CRISPR/Cas9技術存在的問題及其改進措施的研究進展

袁偉曦喻云梅胡春財趙祖國

（1. 廣東醫科大學微生物學與免疫學教研室，湛江 524023；2. 解放軍第422中心醫院，湛江 524023）

CRISPR/Cas9技術存在的問題及其改進措施的研究進展

袁偉曦1喻云梅2胡春財1趙祖國1

（1. 廣東醫科大學微生物學與免疫學教研室，湛江 524023；2. 解放軍第422中心醫院，湛江 524023）

CRISPR/Cas9技術是一種RNA引導的基因組編輯技術，能對基因進行精確性敲除、敲入、替換等，從而實現探究基因功能、修復致病基因等目的。該技術憑借操作簡便、價格低廉、可對基因位點進行編輯、可拓展性強等優勢，在近幾年迅速發展完善，已成為繼鋅指核酸酶技術和類轉錄激活因子效應物核酸酶技術之后的第三大基因組編輯技術。在簡單介紹CRISPR/ Cas9技術的作用機制后，主要針對該技術現階段面臨的精確修復比例低、PAM限制識別序列、脫靶現象、馬賽克現象的問題以及相應的改進措施進行闡述，旨在讓研究者客觀的認識CRISPR/Cas9技術存在的不足之處，為合理使用或改進該技術提供系統的文獻綜述。

CRISPR/Cas9；基因編輯；精確編輯；脫靶；馬賽克現象

目前基因編輯技術主要包括鋅指核酸酶技術（zinc finger nucleases，ZFNs）、類轉錄激活因子效應物核酸酶技術（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）和CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，成簇的規律間隔的短回文重復序列）/Cas9（CRISPR-associatedprotein 9，CRISPR相關蛋白）技術。ZFNs技術和TALENs技術分別借助鋅指蛋白和類轉錄激活因子效應物識別特異DNA，再利用FokⅠ核酸內切酶切割靶目標。CRISPR/Cas9技術依靠sgRNA識別序列，Cas9蛋白切割序列。雖然ZFNs技術和TALENs技術在基因、序列、細胞、物種限制和特異性方面比CRISPR/Cas9技術有優勢，但隨著CRISPR/Cas9技術的日趨完善，其優勢逐漸凸顯：（1）操作簡單，設計靈活，價格低廉；（2）能實現多點編輯［1］；（3）可擴展性更強，可與 piggyBac（PB）轉座子系統［2］或Cre/LoxP重組酶系統［3］等聯用。本文介紹CRISPR/Cas9技術及其作用機制，主要針對該技術目前存在的問題及相應的改進措施進行綜述，為合理使用或改進該技術提供思路。

1 CRISPR/Cas9簡介

CRISPR/Cas系統是原核生物特有的一種天然免疫系統，用于抵抗病毒或外源性質粒的侵害［4］。根據Cas蛋白的特點，可將CRISPR /Cas系統分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，Ⅰ型和Ⅲ型系統需要借助復雜的蛋白復合體發揮作用，而Ⅱ型系統僅借助Cas9蛋白和導向RNA（guide RNA，gRNA）即可對靶目標進行編輯，結構更簡單且易于操作，因此目前基因編輯中使用的主要是Ⅱ型化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes，Sp）CRISPR/Cas9系統（圖1）。

2 CRISPR/Cas9作用機制

圖1 CRISPR/Cas9技術原理圖

CRISPR/Cas9主要由兩部分組成：gRNA和Cas9蛋白。gRNA由CRISPR RNA（crRNA）與反式激活crRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）組成，crRNA的一部分序列能與tracrRNA配對，形成雙鏈RNA結構；一部分序列與靶目標互補區域，以此識別靶序列。tracr RNA不僅可穩定crRNA，還可參與Cas9蛋白與DNA的結合與切割［5］。基因編輯時可使用單獨的crRNA和tracr RNA，也可使用二者嵌合而成的單鏈向導RNA（single guide RNA，sgRNA），單獨的Cas9蛋白是一個二葉片結構，其中一個葉片為核酸酶葉片，包括HNH結構域、RuvC結構域和C端結構域；另一個葉片由α螺旋結構域組成［6］。Cas9蛋白先與gRNA形成復合體，使Cas9蛋白構象變化，產生一條通道，使其更易與DNA結合［7］。該復合體隨機碰撞DNA，若未識別到PAM序列，則會快速離開DNA，發生下一次碰撞［8］；若識別PAM序列，Cas9蛋白的Arg1333和Arg1335會與二核苷酸鳥嘌呤結合，此時，Ser1109和Lys1107形成磷酸鎖（phosphate lock）結構，與PAM序列旁的+1位核苷酸發生相互作用，促使雙鏈DNA解旋，利用RNA-DNA堿基互補配對原則，核對序列與crRNA的互補情況［9］，若在種子序列出現較多錯配，則序列識別過程終止，從而確保Cas9在正確的目標處發揮作用。若完成對靶序列的識別，則可激活HNH結構域，使其發生構象改變，目標鏈進入其活性位點。蛋白和核酸的相互作用，使非目標鏈進入RuvC結構域的活性位點中［10］，使Cas9蛋白對目標鏈和非目標鏈進行切割作用，從而完成基因編輯。

