西瓜枯萎病拮抗菌Lh-1的鑒定及生物防治效果研究

趙佳黃靜陳哲聶園軍梁宏

（1. 山西省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究中心；2. 山西省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟研究所，太原 030031）

西瓜枯萎病拮抗菌Lh-1的鑒定及生物防治效果研究

趙佳1黃靜1陳哲1聶園軍2梁宏1

（1. 山西省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究中心；2. 山西省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟研究所，太原 030031）

對菌株Lh-1進行鑒定，并對其防治西瓜枯萎病的效果進行評價。通過形態(tài)觀察、生理生化檢測和16S rRNA基因同源性分析鑒定菌株Lh-1，測定其抑菌譜。設計盆栽試驗來評價施用有機肥加Lh-1菌液（T2），施用有機肥（T1）和化肥（CK）3種處理的防治效果。結(jié)果顯示，將Lh-1鑒定為解淀粉芽胞桿菌。該菌對多種植物病原菌都有抑制作用具有廣譜抗菌活性，尤其對西瓜枯萎病有良好的防治效果。盆栽試驗表明添加Lh-1后發(fā)病率僅為17.2%，與對照相比防治效果達到78.5%，植株高度、鮮重和干重指標均為最高；瓜苗中的SOD、POD和CAT 活性顯著提高而MDA含量明顯下降；瓜苗根際的微生物區(qū)系中細菌與放線菌含量上升，真菌特別是尖孢鐮刀菌的數(shù)量下降，瓜苗根際微生物區(qū)系結(jié)構得到明顯改善。解淀粉芽胞桿菌Lh-1能夠防治西瓜枯萎病。

解淀粉芽胞桿菌；西瓜枯萎??；尖孢鐮刀菌；根際微生物區(qū)系

西瓜枯萎病是由西瓜?；图怄哏牭毒‵. oxysporum f. sp. niveum）侵染所引起的土傳性病害［1，2］，在西瓜種植過程中特別是連作條件下會大規(guī)模爆發(fā)，減產(chǎn)甚至絕收的情況時有發(fā)生，是西瓜產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的瓶頸［3，4］。利用農(nóng)藥防治植物病害帶來的污染和殘留問題日益受到重視，而利用功能微生物進行生物防治無污染，無殘留，綠色環(huán)保，是綜合防治植物病害的最有效措施［5-7］。王小慧等［8］篩選到一株類芽胞桿菌將其制成新型生物有機肥，西瓜枯萎病防治率達75%。吳洪生［9］篩選到一株哈茨木霉，將其有機肥（菜子餅發(fā)酵產(chǎn)物）混和處理，進行溫室條件下西瓜枯萎病的防治實驗，防治效果良好。

山西省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究中心微生物研究室經(jīng)多年實驗，從田間分離篩選到一株芽胞桿菌Lh-1。對菌株Lh-1進行了鑒定和抑菌譜檢測。在溫室條件下進行盆栽防治西瓜枯萎病試驗并對各項指標進行檢測評價，以期為菌株Lh-1的進一步推廣應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試拮抗菌株 菌株Lh-1，由山西省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究中心微生物實驗室分離保存。

1.1.2 供試病原菌株 西瓜枯萎病菌由山西省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢測研究所提供；番茄灰霉病菌、草莓灰霉病菌、黃瓜枯萎病菌、大白菜黑腐病菌和辣椒炭疽病菌由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心提供。

1.1.3 供試土壤 試驗所用土壤來自山西省農(nóng)業(yè)科學院東陽基地（山西省晉中市）從未種植西瓜的地塊（上一季種植玉米）。

1.1.4 供試作物 西瓜種子為當?shù)刂髁髌贩N“京欣”，由山西省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究中心西甜瓜研究室提供。

1.1.5 供試培養(yǎng)基、試劑與肥料 PDA 培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基與尖孢鐮刀菌選擇性培養(yǎng)基配方見參考文獻［10］。細菌基因組DNA提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司。有機肥由永濟市天力生物肥料制造有限公司提供（有機質(zhì)＞30%、N 54 g/kg、P2O549 g/kg和K2O 23 g/kg）。

