保護酶PPO在木薯種質抗螨中的功能初步研究

梁曉盧芙萍盧輝伍春玲曹憲紅陳青

（1. 中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所 農業部熱帶作物有害生物綜合治理重點實驗室 海南省熱帶作物病蟲害生物防治工程技術研究中心 海南省熱帶農業有害生物監測與控制重點實驗室，海口 571101；2. 海南大學環境與植物保護學院，海口 570228）

保護酶PPO在木薯種質抗螨中的功能初步研究

梁曉1盧芙萍1盧輝1伍春玲1曹憲紅2陳青1

（1. 中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所 農業部熱帶作物有害生物綜合治理重點實驗室 海南省熱帶作物病蟲害生物防治工程技術研究中心 海南省熱帶農業有害生物監測與控制重點實驗室，海口 571101；2. 海南大學環境與植物保護學院，海口 570228）

目前尚不了解保護酶PPO（polyphenol oxidase）在木薯種質抗螨中的作用，為證實PPO的抗螨功能，本研究通過定量PCR和酶學試驗手段分析了朱砂葉螨取食抗、感螨木薯種質后，PPO的基因表達量和酶活分別在木薯和朱砂葉螨中的變化情況。結果表明，一方面，朱砂葉螨取食1 d和8 d后，感螨木薯種質BRA900體內MePPO的表達量和PPO總酶活僅分別是為害前的0.99、1.02 倍和1.05、1.03倍，而在抗螨木薯種質C1115體內則分別較為害前提高1.78、1.74倍和1.74、1.72倍，顯著高于感螨木薯水平；另一方面，朱砂葉螨取食感螨種質BRA900 1 d和8 d后，保護酶TcPPO的基因表達量和PPO酶活分別是取食前的0.98、0.97倍和0.98、1.10倍，而取食抗螨木薯種質C1115 1 d和8 d后分別降低至為害前的0.52、0.64倍和0.54、0.57倍，顯著低于取食感螨木薯水平。上述結果初步證實了保護酶PPO在木薯種質抗螨中的功能。

PPO；朱砂葉螨；木薯種質；抗螨功能

木薯（Manihot esculenta Crantz）亦稱樹薯，屬大戟科木薯屬，具有粗生粗長，耐貧瘠、干旱、高產、淀粉含量高等特點［1］，是世界8億人口的主糧和我國熱帶地區重要的工業原料、飼料、生物質能源和救荒作物，是僅次于水稻、玉米、甘蔗、甘薯的第五大作物，因其可在山地、坡地等隨處種植，“不與人爭糧，不與糧爭地”，在熱帶地區農民增收方面發揮著極其重要的作用。近年來木薯在熱區的種植面積不斷增加，并逐漸成為我國熱區農業的支柱產業之一［2］。

朱砂葉螨（Tetranychus cinnabarinus Boisduval）是危害木薯最嚴重的世界危險性害螨，自2005年以來，該螨在廣西、廣東、海南、云南、江西等地嚴重發生與成災，導致當地木薯減產20%-30%，嚴重危害時可造成減產50%-70%［3］，已成為嚴重制約木薯產業可持續發展的主要因子之一。目前，各木薯產區對于朱砂葉螨的防治仍依賴于化學藥劑防治，但朱砂葉螨一般于木薯種植后6-8個月暴發成災，此時的木薯地已封行很難噴施藥劑，同時由于其個體小、繁殖能力強、世代短、發育快等特點，比其他害蟲容易產生抗藥性，在化防過程中因施藥技術落后和藥劑難以靶標所致農藥的有效利用率不足、使用頻率與劑量不斷加大導致“3R”等問題日趨嚴重［4］。因此，尋求新的有效地控制朱砂葉螨的策略和方法成為當前木薯產業發展中亟待解決的重要問題。