3 CRISPR/Cas9存在的問題及其改進方法

3.1 精確修復比例低

CRISPR/Cas9切斷基因組雙鏈DNA后，斷裂處的修復方式主要是非同源末端連接（non-homologous End Joining，NHEJ）［11］，這是一種錯誤率極高的修復方式，讀框移碼的插入或刪除，導致基因功能喪失；而能在目標位點精確插入期望序列的修復方式—同源介導的雙鏈DNA修復（homology directed repair，HDR）所占比例常不足10%［12-14］（圖2）。CRISPR/ Cas9技術若要成為基因治療的手段之一，必須實現精確定點編輯。研究表明，可通過抑制NHEJ修復或者增強HDR修復來提高精確修復的效率。

圖2 雙鏈斷裂DNA修復原理圖

NHEJ修復主要借助Ku蛋白和DNA連接酶Ⅳ實現，而Scr7以DNA連接酶Ⅳ的DNA結合域為靶標，降低其與雙鏈斷裂的結合能力，從而抑制NHEJ修復。研究表明，將Scr7與CRISPR/Cas9系統共同作用于哺乳動物細胞和小鼠，可大幅降低NHEJ修復，將精確編輯的效率提高數倍，甚至十幾倍［15-17］。

而直接增強HDR修復以提高精確編輯的方法主要有調控細胞周期、引入外源性DNA、化學修飾sgRNA或小分子激活HDR等。NHEJ修復雖然可貫穿整個細胞生長周期，但其在G1期占主要地位，而HDR主要在S期和G2期發揮作用。因此對阻滯在G2/M期的細胞進行基因編輯，可大幅提高精確編輯的效率。研究表明，利用藥物將細胞周期同步化在G2/M期，可將精確編輯的數量增加數倍［18，19］。Cas9從雙鏈斷裂DNA上解離的過程是緩慢的，在完全解離之前，Cas9先釋放非目標鏈的3'端，這使得非目標鏈更容易接受與其互補的外源性單鏈DNA，從而激活HDR修復。研究者通過導入一條與先釋放的非目標鏈互補的單鏈DNA，可將HDR修復的比例提高至60%［20］。對sgRNA進行化學修飾也是一種有效可行的方法。研究表明，以2'-O-methyl（M）、2'-O-methyl 3'phosphorothioate（MS） 或 2'-O-methyl 3'thioPACE（MSP）修飾sgRNA，可增大HDR修復比例，若進一步增加修飾sgRNA的數量，精確編輯效率最高可達83.3%［21］。這一現象可能是由于這些化學基團可增加sgRNA在血清中的穩定性和改變核苷酸的免疫刺激能力。還有研究者在對小分子進行高通量掃描后，篩選出能提高HDR比例的2種小分子—β3腎上腺素受體激動劑L755507和胞內蛋白轉運抑制劑布雷非德菌素A［22］。

此外，利用胞嘧啶核苷脫氨酶［23］或堿基修飾酶APOBEC1［24］修飾Cas9蛋白，可實現對單個核苷酸的精確編輯。雖然實現單個核苷酸編輯使CRISPR/Cas9技術的精確編輯發生質的飛躍，但是目前僅限于將胞嘧啶更換為胸腺嘧啶。遺傳性疾病的基因突變種類繁多，僅一種核苷酸的替換尚不能滿足其要求，在日后的研究中，可繼續改造CRISPR/Cas9系統，以期能實現對核苷酸的精確隨意替換。

3.2 PAM識別序列的限制

前間區序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）是一個位于靶DNA 3'端的短核苷酸基序，可被Cas9蛋白特異性識別。化膿性鏈球菌可識別標準PAM NGG和非標準PAM NAG。理論上，生物基因組中NGG每隔8 bp堿基出現一次；NRG則每4 bp堿基出現一次。但由于不同基因序列上的差異，并非所有的基因都能有合適的PAM。分析玉米的全基因組，在有注釋的外顯子中僅30%能找到特異性切割位點［25］。這表明，PAM在一定程度上限制了Cas9剪切位點的選擇。為了減弱PAM對Cas9蛋白的限制，可對Cas9蛋白進行改造和使用Cas9直系同源酶。

