基于氨基酸序列和模擬結構預測蛋白質穩定性的研究進展

易華偉 唐曉峰

（武漢大學生命科學學院，武漢 430072）

基于氨基酸序列和模擬結構預測蛋白質穩定性的研究進展

易華偉 唐曉峰

（武漢大學生命科學學院，武漢 430072）

穩定性是蛋白質重要性質之一，工業用蛋白質需要良好的穩定性，進化過程中蛋白質新功能的衍生也依賴于蛋白質的穩定性。提高蛋白質的穩定性，尤其是提高未知結構蛋白質的穩定性是一項非常具有挑戰性的工作——傳統的蛋白質改造方法如定向進化費時費力，傳統的理性設計則難以被其他研究者復制。雖然目前有很多蛋白質穩定性預測工具，但這些預測工具大多都需要預先測定蛋白質的三維結構，因此結構未知的蛋白質的穩定性預測受到了限制。近年來，人們開發了一些利用蛋白質的氨基酸序列和模擬結構來預測突變對結構未知蛋白質穩定性影響的預測工具。介紹該方面的研究進展，以期為蛋白質工程研究提供參考。

蛋白質穩定性；預測工具；氨基酸序列；蛋白質結構模擬

蛋白質包括各種酶，在食品、清潔劑、造紙、冶金、生物燃料等工業生產和應用中發揮著重要的作用［1］，而良好的穩定性是蛋白質在應用中必須具備的重要性質。結構的穩定往往意味著蛋白質能夠在不利條件下依然具備優良的性能［2］。例如，嗜熱蛋白酶由于其結構剛性較強，因此其除熱穩定性較嗜溫蛋白酶好外，在含有變性劑的條件下嗜熱蛋白酶也比嗜溫蛋白酶更具穩定性，具有更高的活性。在蛋白質工程研究中，穩定性好的蛋白質更適合蛋白質功能方面的改造，因為和穩定性較差的蛋白質相比，具有良好穩定性的蛋白質更能耐受大量的氨基酸突變［3］。此外，在進化過程中，蛋白質是通過氨基酸序列的修飾（包括替換、刪除和插入氨基酸殘基）從一個共同的祖先演化而來的［4］，很多學者認為，當蛋白質突變增加新功能的時候其穩定性會降低［5］，所以蛋白質的穩定性在蛋白質進化過程中也發揮著重要的作用。

在傳統的蛋白質工程研究中，主要有定向進化和理性設計兩種方法來獲得更穩定的蛋白質。通過定向進化［6］提高蛋白質的穩定性是指在蛋白質的氨基酸序列中引入隨機突變，構建一個突變體庫，然后在這個突變體庫中篩選出穩定性提高的突變體。定向進化是提高蛋白質穩定性很有效的方法，但也有不足之處——為了得到合適的突變體往往需要建立很大的突變體庫，然后從成千上萬個突變體中篩選出合適的突變體，這是一個耗時、費力并且價格昂貴的過程，當缺乏合適的高通量篩選方法時，定向進化就顯得不夠高效。通過理性設計來獲得更穩定的蛋白質是一種完全不同于定向進化的方法，傳統的理性設計需要研究者在非常了解目的蛋白結構與功能之間關系的前提下，在特定的位點引入突變。和定向進化相比，理性設計不需要構建大量的突變體，但其結果極大地取決于研究者的專業知識，而且整個過程難以被其他的研究者復制［7］。

通過生物信息學的方法預測突變對蛋白質穩定性的影響是目前研究的熱點之一，預測的方法主要分為4類［8］：（1）物理勢能方法；（2）統計勢能方法；（3）經驗勢能方法；（4）機器學習方法。人們利用以上方法開發了一系列與蛋白質穩定性預測相關的軟件/服務器，然而這些軟件/服務器絕大多數都是根據蛋白質結構來進行預測的。隨著高通量測序技術的發展，蛋白質序列的數量和蛋白質實驗解析結構的數量之間的差距正在被進一步拉大［9］，蛋白質結構未知極大地限制了這些預測軟件/服務器的使用，而僅依賴蛋白質的氨基酸序列或模擬結構來預測蛋白質穩定性的軟件就能解決這一難題。下面分別對目前常用的基于氨基酸序列和基于模擬結構預測蛋白質穩定性的生物信息學方法進行介紹。

1 基于氨基酸序列預測蛋白質穩定性

隨著ProTherm（Thermodynamic Database for Proteins and Mutants，http://www.abren.net/protherm/）等數據庫中收錄的越來越多的關于蛋白質及其突變體穩定性的實驗數據，通過機器學習的手段來預測蛋白質穩定性的方法應運而生［10］。機器學習的方法可以分為基于氨基酸序列預測和基于蛋白質結構預測兩種方式，首先介紹基于氨基酸序列預測蛋白質穩定性的機器學習方法。