當前，培育抗螨木薯是防治朱砂葉螨最經濟、有效、簡便的方法，而抗螨基因的挖掘及其功能研究是采用分子育種手段獲得抗螨木薯的關鍵［5］。害蟲為害寄主作物時，造成的組織創傷會在植物體內產生過量的活性氧自由基，影響其正常生長。而害蟲取食寄主植物時攝入的次生代謝物質同樣會造成蟲體內活性氧的累積，不利于取食為害。多酚氧化酶（Polyphenol oxiclase，PPO）是植物抵御植食性昆蟲取食的重要保護酶，在抵御植食性昆蟲取食中起關鍵作用［6］。例如，蟲害脅迫的茶樹葉片PPO活性增強，對昆蟲及其誘發的一系列病害有防御作用［7，8］。麥長管蚜為害可誘導抗性小麥葉組織中PPO活性顯著升高，而敏感種質中卻無顯著變化［9］。桃蚜為害可誘導甘藍體內PPO活性的升高，且隨桃蚜為害時間的延長而增加。此外，蚜蟲為害可誘導辣椒葉組織內PPO活性顯著增強，其酶活性增強及與其同工酶譜的穩定性與辣椒抗蚜性顯著相關［10］。然而迄今為止，研究者對PPO在木薯抗螨中的作用尚不知曉。本研究擬通過測定朱砂葉螨取食抗螨木薯種質C1115和感螨木薯種質BRA900后，保護酶PPO基因表達量和活性在木薯和朱砂葉螨中的變化情況，初步研究其在木薯種質抗螨中的功能，旨為將其作為基因資源應用于抗螨木薯種質創制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試木薯種質 抗螨木薯種質C1115，感螨木薯種質BRA900由中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所國家木薯種質資源圃提供。

1.1.2 供試朱砂葉螨飼養 參考李遷的方法［11］進行朱砂葉螨的室內飼養。朱砂葉螨為中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所農業昆蟲研究室用健康、生長狀況一致的采自田間6個月的面包木薯（感螨品種）葉片連續飼養。飼養條件為：溫度28±2℃，相對濕度75 ± 5%光周期14（光）：10（暗）。

1.1.3 器材 Ultraspec 3000紫外可見光分光光度計（Pharmacia Biotech，Ltd.，Cambridge，UK）、MJ Research PTC-100 PCR儀（MJ Research Inc.）組織勻漿機、高速冷凍離心機、Bio-Rad iCycler & iQ Real-Time PCR系統（Bio-Rad，USA）等。

1.1.4 藥品 配制緩沖液的相關試劑均為國產分析純試劑，緩沖液按照分子克隆實驗指南（第3版）配制。RNA提取及酶活測定相關試劑均購自Sigma公 司（Sigma-Aldrich Company，USA）。Trizol試 劑盒Invitrogen（Invitrogen Inc. USA），DNaseⅠ 試 劑盒，cDNA合成試劑盒，Master mix，MaximaTMSYBR Green qPCR Master Mix試劑盒均為Fermentas公司產品（Fermentas，Glen Burnie，MD）。

1.2 方法

1.2.1 PPO酶液提取及活性測定 測定木薯葉片的PPO酶活時，將50頭朱砂葉螨雌成螨接種于室內種植3個月的木薯頂芽下方的3張葉片上，分別在取食1 d、8 d后將朱砂葉螨從接種葉片上移除。分別取100 mg接種前、為害1 d、8 d后的葉片組織用于酶活分析。測定朱砂葉螨PPO酶活時，將大約200頭朱砂葉螨雌成螨接種于采自田間生長6個月的健康木薯葉片上，并按照1.1.2的方法室內飼養，分別取200頭取食前，取食抗、感木薯葉片1 d、8 d后的成螨用于酶活分析。上述各個木薯或朱砂葉螨處理均設置3個重復。PPO活性測定參照參考Lu［12］的方法。在小試管中依次加入0.02 mol/L鄰苯二酚溶液0.4 mL，0.05 mol/L pH6.8磷酸緩沖液0.4 mL，酶液0.1mL作為測定管；另外取一個小試管，只加前2種溶液，不用加酶液作為對照管。在30℃下反應2 min，398 nm波長下測OD值。由于在本研究中我們著重關注抗、感螨木薯在受朱砂葉螨為害時，PPO酶活提升以清除活性氧的能力是否存在顯著差別，而通過比較為害前后比活力倍數變化的方法更能夠凸顯出這種差異［12］。

1.2.2 保護酶基因PPO表達量的定量PCR測定 木薯葉片和朱砂葉螨的RNA樣品采集方法與酶活分析相同。木薯和朱砂葉螨總RNA的提取參照Trizol RNA提取試劑盒進行。總RNA經gDNA Eraser（TaKaRa Biochemicals，Dalian，China）處理去除基因組DNA后，取1.0 μg用于cDNA的合成。cDNA樣品經nuclear-free 水10倍稀釋后作為熒光定量PCR的模板，分別以木薯和朱砂葉螨各自的actin基因為管家基因，相關基因的引物信息如表1［13］所示。PCR反應條件為：95℃預溫育1 min后，以40個循環完成如下程序：95℃變性15 s，60℃ 退火15 s，72℃ 延伸20 s。根據Pfaffl［14］的2-ΔΔCt方法計算處理前后PPO基因的相對表達量的變化倍數，以反映木薯或朱砂葉螨應對氧化損傷的轉錄水平的差異。1.2.3 數據分析 采用SPSS軟件進行數據分析，顯著性差異分析采用Student’s t-test，所有數據均為3個生物學重復的平均值±標準（x-±s），顯著性檢測水平為P＜0.05。