有學者主張改造Cas9蛋白，擴大其PAM的識別范圍。化膿性鏈球菌Cas9突變體VQR（D1135V/ R1335Q/T1337R）識別的PAM為NGAN和NGCG，突 變 體 VRER（D1135V/G1218R/R1335E/T1337R）識別的PAM為NGC，突變體D1135E特異性識別NGG，突變體QQR1特異性識別NAAG［26］。這些變更了識別PAM的突變體，無疑擴大靶位點的選擇。而研究也證實，這些突變體可以在野生型SpCas9無法找到編輯序列的斑馬魚和人類內源性基因位點中，找到合適的編輯位點［27］。

也有學者主張利用Cas9直系同源酶減弱PAM對Cas9蛋白靶位點的限制。目前通過序列比對等方法發現Cas9的直系同源酶已超過1 000種［28］，但已確定PAM序列的Cas9直系同源酶僅有弗朗西絲菌（PAM為NGG）［29］、金黃色葡萄球菌（PAM為NGGRRT）［30］、腦膜炎雙球菌（PAM為NNNNGATT）［31］、嗜熱鏈球菌CRISPR1（PAM為NAAGAAW）［32］、嗜熱鏈球菌CRISPR3（PAM為NGGNG）［33］等少數幾種。這意味著Cas9直系同源酶是一個巨大的侯選庫，可以用于克服化膿性鏈球菌Cas9在一些物種應用上的局限性。為了充分利用Cas9直系同源酶，研究者不僅利用生物信息學與PAM文庫結合的方法確定更多Cas9直系同源酶的PAM序列［34］，而且對已知PAM序列的Cas9直系同源酶加以改造。研究表明，弗朗西絲菌和金黃色葡萄球菌的突變體能將靶向范圍擴大2-4倍［35，36］。

此外，還有學者發現了靶向RNA的C2c2蛋白［37］，這無疑將進一步擴大CRISPR/Cas技術的應用范圍。

3.3 脫靶現象

CRISPR/Cas9基因編輯系統依靠sgRNA的識別序列與靶向序列特異性結合。由于基因組極為復雜，sgRNA可能與其他非靶向序列局部匹配，這種局部匹配也會激活Cas9內切酶活性，從而產生脫靶（圖3）。此外，Cas9不僅識別標準PAM，也可識別非標準PAM，設計靶向序列時忽略了非標準PAM，這也可能會引起一定程度的脫靶。脫靶可能影響正常基因的功能表達，甚至激活致癌因子、抑制抑癌基因，造成安全隱患。目前主要通過改造Cas9蛋白和優化sgRNA兩方面降低脫靶現象。

改造Cas9蛋白以提高特異性的方法主要分為以下幾類：（1）使Cas9蛋白的核酸內切酶活性降低或喪失。無論是使用降低HNH或RuvC結構域功能的突變體H840A和D10A［38］，或是構建使Cas9蛋白喪失核酸內切酶活性，僅保留其核酸識別能力，借助其他核酸內切酶實現基因編輯的CRISPRi［39］和FokⅠ-dCas9［40，41］，這兩種方法均根據Cas9蛋白能被一定錯配范圍內的非靶向序列激活，從而發揮切割作用這一特點設計，使其核酸內切酶活性降低或喪失，一定程度上可提高激活Cas9所需要的序列匹配度，從而大幅提高特異性。（2）降低Cas9蛋白結合DNA的能力。對Cas9蛋白進行定點突變形成eSpCas9［42］和SpCas9-HF1［43］，突變體減弱了Cas9蛋白與DNA的非特異性結合的能力，增強靶向序列與Cas9蛋白結合的競爭力。（3）調控Cas9蛋白在細胞中的表達量。通過使用誘導型啟動子［44］、插入4-HT依賴的內含肽［45］等方法構建誘導型Cas9蛋白，減少基因組暴露于Cas9與sgRNA復合體的時間，即Cas9與非靶向序列的結合概率，進而降低脫靶率。（4）增強Cas9蛋白對標準PAM序列的識別能力。突變體D1135E［27］對標準PAM的識別更加特異，從而降低因識別非標準PAM序列而引起脫靶。

圖3 脫靶機制

而通過優化sgRNA降低脫靶效應的策略主要有（1）改變sgRNA的長度，截斷5'端的2-3個堿基［46］或在識別序列前加2個鳥嘌呤［47］，切割活性不變，脫靶率降低5 000倍。（2）增加sgRNA的穩定性。如在gRNA中增加一對A-U堿基配對等方法。此外，有研究表明Cas9直系同源酶對某些位點的特異性較SpCas9高［48，49］，這無疑為提高特異性提供了一條新思路。通過對CRISPR/Cas9系統的改進，脫靶現象大幅降低，但離完全無脫靶還有一定距離。