1.1 預測過程及原理

機器學習方法通常是利用蛋白質的序列、結構特征直接從數據入手建立計算模型，從而進行預測［11］。主要過程如下：給出待測蛋白質的氨基酸序列和氨基酸替換信息，其主要目的是預測該替換能否改變蛋白質的穩定性。通過利用現有的實驗研究數據構建一個分類器來預測氨基酸替換能否使蛋白質穩定性發生變化，即通過自由能的改變（ΔΔG）以及改變的方向預測穩定性的變化——當ΔΔG ＞ 0時，穩定性提高；當ΔΔG ＜ 0時，穩定性降低［12］。機器學習方法利用的蛋白質實驗數據主要包括突變信息（野生型和突變體殘基）、殘基的位置（根據二級結構和溶劑可及性的預測結果）［13，14］、實驗的條件、鄰近的殘基信息、氨基酸性質［12，15］和進化信息［10，16］等。

1.2 相關軟件介紹

人們已經開發出不少基于氨基酸序列的蛋白質穩定性預測軟件/服務器，目前應用較多、已獲得一定認可的有以下幾種：

I-Mutant2.0［17］。I-Mutant2.0是在2005年開發的第一款可以利用氨基酸序列來預測點突變對蛋白質穩定性影響的軟件，該軟件也可以利用蛋白質的三維結構預測蛋白質穩定性。I-Mutant2.0既可以作為一個分類器來預測點突變對蛋白質穩定性的改變方向，也可以用來估算相關的自由能變化值。從交叉驗證的結果可知，該軟件利用結構信息和序列信息預測的結果與實驗數據的結果相比準確率分別為80%和77%。

Mupro。Mupro是Cheng等在［8］2006年開發的一款利用支持向量機預測蛋白質穩定性的在線服務器，該服務器只需要知道蛋白質的序列信息，直接將序列信息作為輸入信號，然后利用機器學習的方法提取對蛋白質穩定性起關鍵作用的序列元件。該服務器也可以通過蛋白質三維結構信息獲得更準確的預測結果，但Cheng認為僅僅依賴于氨基酸序列的預測精度已經達到了和依賴于蛋白質結構預測相近的程度，預測的準確率分別為84.1%和84.5%。

INPS。Fariselli等［18］在2015年開發的軟件INPS是利用支持向量機回歸的方法，通過預測蛋白質單點突變后熱力學自由能的變化來預測突變對蛋白質穩定性的影響。該軟件只需利用蛋白質序列信息，并不需要蛋白質三維結構。在非冗余數據集上進行交叉驗證和在含有大量腫瘤抑制蛋白質p53突變體數據庫中測試結果表明，INPS和最好的基于結構的預測方法，如mCSM、PoPMuSiC和Duet（見后）預測精度非常接近。

EASE-MM。Folkman［13］團隊在近幾年發表了一系列關于基于氨基酸序列預測蛋白質穩定性的文章［13，14，16］，并開發了一款基于序列的預測軟件EASE-MM，該軟件包含了5種專業的支持向量機模型，先利用氨基酸序列預測出突變氨基酸殘基位點附近的二級結構和溶劑可及表面區域，然后將這些信息作為預測的依據。EASE-MM在10倍交叉驗證和獨立測試中皮爾遜相關系數達到了0.53-0.59，這一結果優于其他的預測軟件，如I-Mutant2.0、Mupro、FoldX、PoPMuSiC2.1等（見后），這些軟件在測試中皮爾遜相關系數為0.32-0.57［13］。

MuStab。MuStab［12］通過支持向量機利用自由能的變化來預測突變對蛋白質穩定性的影響。為了準確預測蛋白質的穩定性，其通過利用不同的序列特征來預測氨基酸替換導致的蛋白質穩定性變化，這些序列特征可以分為生物化學特征、結構特征、經驗特征和其他生物學特征4類，該軟件預測的準確率高達84.59%。

Scpred［19］。Scpred是一款蛋白質穩定中心（stability centers）分析軟件，所謂穩定中心即對蛋白質穩定性起關鍵作用的氨基酸殘基，發生在穩定中心的氨基酸突變會降低蛋白質的穩定性。Scpred只需要利用蛋白質序列信息，通過神經網絡方法預測起穩定作用的氨基酸殘基。