1.2 方法

1.2.1 菌株Lh-1的鑒定 對菌株Lh-1進行形態(tài)觀察及生理生化檢測，參考文獻［11］。

16S rRNA 基因的序列分析：用基因組DNA提取試劑盒提取菌株Lh-1的基因組DNA，以其為模板采用16S rDNA通用引物（24f）AGAGTTTGATCCTGGCTCAG與（1492r）TACGGYTACCTTGTTACGACTT擴增16S rDNA基因片段［12］。PCR反應采用25 μL體系：10×緩沖液2.5 μL；2 μL（25 mmol/L）MgCl2；4 μL（1.25 mmol/L）dNTP；2 μL（100 μmol/L）引物；0.4 μL（5 U/μL）Taq酶；DNA模板1 μL（0.05-1 μg/μL）；去離子水13.1 μL 。PCR擴增條件：94℃預變性3 min；94℃變性1 min；50℃退火1 min； 72℃延伸3min，共30個循環(huán)，72℃延伸5 min。PCR擴增序列由上海生工生物工程有限公司進行測序。將測定得到的16S rDNA的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的相關序列用Clustal X1.8進行比對分析，并利用Mega4.0構建進化樹［13，14］。

1.2.2 菌株Lh-1的抑菌譜測定 選擇西瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌、草莓灰霉病菌、黃瓜枯萎病菌、大白菜黑腐病菌和辣椒炭疽病菌作為指示病原菌，利用平板對峙培養(yǎng)法檢測菌株Lh-1的植物病原菌抑制能力。具體方法：將保藏的植物病原菌進行活化并轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基平板上，用滅菌打孔器（直徑5 mm）在病原菌菌落邊緣打孔，菌片轉(zhuǎn)接至新的PDA培養(yǎng)基平板中央，30℃靜置培養(yǎng)24 h，將菌株Lh-1點接在距離病菌片20 mm處，做4個重復，同時設空白對照（不接種拮抗菌）。28℃靜置培養(yǎng)2 d，觀察拮抗效果，計算抑菌率［15］。

抑菌率（%）=（對照病原菌直徑-對峙拮抗菌的病原菌直徑）/對照病原菌直徑×100%

1.2.3 防治西瓜枯萎病盆栽實驗 西瓜枯萎病菌F. oxysporum f. sp. niveum（FON）孢子懸液制備：將FON接種到PDA培養(yǎng)基平板上，30℃，培養(yǎng)5 d。在平板內(nèi)加入10 mL無菌水，然后收集保存孢子懸液，懸液中FON孢子終濃度為5×106CFU/mL［16］。Lh-1發(fā)酵液制備：向NA液體培養(yǎng)基中接種Lh-1，28℃，200 r/min搖床培養(yǎng)48 h，菌體濃度大于109CFU/mL。

實驗設計：營養(yǎng)缽育苗后移栽盆缽培養(yǎng)，營養(yǎng)缽裝土300 g，盆缽裝土10 kg，盆缽中按1%（V/W）的接菌量向土壤中接入FON孢子懸液（土壤終濃度＞104CFU/g）。設3個試驗組，每組3個小區(qū)，試驗組各小區(qū)隨機分布，每個小區(qū)20個重復：1）對照組（CK），向土壤中施入化肥；2）試驗組1（T1）向土壤中施入有機肥；3）實驗組2（T2）向土壤中施入有機肥，按1%（V/W）的接菌量向土壤中接入Lh-1發(fā)酵液。其中，有機肥按2%（W/W）的施肥量施入，CK中等量添加化肥，不足的部分以尿素、硫酸鉀及過磷酸鈣補足。每個營養(yǎng)缽中播種1粒西瓜種子，待瓜苗長出3-4片真葉后移栽，常規(guī)管理進行盆栽實驗［17］。

