素生物合成，而Ptc4CL2參與表皮細胞中酚類化合物（如類黃酮）的生物合成。以上結果表明，同一物種的4CL基因的不同成員mRNA的表達表現出器官、組織的特異性，這可能與不同成員參與不同的分支途徑有關。

植物4CL對芥子酸沒有活性是一個普遍現象。例如，毛白楊4CL1［35］對p-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸有很高的親和力，它們的Km值在40-60 mol/L之間，而對肉桂酸的親和力較低，對芥子酸幾乎無活性；擬南芥中At4CL2的最適底物為咖啡酸，對肉桂酸的轉化能力也很低，對阿魏酸和芥子酸沒有活性。大豆中GmCL2、GmCL3 和GmCL4均不能催化芥子酸，而At4CL4和Gm4CLl能特異的催化芥子酸。對已有的4CL氨基酸序列比對分析表明，在所有已知的4CL氨基酸序列中存在保守的肽基序（motif）：AMP結合功能域（Motif I）和Box II（Motif II）。Motif I作為底物結合區域（SBP）參與了底物的識別。SBP的空間大小決定了4CL能否與羥基肉桂酸衍生物結合。Motif II直接參與催化反應，同時與穩定蛋白質的活性和空間構象有關［36］。用blast 比對不具有芥子酸催化活性的4CL基因序列與At4CL4和Gm4CLl（圖1）發現，SBP中的氨基酸338Val在At4CL4和Gm4CLl中特異性缺失［37］。這個研究結果有助于人們更好地理解苯丙烷類代謝途徑中關鍵酶的催化行為，并設汁具有新的底物特異性的4CL蛋白。但是，并未從根本上揭示4CL同工酶底物特異性的分子機制。要闡明4CL蛋白結構與功能的關系，最佳的方法就是獲得4CL蛋白的晶體，采集晶體結構數據，解析4CL蛋白的原子結構和催化機制。

表1 4CL的基因和cDNA序列

圖1 不同植物中4CL部分序列比對圖［38］

3 4CL蛋白晶體學研究

早在20世紀70年代初，4CL蛋白的研究就已經開始進行，但是4CL蛋白的三維結構解析進展緩慢，其蛋白結晶體的獲得成為當前4CL研究中的一個難點。2010年，胡永林等［38］獲得了高質量的毛白楊4CL1蛋白質結晶體，并解析出毛白楊4CL1晶體結構（圖2-A）。毛白楊4CL1基因包含536個氨基酸殘基，4CL1蛋白由兩個有機結合的球狀結構域組成。這兩個結構域分別為N-domain和C-domain。其中N-domain較大，由434個氨基酸殘基組成，是底物容納口袋。N-domain又可以分成3個子結構，這3個子結構分別為N1、N2和N3。C-domain較小，由第435-536位的氨基酸殘基組成，包含了催化位點。根據對4CL-APP復合體的晶體結構研究分析（圖2-B）發現，C-domain相對于N-domain旋轉了818度，N-domain中每355到391個原子的長度為1.9-2.2?，而C-domain的每71-103個原子的長度為0.9-1.7?。4CL具有催化活性的氨基酸殘基為Lys-438、Gln-443和 Lys-523，底物識別活性的殘基為Tyr-236、Gly-306、Gly-331、Pro-337和Val-338。底物識別口袋的大小決定了4CL的底物特異性。

毛白楊4CL1母體蛋白晶體和衍射單晶的獲得，使得從分子水平上闡明其催化反應和底物偏好選擇機理提供了可能，并為4CL蛋白參與的生物代謝途徑的改造提供了理論依據，同時也為植物中木質素生物合成和黃酮類的生物合成機制提供了直接的理論依據，在苯丙烷類化合物的生物合成中具有極大的應用價值。

