煙草花葉病毒遼寧分離物Northern雜交檢測體系的建立

李艷麗 安夢楠 王冠中 吳元華

（沈陽農業大學植物保護學院，沈陽 110161）

煙草花葉病毒遼寧分離物Northern雜交檢測體系的建立

李艷麗 安夢楠 王冠中 吳元華

（沈陽農業大學植物保護學院，沈陽 110161）

為了建立煙草花葉病毒遼寧分離物（TMV-LN）的高特異性、高靈敏度的分子雜交檢測體系，從粗提純的TMV-LN粒子中提取RNA，設計特異性引物通過RT-PCR擴增TMV-LN的CP和3'端非翻譯區域，將片段連至pUC119載體獲得重組質粒pUCTMV-PP，體外轉錄獲得地高辛（DIG）標記的TMV-LN正義鏈RNA雜交檢測探針，同時構建DNA檢測探針作為對照。采用點印跡（Dot-blot）雜交和Northern雜交對比RNA探針和DNA探針對TMV-LN的檢測特異性和靈敏性。檢測結果表明，RNA探針和DNA探針在點印記雜交和Northern雜交中均表現出良好的檢測特異性，RNA探針在檢測靈敏度方面要略好于DNA探針，且點印跡雜交體系在病毒定性方面較為快捷，Northern雜交體系在病毒基因組RNA的定量方面具有明顯優勢。

煙草花葉病毒遼寧分離物；RNA探針；DNA探針；點印跡雜交；Northern雜交

煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）世界各地均有分布，可侵染茄科、葫蘆科、十字花科等300余種植物并引起嚴重危害，TMV的早期檢測對于病害的控制十分重要。TMV是人類最早發現的植物正義單鏈RNA病毒，全基因組大小約為6.4 kb，編碼至少4種蛋白質，分別為由基因組RNA編碼的126 kD、183 kD復制相關蛋白質，以及由亞基因組RNA編碼的30 kD運動相關蛋白（MP）和17.5 kD外殼蛋白（CP）［1，2］。

TMV的檢測手段主要包括酶聯免疫吸附測定（ELISA）、反轉錄PCR（RT-PCR）以及分子雜交等技術［3，4］。Northern雜交可分別檢測病毒基因組RNA（gRNA）、亞基因組RNA（sgRNA）以及defective interfering（DI）RNA以及其他病毒由來的RNA片段的積累量和完整度［5-8］。

在植物病毒的檢測方面，Northern雜交相比ELISA在特異性方面要高很多，在對病毒進行相對定量方面更為準確，在檢測中Northern雜交所使用的探針構建比ELISA所需檢測抗體的制備要方便；Northern 雜交相比RT-PCR技術，可檢測出序列同源性很高（＞90%）但歸為不同株系的病毒，相比之下，RT-PCR法檢測病毒對擴增引物的配對準確性要求極高，對于恰好在設計擴增引物序列中發生堿基突變的病毒可能無法檢測，且容易擴增出非病毒由來條帶，影響對試驗結果的判斷。因此Northern雜交在病毒的特異性檢測方面相比ELISA和RT-PCR具有優勢［9，10］。特異性探針的制備對于病毒Northern雜交檢測具有決定性的作用，隨著科技的進步以及人們對健康的重視，在探針制備方面地高辛（DIG）已經逐步代替了同位素，且研究表明，DIG標記RNA探針與32P標記的放射性探針在馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的檢測靈敏度方面無明顯差別，RNA探針相比DNA探針在檢測靈敏度方面要高出2-30倍［11，12］，同時，RNA探針可分別檢測正義鏈和負義鏈的積累量，DNA探針由于是雙鏈結構，可同時檢測出病毒正、負義鏈RNA，由于長度相同無法分別研究正、負義鏈RNA的積累。因此，采用RNA探針的Northern雜交更適合于對病毒復制過程的分子研究［13］。