1.3 準確率分析

過去人們普遍認為基于氨基酸序列要比基于蛋白質三維結構的預測軟件準確率低［8］，但是Khan等［20］在2010年系統地分析了11種與蛋白質穩定性預測有關的軟件，其中包含了3種基于氨基酸序列的預測軟件，分別是I-Mutant2.0、Mupro和Scpred［19］（前兩個軟件也可以利用結構信息）。結果表明，在預測的準確率上，這3款基于氨基酸序列的軟件和其他8款基于蛋白質結構的預測軟件沒有太大差別，這幾款基于氨基酸序列和基于蛋白質結構預測軟件的準確率分別是37%-49%和44%-64%，近兩年有些研究者更是聲稱其開發的基于序列的預測軟件如INPS和EASE-MM等有著和基于蛋白質結構預測軟件相近甚至更好的表現。

2 基于模擬結構預測蛋白質穩定性

目前大多數和蛋白質穩定性預測有關的軟件都是基于蛋白質的三維結構，對那些未知結構的蛋白質來說，可以先利用相關軟件模擬出蛋白質的三維結構，然后將模擬出的三維結構用于基于結構預測穩定性的軟件。

2.1 蛋白質三維結構模擬

目前蛋白三維結構模擬的依據是基于以下兩點：（1）在進化過程中，蛋白質的結構比序列更加保守；（2）有證據表明，現在已知的蛋白質折疊方式是有限的，數量約1 000-10 000［21］。蛋白質三維結構預測經過30多年的發展，目前預測的方法主要有：利用基于能量或者經驗的能量函數模擬折疊法；從已知結構的小片段構建模型；利用類似能量函數的線串法；依賴模板的模擬法［21］。目前被廣泛使用的蛋白質三維結構模擬網絡服務器有Phyre2［21］、i-TASSER［22］、SWISS-MODEL［23］、HHpred［24］、PSIPRED［25］、Robetta［26］、Modeller［27］和Raptor［28］等，從蛋白質結構預測標準評估法［29］（Critical assessment of methods of protein structure prediction，CASP）的結果可知，這些預測軟件的準確率沒有很大的差別，但是對那些模擬難度較高的蛋白質來說，i-TASSER會有更好的表現［21］。在最新的CASP11［30］中，這些模擬的結構不僅精度很高而且能用于解答相關的生物學問題，如研究者不但準確模擬出人的類異戊二烯合成酶（human isoprenoid synthase）結構，而且還利用該模擬結構準確預測該酶結構域內部的突變會導致單基因遺傳疾病。

2.2 基于結構預測蛋白質穩定性的方法

蛋白質的三維結構能有效用于蛋白質穩定性預測，從結構信息中可以獲得各種不同的能量函數和勢能，如接觸勢能、距離和扭轉勢能、經驗能量函數等，利用這些能量函數和勢能可以預測蛋白質的穩定性［31］。目前被廣泛使用的基于結構預測蛋白質穩定性的軟件主要有CUPSAT［32］、FoldX［33］、I-Mutant2.0、mCSM［34］、PoPMuSiC［35］、Duet［36］、iStable［37］、Eris［38］等。

2.3 相關實例

將模擬結構用于依賴于三維結構的蛋白質穩定性預測軟件來獲得更穩定的蛋白質已經有一些成功的案例。Khan等［39］通過計算機預測了一個和直腸癌相關的nsSNPs突變體（Lys25Arg）的生物學功能和結構意義，他們將該突變體中和直腸癌相關的區域稱為CRAPD，利用i-TASSER服務器［22］模擬了CRAPD的三維結構，并用基于結構的預測軟件PoPMuSiC2.1預測出該點突變（Lys25Arg）降低了CRAPD的穩定性，Khan認為CRAPD的穩定性降低和直腸癌存在一定的聯系。Berliner等［40］開發了一種新的機器學習方法來預測突變對蛋白質穩定性和與其他蛋白質親和力的影響。Mosca等［41］的研究發現，很多人體蛋白結構可以利用PDB數據庫中的同源蛋白的結構為模板從而被大范圍地模擬，即使在模板與目的序列的一致性很低的情況下也可以模擬，所以Berliner等為了在整個蛋白質組水平進行預測，采取了同源模建方式模擬了人體蛋白質的三維結構，發現基于這些模擬結構可以預測蛋白質穩定性以及該蛋白與其他蛋白質的親和力，雖然基于模擬結構的預測準確率略低于基于實驗結構預測的準確率，但是作者認為通過提高模擬技術和優化模擬結構可以進一步提高準確率。一些蛋白質結構評估軟件如ProSa［42］和VADAR［43］等，常常被學者們［39，44］用來評估模擬出來的結構是否可靠。