4 4CL基因的表達與調控

植物次生代謝途徑中絕大多數基因屬于調控基因，4CL基因也不例外，其在植物不同組織中的差異表達主要受發育和環境因子的雙重調控。4CL受發育調控的研究例證很多，如Lee等［39-41］發現擬南芥4CL基因在苗期階段即被活化，其活性與子葉和根部木質素形成有密切相關。趙艷玲等［42，43］發現，毛白楊4CL的表達水平與早材和晚材的形成階段相符合，在一個生長季節中呈現“雙峰”模式。Reinold等［44］通過原位雜交研究煙草花發育過程中4CL的時空表達規律，結果表明在花發育的不同階段，轉基因煙草的心皮、花藥、花瓣及萼片中4CL的表達量存在差異。

植物4CL基因在不同發育階段表達受到啟動子的調節。研究人員最早從歐芹中克隆到4CL啟動子，全長1 530 bp，在木質部特性定位表達［45］。丹參［11］4CL啟動子驅動GUS在幼嫩擬南芥子葉的頂端和下胚軸，以及生長40 d的擬南芥葉片的邊緣、萼片、花藥中表達。潘翔等［34］分離克隆了毛白楊中4個4CL基因家族成員的啟動子，并在轉基因煙草中分析4個啟動子的組織特異性表達模式。研究表明，4個啟動子驅動GUS的表達部位和表達模式有差異，其中Pto4CL4p和Pto4CL5p調控的表達模式比較接近，Pto4CL3p驅動的組織特異性表達同時具有發育階段特異性。

除發育調控外，4CL基因在植物中也被傷害、病原體感染、紫外線輻射等外界刺激所激活而表達。目前已證實茉莉酸處理、傷害脅迫處理歐芹的成熟葉片，4CL mRNA均瞬間高豐度增加［46］。Uhlmann等［33］用晚疫病菌（Phytophthora infestans）感染馬鈴薯葉片，4CL轉錄活性2 h后達到最大值，接種12 h后，4CL酶活性增加2倍。Ehlting等［23］用植物霜霉病的致病寄生真菌（Peronos poraparasitica）的孢子感染擬南芥子葉，發現該致病因素強烈誘導At4CL1和At4CL2 mRNA的表達，而At4CL3 mRNA則不被誘導；紫外線照射擬南芥6 h后，At4CLl和At4CL2轉錄活性達到最高；含致病基因avrB的十字花科（Cruciferae）黑斑病假單胞菌（Pseudomonas syringae pv. maculicola）侵染擬南芥6 h后，4CL均被激活表達，并產生不協調的交互作用。At4CL基因不同程度的脅迫反應也說明植物體內4CL 家族各成員可能參與了不同的生物代謝途徑。

隨著分子生物學尤其是基因測序技術的不斷發展，更多不同來源的苯丙烷類代謝途徑基因被分離和鑒定，通過與已知的序列進行比對分析，發現 4CL、PAL 和C4H 基因的啟動子區域都有保守的“AC”順式作用元件，包括boxP、boxA、boxL。他們是決定以上3個基因在誘導因子、紫外線和傷害等脅迫條件下特異性表達的關鍵元件［47］。Logemann等［48］發現，含有紫外線的白光、真菌誘導子和機械傷害能誘導歐芹 PAL、C4H和4CL 基因mRNA同時瞬時表達。誘導子處理燕麥葉片后，PAL、C4H和4CL 酶活性同時達到最高水平。以上研究結果表明，PAL、C4H 和4CL 基因的表達具有轉錄水平上的協同調控性。由于PAL、4CL和C4H是苯丙烷代謝途徑的關鍵基因，對木質素生物合成具有重要調控作用。因此，以上研究成果，有利于研究者探究苯丙烷類代謝途徑和木質素生物合成途徑中各個酶系之間的相互作用，也為實現多基因的協同表達調控提供了更多的信息。

5 4CL基因在基因工程中的應用

把木質素生物合成途徑中的關鍵基因定位為靶基因，構建該基因的反義、正義或干涉結構的表達載體并進行遺傳轉化，利用獲得的轉基因植株，進行基因表達和調控研究，是對木質素合成途徑進行系統研究的有力手段之一。4CL處于苯丙烷類代謝途徑形成不同類型產物的轉折點上，催化各種羥基肉桂酸生成相應的硫酯，這些硫酯同時也是苯丙烷類代謝途徑和各種末端產物生成途徑的分支點。因此，通過基因工程手段上下調節4CL酶活性，是對其進行功能分析的重要途徑。目前已獲得大量4CL轉基因植株，這些轉基因植株在4CL表達、木質素含量、組成和植株發育等方面存在很大差異［27］。