1.2.4 評價指標測定 西瓜枯萎病病情的調(diào)查統(tǒng)計：從各小區(qū)出現(xiàn)第一株枯萎病株開始，統(tǒng)計枯萎病的發(fā)病情況，西瓜移栽35 d后，計算發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果。

發(fā)病率= 發(fā)病株數(shù)/總重復株數(shù)×100%

病情指數(shù)計算：0級為整株無癥狀；1級整株無變黃葉片；2級為1-2個葉片萎蔫；3級為全株＞1/3葉片萎蔫；4級為全株＞1/2葉片萎蔫；5級為全株＞3/4葉片萎蔫或死亡［18］。

DSI=Σ（病害等級×該級對應植株數(shù)）/供試植株數(shù)

防治率=（對照組發(fā)病率-處理組發(fā)病率）/對照組發(fā)病率×100%

西瓜植株生物量及生理生化檢測：西瓜移栽35 d后，每個小區(qū)隨機選擇5株瓜苗，測定植株株高、鮮重及干重，其中干重測量方法為：105℃條件下殺青30 min，75℃條件下烘干至衡重。每株采集5片葉片測定超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性及丙二醛（MDA）含量，方法參見文獻［19］。

西瓜植株根際微生物區(qū)系調(diào)查：西瓜移栽35 d后，每個小區(qū)隨機選擇5株瓜苗根際土壤，混勻后4℃保存于自封袋內(nèi)運回。采用梯度稀釋法，分別對樣品中的細菌、放線菌、真菌和尖孢鐮刀菌統(tǒng)計計數(shù)［20］。

2 結(jié)果

2.1 菌株Lh-1的形態(tài)特征及生理生化特性

菌株Lh-1革蘭氏染色呈陽性，菌體為桿狀，有鞭毛，具有運動性，好氧生長，可形成內(nèi)生芽胞，在NA培養(yǎng)基上呈黃褐色不透明菌落，表面褶皺，邊緣不規(guī)則。菌株Lh-1的各項生理生化指標檢測結(jié)果如表1所示。

表1 菌株Lh-1生理生化特性

2.2 菌株Lh-1 16S rDNA序列同源性的鑒定

經(jīng)測序分析菌株Lh-1的16S rDNA的序列長度為1 490 bp。在GenBank數(shù)據(jù)庫中，以16S rDNA序列同源性為基礎構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。如圖所示，菌株Lh-1與解淀粉芽胞桿菌聚為一群，具有99%的相似性，綜合形態(tài)特征與生理生化特性分析，將菌株Lh-1鑒定為解淀粉芽胞桿菌。

2.3 菌株Lh-1的抑菌譜測定

利用平板對峙培養(yǎng)法檢測菌株Lh-1的植物病原菌抑制能力。結(jié)果（表2，圖2）顯示，解淀粉芽胞桿菌Lh-1對西瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌、草莓灰霉病菌、黃瓜枯萎病菌、大白菜黑腐病菌和辣椒炭疽病菌均具有抑制作用，說明解淀粉芽胞桿菌Lh-1具有廣譜抗菌性能。

圖1 基于16S rDNA部分序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

表2 解淀粉芽胞桿菌Lh-1的抑菌譜檢測結(jié)果

圖2 解淀粉芽胞桿菌Lh-1拮抗西瓜枯萎病菌

2.4 解淀粉芽胞桿菌Lh-1對西瓜枯萎病的防治效果

盆栽試驗中，不同處理對西瓜枯萎病的防治情況如圖3所示。統(tǒng)計不同處理中西瓜枯萎病的發(fā)病率與病情指數(shù)可知（表4），與對照CK相比施加有機肥后瓜苗發(fā)病率（78.5%）沒有顯著降低，病情指數(shù)與CK相當；而添加Lh-1的T2與CK相比瓜苗發(fā)病率僅為17.2%，病情指數(shù)下降3.6，防治效果高達78.5%。T2實驗組能顯著降低西瓜枯萎病的發(fā)病率，防治效果突出。