表1 木薯、朱砂葉螨保護酶基因PPO表達量qPCR測定引物信息

2 結果

2.1 朱砂葉螨為害前后抗、感螨木薯種質葉組織中MePPO基因表達量差異分析

從圖1可以看出，朱砂葉螨為害前后抗、感木薯種質葉組織中MePPO基因表達量變化存在顯著差異。朱砂葉螨取食1 d和8 d后，感螨木薯種質BRA900葉組織中MePPO基因表達量僅分別是為害前的0.99和1.02倍，而抗螨木薯種質C1115葉組織中MePPO的基因表達量分別是為害前的1.78 和1.74倍，表明抗螨木薯種質C1115通過顯著提高保護酶MePPO的轉錄水平啟動活性氧清除機制，從而較感螨種質BRA900具有更強的抗螨害能力。

圖1 朱砂葉螨為害前后抗、感螨木薯保護酶MePPO基因表達量變化

2.2 朱砂葉螨為害前后抗、感螨木薯種質葉組織中PPO酶活力差異分析

從圖2可以看出，朱砂葉螨為害前后抗、感螨木薯種質葉組織中PPO酶活力存在顯著差異。朱砂葉螨取食1 d和8 d后，感螨木薯種質BRA900葉組織中PPO酶活力較為害前提高1.05和1.03倍，而抗螨木薯種質C1115葉組織中PPO酶活力較為害前分別提高1.74和1.72倍，表明木薯葉片中PPO酶活力的變化趨勢與基因水平相一致，抗螨木薯種質C1115通過顯著提高保護酶PPO的活力啟動活性氧清除機制，從而較感螨種質BRA900具有更強的抗螨害能力。

圖2 朱砂葉螨為害前后抗、感木薯保護酶PPO活性變化

2.3 取食抗、感螨木薯種質前后朱砂葉螨體內TcPPO基因表達差異分析

從圖3可以看出，取食抗、感螨木薯種質前后朱砂葉螨體內TcPPO基因表達量變化存在顯著差異。朱砂葉螨取食感螨木薯種質BRA900 1d，8d后體內保護酶TcPPO的表達量分別是取食前的0.98和0.97倍，而取食抗螨木薯種質C1115 1 d，8 d后TcPPO的表達量降低至取食前的0.52和0.64倍。上述結果表明與取食感螨種質BRA900相比，取食抗螨木薯種質C1115后，朱砂葉螨體內的TcPPO表達受到了顯著抑制，不利于其為害抗螨種質C1115。

圖3 取食抗、感木薯種質前后朱砂葉螨體內TcPPO基因表達量變化

2.4 取食抗、感螨木薯種質前后朱砂葉螨體內PPO酶活力差異分析

從圖4可以看出，取食抗、感螨木薯種質前后朱砂葉螨體內PPO酶活力變化存在顯著差異。朱砂葉螨取食感螨木薯種質BRA900 1 d，8 d后體內PPO酶活力分別是為害前的0.98和1.10倍，而取食抗螨木薯種質C1115 1 d，8 d后PPO酶活力降低至為害前的0.54和0.57倍。上述結果表明朱砂葉螨取食抗、感螨木薯種質后酶活的變化趨勢與基因水平一致，取食抗螨種質C1115后PPO酶活力被顯著抑制削弱了朱砂葉螨修復自身氧化損傷能力，不利于其為害抗螨種質C1115。

圖4 取食抗、感木薯種質前后朱砂葉螨體內PPO酶活差異

3 討論

保護酶活性增強能夠有效減輕活性氧導致的細胞氧化損傷［15］。多酚氧化酶PPO作為重要的保護酶，不僅可通過清除活性氧而抵御害蟲對寄主植物的侵害，還可作為次生代謝途徑中的重要酶，調控和影響寄主植物次生代謝物質的產生。例如，PPO能把植物組織中的一些酚類物質氧化成毒性物質［16，17］，從而參與植物防御害蟲的反應，增強植物的抗蟲性。測定分析寄主植物和害蟲互作時PPO基因表達量和酶活力的變化情況將有助于研究PPO在作物抗蟲中的功能。