本研究構建出TMV-LN的RNA檢測探針和DNA檢測探針，建立TMV-LN的點印記雜交和Northern雜交檢測體系，旨在為TMV早期檢測、防治及深入的復制機理的研究提供可靠的研究方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要實驗材料 TMV-LN毒源由沈陽農業大學煙草研究所提供；M-MuLV First Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒購自上海生工生物技術有限公司；PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase、載體pUC119、內切酶KpnⅠ和PstⅠ均購自Takara Bio Inc.（大連寶生物工程有限公司）；Trizon Reagent購自康為世紀生物科技有限公司；Dig Northern Start Kit、Dig High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit II購自德國羅氏生物試劑有限公司；尼龍膜為美國GE公司產品；CDP-Star Reagent為美國NEB公司產品；其他均為國產或進口分析純。

1.1.2 引物設計 從GenBank獲取TMV基因組全長序列（GenBank ID：NC_001367），設計特異性引物并由生工生物工程（上海）股份有限公司（以下簡稱上海生工）合成（表1）。

表1 擴增目的片段所需引物列表

1.2 方法

1.2.1 TMV-LN病毒粒子以及核酸RNA的提取 根據Gooding等［14］及Chapman［15］的方法，將20 g TMV-LN感病煙草葉片（品種為云煙87）加入30 mL PBS緩沖液充分研磨，每10 mL濾液加入0.8 mL正丁醇，數次顛倒室溫培育15 min；于12℃10 000× g離心30 min，加入PEG6000至終濃度為4%，顛倒混勻后于冰上放置15 min；4℃，10 000× g離心15 min后保留沉淀，用8 mL 10 mmol/L磷酸緩沖液使之重新懸浮，加入1.7 mL 5mol/L NaCl和2.42 mL 20% PEG后混勻，冰上保存15 min；4℃10 000× g離心15 min，棄上清，用1 mL 10 mmol/L磷酸緩沖液使沉淀懸浮，得到病毒粗提液。

取上述病毒粗提液，加入等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），劇烈震蕩后4℃，16 200× g離心5 min，取上層水相至新離心管，重復上述操作后取出水相進行乙醇沉淀，干燥后用無RNase 水溶解。

1.2.2 TMV-LN RNA檢測探針的制備 按照M-MuLV First Strand cDNA Synthesis Kit說明書方法可得到cDNA，通過特異性引物TMVPP+和TMVPP-進行PCR反應，反應為25 μL體系：5×PrimeSTAR GXL Buffer 5 μL；dNTP Mixture 2 μL；TMVPP+、TMVPP-（2.5 mmol/L）各2 μL；模板cDNA 1 μL；DNA polymerase 0.5 μL；超純水補足至25 μL。反應條件：94℃預變性2 min；98℃變性10 s，55℃退火15 s，68℃延伸4 min，循環30次。上述PCR產物經純化后，與pUC119質粒載體同時進行Pst I和Kpn I雙酶切，用DNA Ligation Kit Ver.2.1（TaKaRa）16℃連接4 h，熱激法導入DH5α感受態細胞，培養后采用菌落PCR篩選陽性克隆，送至測序（上海生工公司）并確定表達載體pUCTMV-PP構建成功。以pUCTMVPP為模板通過TMVPP+和TMVPP-進行PCR擴增后，采用Dig Northern Start Kit（Roche）體外轉錄制備DIG標記的RNA探針，保存于-80℃。

1.2.3 TMV-LN DNA檢測探針的制備 以pUCTMVPP為模板采用TMVCP+、TMVCP-擴增后的PCR產物經純化后作為模板DNA，按Dig High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II說明書制備DNA探針：1 μg模板DNA，用滅菌雙蒸水補足體系至16 μL；沸水浴10 min以充分變性DNA，之后迅速插入冰水混合物中；取4 μL DIG-High Prime至變性DNA，混勻并離心；37℃孵育5 h按Dig High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II（Roche）說明書；反應結束后，加入2 μL 0.2 mol/L EDTA（pH8.0）終止反應。用無菌雙蒸水補足體系至100 μL，分裝保存于-20℃。