圖3 不同處理對西瓜枯萎病的防治效果

表4 不同處理防治西瓜枯萎病效果

2.5 不同處理對瓜苗生物量的影響

不同處理對瓜苗生物量的影響顯著（表5）。由表可知，T2（添加Lh-1）的生長情況最好，植株高度、鮮重和干重指標均顯著高于CK；有機肥處理（T1）次之，但是除株高指標外植株鮮重與干重與CK相比差別不大；而T2處理的各項指標均顯著高于T1。

表5 不同處理對西瓜生長的影響

2.6 不同處理對瓜苗抗性相關酶的影響

盆栽結(jié)果顯示（表6），不同處理間瓜苗抗性相關酶的差異顯著。其中，SOD、POD和CAT 活性以T2最高，T1次之，CK最低；MDA含量以CK最高，T1與CK相比差別不大，T2明顯低于CK。 2.7 不同處理對瓜苗根際微生物區(qū)系的影響

盆栽試驗結(jié)果顯示（表7），瓜苗移栽35 d后，T1與T2根際的細菌與放線菌數(shù)量與對照相比都有顯著提高，其中T1最高，T2次之；T2根際的真菌數(shù)量尤其是尖孢鐮刀菌數(shù)量明顯少于T1與CK，而T1與CK相比，差別不大。結(jié)果說明，與對照相比添加Lh-1顯著改變了瓜苗根際的微生物區(qū)系組成，抑制了病原菌尖孢鐮刀菌的生長。

3 討論

根際-土壤中生命活動最為活躍的關鍵區(qū)域，是“土壤-植物”生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)和能量交換的界面，而根際微生物的活動是“土壤-植物”物質(zhì)和能量循環(huán)的重要介質(zhì)［21］。西瓜枯萎病的爆發(fā)，正是由于尖孢鐮刀菌激增導致根際微生物區(qū)系結(jié)構失衡引起的。當根際微生態(tài)區(qū)系結(jié)構越合理，物種越豐富，多樣性越高時，植株抵御病害侵染的綜合能力就越強［22］。向根際中添加功能微生物可在一定程度上改善微生物區(qū)系結(jié)構，增加有益微生物，抑制病原微生物，提高微生物群落多樣性，提高植物的抗病能力。

表6 不同處理對西瓜葉片SOD、POD、CAT 活性及MDA 含量的影響

表7 不同處理對西瓜根際土微生物數(shù)量的影響

本課題組經(jīng)多年試驗篩選到一株對西瓜枯萎病菌具有強烈抑制作用的菌株Lh-1（抑菌率65.25%），經(jīng)鑒定為解淀粉芽胞桿菌，其在pH5-9，溫度15-50℃的范圍內(nèi)均能生長對環(huán)境要求不嚴苛。該菌對西瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌、草莓灰霉病菌、黃瓜枯萎病菌、大白菜黑腐病菌和辣椒炭疽病菌等多種植物病原菌均有拮抗作用，具有廣譜抗菌活性。作為一種拮抗功能菌，解淀粉芽胞桿菌可以保護植株免受多種病原菌的侵染。張亮等［23］分離到一株解淀粉芽孢桿菌SR22，該菌具有桿菌溶素基因（bacA）和脂肽基因（srfAA）能有效拮抗番茄枯萎病。Jiang等［24］得到一株解淀粉芽胞桿菌，對細菌性果斑病有顯著防治效果。