Lee［41］采用反義手段分別抑制擬南芥和煙草中的4CL活性，結果發現轉基因植株中木質素總量明顯下降，G型木質素降低，S型木質素不發生變化，從而導致S/G比值升高，同時轉基因植株的生長發育沒有受到影響，導管也未發生形變。Xu等［49］通過RNA干涉方式抑制柳枝稷（Panicum virgatum）中4CL的表達，研究結果中，轉基因柳枝稷4CL酶活性降低80%，木質素總量、G型木質素含量都顯著降低，而轉基因植株的生物量，纖維水解能力顯著提高，同時導管形態未發生變化。Hu等［7］利用反義RNA技術抑制山楊（Populus davidiana Dode）4CL1基因表達，4CL1活性下降90%以上的轉基因株系中木質素含量下降達45%，且根、莖、葉生長勢增強，纖維素含量明顯增加，轉基因植株中木質素與纖維素的含量存在互補調控作用。Voelker等［50］運用反義RNA技術抑制雜交楊（Poplus tremula×populusalba）中4CL1表達，結果發現，木質素的總量與4CL1 mRNA的表達量呈明顯正相關關系，4CL mRNA表達量降低50%，導致木質素含量下降超過10%，木材S/G比值也降低，轉基因植株出現矮灌化，導管出現塌陷形變，但是木質素的降低并沒有引起糖化作用的提高。Wagner等［51］采用RNA干涉手段抑制油松（Pinus tabulaeformis）4CL的活性，轉基因油松的木質素總量降低28%，G型木質素降低，H型木質素提高，H/G比對照高4倍，同時木材細胞壁中多糖含量明顯增加，雖然轉基因植株表型未發生變化，但是管胞的木質化程度極大地降低，僅僅只有S1層中的管胞的木質化程度正常。

我國科研工作者對4CL基因調控木質素的生物合成也進行了系統的研究。李金花［27］以毛果楊×美洲黑楊雜種H11為材料，獲得了楊樹Ptd4CL3的全長cDNA序列，并通過Northem雜交證實，Ptd4CL3在木質部中表達量最高，將Ptd4CL3正義、反義基因分別導入白楊派雜種無性系717中，獲得轉基因楊樹，結果表明，正義和反義4CL基因調控均引起轉基因楊樹4CL酶活性和木質素總量的降低，并且反義調控比正義調控對基因表達的抑制作用更明顯，且所有轉基因植株的形態和生長發育未見異常。李楨［52］通過反義抑制4CL基因表達獲得了轉基因毛白楊，顯微切片觀察發現，轉基因植株中存在極少數輕度形變或發育不良的導管，但轉基因楊生長狀態良好。賈彩虹［53，54］發現反義抑制的4CL轉基因煙草木質素含量平均下降10.3%，且開花期存在花瓣開裂現象。陸海等［55］將組成型啟動子CaMV 35S及形成層定位啟動子GRPl.8分別和反義毛白楊4CLI基因融合，并分別導入煙草中，通過對轉基因煙草纖維素和木質素含量的對比分析，發現CaMV35S啟動的反義4CL1轉基因煙草纖維素含量比對照提高了11.4%，而木質素含量降低了19.1%；GRP1.8啟動的反義4CLl轉基因煙草木質素含量較對照平均下降了13.7%，而纖維素含量升高了15.6%。趙艷玲等［43］將GRP1.8啟動子和CaMV35S啟動子分別與反義毛白楊4CL1基因結合，并分別導人741毛白楊中，獲得轉基因741毛白楊，分析發現，GRP1.8啟動的反義 4CL1酶活性在莖和根中的降低量高于葉片；另外還發現，由CaMV35S啟動的4CL1 RNA干涉轉基因毛白楊，4CL基因的表達量、酶活性、木質素含量都顯著降低，并且，RNA干擾技術阻礙基因表達能力要優于反義RNA技術，這可能是由于4CL基因有許多同源的基因家族成員，RNA干涉更有效的降低了同源基因的表達。目前為止，溫室中的轉基因幼齡楊的生理特性已經得到了詳細研究，而野外生長的轉基因楊的生理生化特性沒有足夠認識，而且調控木質素合成的轉基因植物也缺乏整個生長季的觀察和檢測分析，植物在野外生長過程中會遇到許多在溫室中不存在的因素的影響（如風、雨和霜等），因此考察在溫室中培育的植物在野外繼續生長過程中能否保持其特征是一項很基礎的研究。田曉明等［56］對1年生和5年生轉基因楊樹分別從生理生化、基因表達、細胞壁組成、細胞壁解剖結構和木材品質等角度進行研究。結果表明，調控4CL的基因表達，將對木質素單體合成途徑相關基因表達產生協同調控作用，最終也對木質素單體組成產生影響。