1.2.4 點印跡雜交檢測和Northern雜交檢測 待測樣品RNA為Trizon Reagent從感染TMV-LN的煙草、感染辣椒輕斑駁病毒（Pepper mild mottle virus，PMMoV）的辣椒及健康煙草中分別提取的TMV、PMMoV及陰性對照的RNA，采用虹吸法對樣品進行Northern雜交［16］及Dot-blot［17］檢測：將RNA固體樣品用上樣緩沖液溶解，65℃金屬浴變性10 min，由2%的甲醛凝膠電泳分離后，甲醛凝膠中的RNA由虹吸法轉移到尼龍膜上，室溫過夜，取出尼龍膜于120℃干熱箱中處理1 h后，按照Dig Northern Start Kit、Dig High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit II說明進行雜交和免疫反應，之后于膜上滴2-3滴CDP-Star Reagent使膜潤濕，由Bio-Rad ChemiDoc XRS+化學發光成像系統（美國伯樂）曝光30 s觀察結果。省略甲醛凝膠電泳與轉膜步驟。

2 結果

2.1 TMV及其RNA的提純

為了減少外源RNA對試驗結果的影響，本研究將從提純的TMV粒子中提取TMV-LN的核酸RNA。通過紫外分光光度計Nano drop1000測得TMV-LN病毒粒子濃度為22.42 mg/mL，A260nm和A280nm兩個波長吸光度比值為1.21，本研究提取的TMV核酸RNA純度符合要求。除去外殼蛋白，純化RNA后通過TBE瓊脂糖凝膠電泳后，一條長度約為6 400 bp的條帶且清晰可見（圖2），符合反轉錄要求。

圖1 提純TMV的紫外吸收光譜

2.2 RNA及DNA探針的制備

將提取的TMV-LN核酸RNA進行反轉錄，以cDNA為模板采用TMVPP+和TMVPP-進行 PCR擴增，經TAE瓊脂糖凝膠電泳后得到的結果清晰明亮且單一（圖3），與718 bp的預期擴增長度一致。

圖2 TMV RNA 電泳圖

圖3 PCR產物電泳圖

將目的片段連接pUC119構建T7體外表達pUCTMV-PP，對質粒進行酶切結果（圖4）表明，Pst I酶切后呈單一條帶且長度與3 845 bp的預期長度相符，將測序結果與GenBank中TMV遼寧鳳城分離物（GenBank：HE818420.1）序列相似度為98%。為了獲取大量T7轉錄的DNA模板，提高RNA探針轉錄效率，本實驗以pUCTMV-PP為模板使用引物TMVPP+、TMVPP-進行PCR擴增，條帶清晰且單一，產物經純化后進行RNA探針的轉錄。轉錄產物經TBE電泳可同時檢測到模板DNA和轉錄產物兩條條帶（圖5）。

圖4 酶切后目標質粒電泳圖

圖5 RNA探針制備結果

在TMV-LN的DNA探針的構建方面，由于所得DNA探針長度與模板DNA相同，因此通過電泳凝膠電泳無法驗出新和成的DNA鏈，本研究通過后續雜交試驗檢測判斷DNA探針制備是否成功。

2.3 基于RNA探針的點印記雜交和Northern雜交檢測

為了檢測構建的RNA探針的檢測特異性和靈敏性，本研究提取TMV-LN感病煙草葉片和同為煙草花葉病毒屬的 PMMoV感病辣椒葉片總RNA，將上述待測樣品做梯度稀釋并分別進行點印記雜交和Northern雜交檢測。核糖體RNA（rRNA）的TBE電泳結果作為對照。

點印跡雜交檢測結果（圖6-A）顯示，TMV-LN感病樣品所提取的RNA顯陽性，PMMoV感病樣品無檢測信號，TMV-LN 感病樣品稀釋至1%后仍能檢測到信號。Northern雜交檢測結果（圖7-A，泳道2）顯示，TMV-LN 感病樣品所提取的RNA顯陽性，能同時檢測到基因組RNA（gRNA）和亞基因組RNA（sgRNA）兩條條帶。在同樣品稀釋到1%后仍能微弱檢測到gRNA的信號（圖7-A，泳道4），且PMMoV感病樣品無檢測信號。綜上結果，本實驗構建的RNA探針具有良好的檢測特異性和靈敏性。

2.4 基于DNA探針的點印記雜交和Northern雜交檢測

本研究制備TMV-LN的DNA檢測探針作為對照對比其與RNA探針在病毒檢測特異性和敏感性方面是否存在差異，采用TMV-LN和 PMMoV的樣品進行梯度稀釋并分別進行基于DNA探針的點印記雜交和Northern雜交檢測。