解淀粉芽胞桿菌Lh-1對西瓜枯萎病的防治效果顯著。盆栽實驗中，添加Lh-1后發(fā)病率僅為17.2%，與對照相比防治效果達到78.5%。解淀粉芽胞桿菌Lh-1對瓜苗的促生作用明顯，T2的植株高度、鮮重和干重指標均為最高；許多文獻報道有機肥對西瓜等作物也有一定的促生作用［25，26］，但在本實驗中，由于添加有機肥后T1的發(fā)病率（78.5%）和病情指數(shù)（4.5）與CK相比沒有明顯差異，發(fā)病情況較為嚴重導致在植株高度、鮮重和干重指標上T1與CK沒有顯著差異。添加Lh-1后瓜苗中的SOD、POD和CAT 活性顯著提高而MDA含量明顯下降，說明瓜苗的抗逆能力顯著增強。韋巧婕等［10］通過盆栽實驗也證明，施用芽孢桿菌B顯著提高黃瓜植株的生物量及其體內(nèi)SOD、POD 及CAT 的活性，植株系統(tǒng)抗性明顯提高。通過分析瓜苗根際的微生物區(qū)系可知，當西瓜枯萎病爆發(fā)時，根際微生物區(qū)系中的真菌尤其是尖孢鐮刀菌顯著增加而細菌含量明顯下降（表7），根際微生物區(qū)系由“細菌型”向 “真菌型”轉(zhuǎn)變［27］；而添加Lh-1后細菌與放線菌含量上升，有效抑制了尖孢鐮刀菌的數(shù)量，瓜苗根際微生物區(qū)系結(jié)構得到明顯改善，植株抗病能力進一步增強。Shen等［28］通過分析連續(xù)2年種植香蕉的根際土壤微生物區(qū)系結(jié)構也得到相同結(jié)果。

4 結(jié)論

本研究對菌株Lh-1進行鑒定、測定了抑菌譜，并通過盆栽試驗對其防治西瓜枯萎病的效果進行評價。結(jié)果表明添加Lh-1后發(fā)病率僅為17.2%，與對照相比防治效果達到78.5%，植株高度、鮮重和干重指標均為最高；瓜苗中的SOD、POD和CAT 活性顯著提高而MDA含量明顯下降；瓜苗根際的微生物區(qū)系中細菌與放線菌含量上升，真菌特別是尖孢鐮刀菌的數(shù)量下降，瓜苗根際微生物區(qū)系結(jié)構得到明顯改善。菌株Lh-1能夠有效防治西瓜枯萎病。

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（責任編輯 狄艷紅）

Identification and Biological Efficacy of Antagonistic Strain Lh-1 Suppress Watermelon Fusarium Wilt

ZHAO Jia1HUANG Jing1CHEN Zhe1NIE Yuan-jun2LIANG Hong1
（1.Biotechnology Research Center，Shanxi Provincial Academy of Agricultural Sciences；2. Institute of Agricultural Resource and Economic，Shanxi Provincial Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031）

Aims：Identify the strain Lh-1 and evaluate its capability to suppress watermelon Fusarium wilt. Methods：Test the morphological，physiological and 16S rRNA gene sequence characteristics of strain Lh-1. Detect its antagonistic spectrum. A pot experiment was designed to evaluate the effects of applying strain Lh-1 combined with organic fertilizer（T2），compared with an organic fertilizer（T1）and a chemical fertilizer（CK）. Results：the strain Lh-1 was identified as Bacillus amyloliquefaciens. It can suppress a variety of plant pathogens with a broad-spectrum antimicrobial activity，especially for F. oxysporum f. sp. niveum. Pot experiment showed that the disease incidence is only 17.2%，the control efficacy reached 78.5%，the SOD，POD and CAT activity increased significantly and the MDA content reduced obviously. The number of bacteria and actinomycetes increased but the number of fungi，especially Fusarium oxysporum decreased obviously in the rhizosphere microflora after Lh-1 treated. Conclusion：the application of the Bacillus amyloliquefaciens Lh-1 can suppressed watermelon Fusarium wilt.

B. Amyloliquefaciens；watermelon Fusarium wilt；F. Oxysporum；rhizosphere microflora

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.016

2016-09-21

山西省科技自主創(chuàng)新能力提升項目（2015zzcx-22），山西省農(nóng)業(yè)科學院科技攻關項目（YGG1414）

趙佳，男，碩士，助理研究員，研究方向：微生物學；E-mail：zhaojia.00@163.com

梁宏，男，副研究員，研究方向：微生物學；E-mail：815336057@qq.com