2.4 可行性分析

就目前的蛋白質結構模擬過程來說，在模擬過程中難免引入結構上的偏差，那么這些結構上的偏差對蛋白質穩定性預測會造成什么樣的影響，以及低質量的模擬結構能否用于蛋白質穩定性的預測呢？Gonnelli等［1］在這方面進行了比較系統的研究，一般來說，在蛋白質同源模建的過程中，被模擬的蛋白質序列與模板的序列一致性越高，那么該模擬結構越可靠，所以作者選取與目的蛋白具有不同序列一致性（20%-100%）的且結構已經解析的蛋白質作為結構模擬的模板（值得注意的是：這些被模擬的蛋白質本身結構也已經解析了），然后用Modeller軟 件（http://salilab.org/modeller/）共模擬出了391個蛋白質結構，并通過計算模擬結構和實驗結構Cα坐標的均方根偏差（rmsd）來衡量模擬結構的質量，在391個模擬結構中，絕大部分模擬結構都有很高的質量（rmsd：1.65?-5.52?），并且這些模擬結構的質量和序列一致性成正相關。最后用這些模擬出來的結構以及利用蛋白質穩定性預測軟件PoPMuSiC2.1來計算氨基酸突變所導致的折疊自由能的改變（ΔΔG），并將這些結果與利用實驗解析結果得出的ΔΔG值進行比較，兩者ΔΔG值的差異為0.01-0.05 kcal/mol，結果表明：利用高質量的模擬結構能夠與利用蛋白質實驗解析結構達到相同的預測準確率，并且即使是利用低質量的模擬結構，預測的表現也沒有明顯地減弱。此外，作者將利用模擬結構的預測表現與基于序列的預測軟件（I-Mutant2.0、Mupro等）的預測結果作比較，結果表明：基于模擬結構的預測結果要好于基于氨基酸序列的預測結果。

常用的蛋白質穩定性預測軟件/服務器總結，見表1。

3 結語

隨著人們對基于氨基酸序列預測蛋白質結構穩定性軟件的逐漸重視和預測方法的不斷優化，目前基于氨基酸序列預測軟件的準確率已經和基于蛋白質結構的預測軟件沒有明顯差距，有些研究者甚至聲稱其開發的基于氨基酸序列的預測軟件具有更好的表現；而基于模擬結構預測蛋白質的穩定性是先通過氨基酸序列模擬出蛋白質的三維結構，然后再將模擬的結構應用于預測蛋白質穩定性的軟件。隨著蛋白質結構模擬技術的不斷發展，模擬結構與蛋白質實際結構的差距正在不斷縮小，而且即使是利用低質量的模擬結構，預測蛋白質穩定性的準確率和利用實驗解析結構的準確率相比也沒有明顯的差異。因此基于模擬結構的預測方法目前已被很多科學家所認可。

利用生物信息學的方法預測氨基酸突變對蛋白質穩定性的影響是當前生物信息學研究的熱點之一，而隨著后基因組時代的到來，已知的蛋白質序列越來越多，但就目前的實驗技術水平來說，解析蛋白質的結構仍舊存在一定的困難，蛋白質結構解析的速度遠遠比不上蛋白質氨基酸序列增加的速度，這將進一步拉大蛋白質序列的數量和蛋白質結構的數量之間的差距，所以基于氨基酸序列來預測氨基酸突變對蛋白質穩定性的影響具有更大的使用范圍和更好的發展前景。

表1 蛋白質穩定性預測軟件/在線服務器

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（責任編輯 狄艷紅）

Research Progress on the Prediction of Protein Stability Based on Amino Acid Sequence and Simulated Structure

YI Hua-Wei TANG Xiao-Feng
（College of Life Sciences，Wuhan University，Wuhan 430072）

Stability is one of the important properties of protein. Protein’s stability is not only demanded in industry，but also the prerequisite for its deriving new functions in protein evolution. Improving the stability of protein，especially protein of unknown structure，is a very challenging task，i.e.，traditional protein modification methods such as directed evolution are time-consuming and laborious，while rational design is difficult to replicate by other researchers. At present，there are many reported predictors for protein stability. However，the majority of these tools require the pre-measurement of three-dimensional structure of protein，which restricts the stability prediction of protein in unknown structure. Recently，a number of tools to predict the effects of mutations on the stability of unknown proteins have been developed using amino acid sequences and simulated structures of proteins，here we introduce the research progress on them，aiming at providing guidance for protein engineering.

protein stability；predictors；amino acid sequence；protein structure simulation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.011

2016-09-20

國家自然科學基金面上項目（31570062）

易華偉，男，碩士，研究方向：微生物生理生化；E-mail：2014202040024@whu.edu.cn

唐曉峰，女，博士，教授，研究方向：微生物生理生化；E-mail：tangxf@whu.edu.cn