6 展望

4-香豆酰-CoA 連接酶（4CL）是苯丙烷類代謝途徑下游分支途徑上處于終端位置的酶，是連接苯丙烷代謝途徑與木質素生物途徑的關鍵酶，在木質素單體合成中起關鍵調節作用。但生物某個性狀通常是由多個基因共同控制，在林業生產上，由于單個轉基因的信號強度較弱，很難獲得理想實驗的植株，多基因共同轉化將有待解決這一難題。隨著分子生物學尤其是“基因組計劃”的發展，擬南芥、水稻、毛果楊等植物全基因組測序已經完成。使得研究人員不僅可以研究單一酶基因的結構和功能，還可以從基因家族、基因簇等層面研究代謝途徑中多個酶基因的協同表達與調控，這為研究4CL的結構和功能提供了新的方向。

已完成的擬南芥全基因組測序中鑒定出4種4CL基因的功能，但在擬南芥基因組中還存在許多4CL相似的基因，這些4CL相似基因的功能尚不得而知。毛果楊等木本植物中有多少4CL基因，其功能如何尚在研究中。相信“基因組計劃”的發展，會分離并鑒定出更多植物的4CL基因。

由于木本植物生長周期較長，個體基因型的不同會在不同程度上影響到植株再生和轉化效率。因此，調控4CL基因影響植株生長的作用機制尚不清楚，關于轉4CL基因木本植物的細胞壁化學組成、木材品質和解剖特性等材性研究尚不多見。田曉明等［56］對轉4CL基因毛白楊進行細胞壁組成、細胞壁解剖結構和木材品質等分析發現，4CL1基因對生長素含量具有間接調控作用，轉基因毛白楊木質部導管形態變化，導致木質部傳導性降低，干擾植物的正常生理代謝，從而對植株生長產生影響。

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（責任編輯 李楠）

Research Progress on 4-Coumarate：Coenzyme A Ligase（4CL）in Plants

TIAN Xiao-ming YAN Li-hong XIANG Guang-feng JIANG Li-yuan
（Hunan Forest Botanical Garden，Changsha 410116）

4CL（4-coumarate：coenzyme A ligase，EC6.2.1.12）is a key enzyme in the lignin biosynthesis pathway，and it catalyzes a hydroxycinnamic acids and its derivatives to generate the corresponding thioester. Concurrently，4 CL is also the third step in the metabolic pathway of phenylpropane，ligating the precursor of lignin and varied branch pathways，playing the critical regulating role in the lignin synthesis. It has become a research hotspot that uses the genetic engineering way to alter lignin biosynthesis，to reduce lignin content，and to decrease the pollution in pulp and papermaking process. Combining the new reports about 4CL in recent years，we summarized the research progresses on phylogenetics，enzymatic activities，crystal structure and catalytic mechanism and regulation of 4CL in lignin biosynthesis. The future directions of researches on 4CL were also suggested, This paper provides reference information for 4CL in the future study.

4CL；lignin；enzymology；crystallography；gene regulation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.003

2016-09-06

湖南省林業科技計劃項目（XLK201514），湖南省科技計劃項目（2016NK2156），湖南省重點研發計劃項目（2016NK2194）

田曉明，女，博士后，高級工程師，研究方向：珍稀瀕危植物致瀕機理、保護與利用；E-mail：tianxiaoming1986@126.com