點印跡雜交檢測結果（圖6-B）顯示，TMVLN 感病樣品所提取的RNA顯陽性，PMMoV感病樣品無檢測信號，TMV-LN 感病樣品稀釋至10%后能檢測到信號，稀釋至1%無法檢測到陽性信號。Northern雜交檢測結果（圖7-B，泳道2）顯示，DNA探針可同時檢測到TMV-LN的gRNA和sgRNA的條帶。檢測靈敏度方面與點印記雜交結果基本相符。

圖6 RNA探針（A）和DNA探針（B）點印跡雜交檢測結果

3 討論

TMV寄主范圍廣泛，對農業生產造成持續的危害，TMV的精確分子檢測對于病害的控制以及減少損失具有重要意義。分子雜交技術在植物病毒的檢測和鑒定研究中發揮重要作用［3-6］。本研究所采用的Northern雜交檢測體系靈敏度較高、特異性強，既可以定性分析，又可以定量分析，并可以獲得片段大小及完整度等相關信息。

圖7 RNA探針（A）和DNA探針（B）Northern雜交檢測結果

本研究構建了非放射性DIG標記的TMV-LN正義鏈RNA探針以及DNA檢測探針，采用點印記雜交和Northern雜交分別對TMV-LN感病樣品進行了檢測。結果表明，構建出的RNA探針和DNA探針都可以對感病煙葉中的TMV進行檢測，根據PMMoV感病樣品無陽性檢測信號的結果，判斷上述兩種探針具備良好的檢測特異性，且RNA探針靈敏度要明顯高于DNA探針，其主要原因在于RNA和RNA的雜交結合強度比DNA和RNA雜交高［11］。此外，RNA探針可分別檢測正義鏈和負義鏈的積累量［11］，DNA探針由于是雙鏈結構，可同時檢測出病毒正、負義鏈RNA，由于長度相同無法分別研究正、負義鏈RNA的積累。因此，采用RNA探針的Northern雜交更適合于對病毒復制過程的分子研究［18］。對比點印記雜交和Northern雜交體系：兩種雜交檢測體系在檢測TMV-LN的靈敏度方面沒有明顯差別，點印記雜交體系的優點在于可同時對大量病毒樣品進行定性，且耗時較短，缺點在于對病毒核酸定量方面不夠準確［19］；Northern雜交檢測體系通過凝膠電泳再轉膜雜交，優點是可對病毒的gRNA以及sgRNA等進行分別定量檢測，同時可判斷核酸是否發生降解［3-5］，缺點是整個檢測過程耗時相對較長。

4 結論

本研究所建立的基于RNA探針和DNA探針的點印跡雜交和Northern雜交檢測體系可以應用在TMV-LN較高靈敏度的定性以及定量檢測，RNA探針的檢測靈敏性要好于DNA探針。點印跡雜交檢測體系為TMV-LN的快速、大量的檢測提供了快捷方法；Northern雜交檢測體系為TMV-LN分子致病機理，以及抗病毒藥劑對病毒作用機制等詳細的分子研究提供了有效、可靠的實驗方法以及研究體系。

［1］ Scholthof KB. Tobacco mosaic virus：a model system for plant biology［J］. Phytopathology, 2004, 42（42）：13-34.

［2］ Chujo T, Ishibashi K, Miyashita S, et al. Functions of the 5'-and 3'-untranslated regions of tobamovirus RNA［J］. Virus Research, 2015, 206：82-89.

［3］ López MM, Llop P, Olmos A, et al. Are molecular tools solving the challenges posed by detection of plant pathogenic bacteria and viruses？［J］. Curr Issues Mol Biol, 2009, 11（1）：13-46.

［4］ Webster CG, Wylie SJ, Jones MGK. Diagnosis of plant viral pathogens［J］. Current Science, 2004, 86（12）：1604-1607.

［5］ 許清孝. 煙草花葉病毒的檢測方法研究進展［J］. 現代農業科技, 2013（11）：128-129.

［6］ 劉崇, 高穎, 楊洪一. 辣椒輕斑駁病毒的分子雜交檢測［J］.湖南農業大學學報：自然科學版, 2015, 41（4）：360-363.

［7］ Iwakawa HO, Mizumoto H, Nagano H, et al. A viral noncoding RNA generated by cis-element-mediated protection against 5'-3' RNA decay represses both cap-independent and cap-dependent translation［J］. Journal of Virology, 2008, 82（20）：10162-74.