3.4 馬賽克現象（Mosacism）

基因編輯技術日趨完善，研究者期望借助基因編輯來闡述基因在早期發育過程中的作用，以及修復胚胎中的突變基因，以避免疾病的發生。目前，將Cas9和sgRNA導入受精卵多是通過電轉化［50］或者顯微鏡下注射［51］的方式，而且多是轉入Cas9 mRNA。但這些方式獲得的突變體多存在馬賽克現象（圖4）。馬賽克現象是指將CRISPR/Cas9系統應用于多細胞生物的受精卵基因編輯時，受精卵分裂成不同的卵裂球，而Cas9蛋白對不同卵裂球的編輯能力和修復方式可能不同，從而出現帶有不同編輯類型的細胞的嵌合個體，或是同時帶有編輯細胞與未編輯細胞的嵌合個體。馬賽克現象出現的原因可能是從受精成功到基因組第一次復制的時間極為有限，而Cas9 mRNA翻譯為蛋白質需要時間長［52］，錯過了在單細胞受精卵發生編輯的時機，且Cas9蛋白和sgRNA半衰期較長［53］，能對一定時間范圍內新分裂生成的細胞進行不同的編輯。不論是觀察基因的作用還是避免遺傳病的發生，都要求生成非鑲嵌的突變體。為避免鑲嵌現象出現，必須使Cas9蛋白在細胞基因組第一次復制之前發揮作用，且之后不再發揮作用。雖然近期研究表明將Cas9蛋白和sgRNA以電轉的方式導入體外受精的早期受精卵中，可大大降低攜帶鑲嵌基因個體的出現［54］。但使該技術完全避免鑲嵌現象，尚有一定難度。

圖4 馬賽克現象

4 結語

雖然CRISPR/Cas9基因編輯技術尚存在一些問題，但是研究者一直致力于尋找解決方法，通過改造修飾Cas9蛋白、使用Cas9直系同源酶、化學物質輔助等一系列措施，已然提高了CRISPR/Cas9基因編輯技術精確修復斷裂DNA能力，降低其脫靶率，減弱PAM導致的靶位點限制，在一定程度上控制了鑲嵌現象的發生。研究者在尋找彌補不足的方法的同時，也在不斷拓展該技術的應用領域。在器官移植領域，利用該技術已成功去除多種豬器官中的豬內源性逆轉錄病毒［55］，使豬器官移植成為可能。在治療病毒感染領域，體外實驗和動物實驗顯示將該技術已能成功去除HIV［56］、乙型肝炎病毒［57］等多種病毒，為這些疾病的治療翻開新篇章。在植物育種［58］、遺傳性疾病治療［59］等多個領域CRISPR/Cas9技術均取得重要成果。CRISPR/Cas9技術還在不斷發展，期待它能在更多的領域發揮作用。

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（責任編輯 狄艷紅）

Current Issues and Progress in the Application of CRISPR/Cas9 Technique

YUAN Wei-xi1YU Yun-mei2HU Chun-cai1ZHAO Zu-guo1
（1. Department of Microbiology and Immunology，Guangdong Medical University，Zhanjiang 524023；2. Central Hospital of PLA，Zhanjiang 524023）

CRISPR/Cas9［clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9］is a RNA-guided genome-editing technique，which can be applied in the deletion，insertion or replacement of specific DNA sequence thus to verify the function of genes or remedy pathogenic genes. Owing to its simplicity，affordability，multiple-site editing and scalability，the technique of CRISPR/ Cas9 is undergoing rapid development and perfection and has been one of the first three prevailing genome-editing technology following that of Zinc finger nucleases and transcription activator-like effector nucleases. In this review，we focus on the current issues of CRISPR/Cas9，including low efficiency of precise-editing，sequence-recognizing limitation from PAM，off-target，unavoidable mosaicism，together with corresponding tactics for improvement. Our aim is to provide the objective understanding on the current disadvantage of CRISPR/Cas9 technique to researchers and the systematic review for reasonable application and improvement of this technology.

CRISPR/Cas9；genome-editing；precise-editing；off-target；mosaicism

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.009

2016-08-12

廣東省科技計劃項目（509164770054），廣東省自然科學基金（2015A030313522，2014A030313538）

袁偉曦，女，碩士研究生，研究方向：基于CRISPR-Cas9技術的鮑曼不動桿菌生物膜相關蛋白定點敲除；E-mail：binglingxi1991@163.com

趙祖國，男，博士，研究方向：微生物耐藥性及分子機制；E-mail：zuguozhao@126.com