［8］ Panavas T, Nagy PD. Mechanism of stimulation of plus-strand synthesis by an RNA replication enhancer in a tombusvirus［J］. Journal of Virology, 2005, 79（15）：9777-9785.

［9］ 申煌煊, 李剛. 分子生物學實驗方法與技巧［M］. 廣州：中山大學出版社, 2010.

［10］ Aboul-Ata AAE, Vitti A, Nuzzaci M, et al. Plant-based vaccines：Novel and low-cost possible route for Mediterranean innovative vaccination strategies［J］. Adv Virus Res, 2014, 89：1-37.

［11］Welnicki M, Hiruki C. Highly sensitive digoxigenin-labelled DNA probe for the detection of potato spindle tuber viroid［J］. Journal of Virological Methods, 1992, 39（1-2）：91-99.

［12］Singh RP, Boucher A, Lakshman DK, et al. Multimeric nonradioactive cRNA probes improve detection of potato spindle tuber viroid（PSTVd）［J］. J Virol Methods, 1994, 49（2）：221-33.

［13］李尉民. 南方菜豆花葉病毒（SBMV）兩典型株系特異 cDNA和 RNA 探針的制備［J］. 植物病理學報, 1998, 28（3）：243-248.

［14］Gooding Jr GV, Hebert TT. A simple technique for purification of Tobacco mosaic virus in large quantities［J］. Phytopathology, 1967, 57（11）：1285-1285.

［15］Chapman SN. Construction of infectious clones for RNA viruses：TMV［J］. Methods Mol Biol, 2008, 451：477-490.

［16］Pall GS, Hamilton AJ. Improved Northern blot method for enhanced detection of small RNA［J］. Nature Protocols, 2008, 3（6）：1077-84.

［17］Liu Y, Sun B, Wang X, et al. Three digoxigenin-labeled cDNA probes for specific detection of the natural population of Barley yellow dwarf viruses in China by dot-blot hybridization［J］. Journal of Virological Methods, 2007, 145（1）：22-29.

［18］Minutillo SA, Mascia T, Gallitelli D. A DNA probe mix for the multiplex detection of Ten artichoke viruses［J］. European Journal of Plant Pathology, 2012, 134（3）：459-465.

［19］杜國英, 王錫鋒, 周廣和. 地高辛標記的cDNA探針檢測煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒及馬鈴薯Y病毒［J］. 植物病理學報, 2004, 34（1）：75-79.

（責任編輯 李楠）

The Establishment of Northern Blot Hybridization Detection System for Tobacco Mosaic Virus Liaoning Isolate

LI Yan-li AN Meng-nan WANG Guan-zhong WU Yuan-hua
（College of Plant Protection，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110161）

In order to establish a more sensitive and specific molecular hybridization detection system of Tobacco mosaic virus Liaoning isolate（TMV-LN），total viral RNA was extracted from purified TMV-LN viral particles and amplified by reverse-transcript PCR. The PCR products were ligated into pUC119 vector to construct pUCTMV-PP that express RNA detection probe using Digoxigenin（DIG）Northern Starter Kit. DNA probe was also constructed using DIG DNA hybridization kit. Dot-blot hybridization and Northern blot hybridization analysis were performed to study the specificity and sensitivity of the RNA probe and DNA probe constructed above. Both of the probes showed high specificity and sensitivity in TMV-LN detection through Dot-blot hybridization and Northern blot hybridization detection system. Comparison of two hybridization systems，Dot-blot hybridization system is suitable for virus qualitative detection，whereas，Northern blot hybridization has its advantage in relative quantification of viral genome RNA.

TMV Liaoning isolate；RNA probe；DNA probe；Dot-blot hybridization；Northern blot hybridization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.017

2016-12-09

國家自然科學基金項目（31401710），國家煙草專賣局科技項目［110201601024（LS-04）］

李艷麗，女，碩士研究生，研究方向：植物病毒學；E-mail：duffin@163.com

安夢楠，男，博士，講師，研究方向：分子植物病毒學，E-mail：anmengnan@syau.edu.cn吳元華，男，博士，博士生導師，研究方向：植物病毒學，E-mail：wuyh7799@163.com