PPO參與植物的防御反應，其基因表達和活性顯著升高可有效提高植物抗蟲性水平［18-20］。蟲害會誘導植物體內PPO基因的過量表達，例如馬鈴薯和番茄經蟲害誘導后，PPO基因可高水平表達，且可受茉莉酮酸酯（JA）的進一步誘導［18］。Franzen［19］等研究表明，蚜蟲取食抗性小麥15 d后，包括PPO在內的5個氧化酶基因顯著表達，而在敏感小麥種質中卻沒有表達。蟲害同樣會導致PPO酶活性的變化。還有研究表明［7-9］，茶樹、甘藍和小麥體內PPO活性的顯著升高可以形成對茶尺蠖、桃蚜和麥長管蚜的抗性。本研究獲得的結果與前人相似，抗螨木薯種質C1115被朱砂葉螨為害1 d、8 d后，MePPO基因表達量較為害前提高幅度較大，并且顯著高于感螨種質BRA900受害后的變化水平，而為害1 d和8 d的PPO基因表達量或酶活無顯著差異，表明抗螨木薯PPO對螨害的響應快，并且能夠長時間維持在較高水平。以上這些結果表明對于抗螨種質C1115，保護酶PPO能夠有效緩解朱砂葉螨取食后造成的氧化損傷，從而增強其抗蟲性。

害蟲取食寄主植物時，害蟲體內保護酶PPO被抑制也是形成寄主植物抗蟲性的重要因素［21-22］。Krishnan等［21］發現棉貪夜蛾取食番茄后體內PPO的活性顯著高于取食半人工飼料，并推斷抗氧化酶活性增強是形成其對番茄寄主適應性的主要因素。對森林天幕毒蛾和白斑毒蛾的研究發現［22］，寄主植物的單寧酸能夠顯著抑制中腸抗壞血酸PPO的活性從而形成較強的抗蟲能力。本研究中，朱砂葉螨取食抗螨木薯種質C1115 1 d和8 d后，體內PPO的表達量和活性與取食前相比降低幅度較大，并且顯著低于取食感螨木薯種質BRA900的對應水平，而取食1 d和8 d的害螨體內PPO基因表達量或酶活無顯著差異，表明朱砂葉螨取食抗螨木薯后體內PPO受到長時間持續抑制。以上結果說明抗螨木薯抑制了朱砂葉螨PPO修復自身氧化損傷的功能，不利于被朱砂葉螨為害形成適宜寄主；相反，朱砂葉螨取食感螨木薯種質BRA900后，體內PPO的表達量和活性與取食前相比顯著升高，說明朱砂葉螨能夠正常啟動活性氧清除機制以應對攝入的次生代謝物質造成的氧化損傷，從而易于在感螨木薯上為害。

PPO在木薯和朱砂葉螨中均起到清除活性氧減少氧化損傷的作用。抗螨木薯一方面通過提高自身PPO的活性來抵御螨害造成的植株氧化損傷，另一方面朱砂葉螨取食抗螨木薯后自身的PPO受到了顯著抑制，不利于其繼續取食為害。因此，PPO在木薯抗螨中的作用是體現在寄主-害螨兩個層面的，是兩者互作的結果。本研究初步證實保護酶PPO在木薯抗螨中的功能，具有作為有效基因資源應用于抗螨木薯分子育種的應用潛力，但其功能有待進一步研究與驗證。

4 結論

本研究發現受朱砂葉螨為害后，抗螨木薯種質C1115體內MePPO的基因表達量和PPO酶活較感螨木薯種質BRA900顯著提高，而取食抗螨木薯種質C1115后朱砂葉螨體內TcPPO的基因表達量和PPO酶活較取食感螨木薯種質BRA900顯著被抑制。

［1］ Cock JH. Cassava：a basic energy source in the tropics［J］. Science, 1982, 218（4574）：755-762.

［2］ 伍薇, 柯佑鵬. 中國木薯產業發展現狀及前景展望［J］. 中國熱帶農業, 2011, 1（3）：6-9.

［3］ 陳青, 盧芙萍, 黃貴修, 等. 木薯害蟲普查及其安全性評估［J］.熱帶作物學報, 2010, 31（5）：819-827.

［4］ Smith CM. Plant resistance to insects［M］. A fundamental approach：John Wiley and Sons Ltd, 1989.

［5］ Taylor N, Chavarriaga M, Raemakers K, et al. Development and application of transgenic technologies in cassava［J］. Plant Molecular Biology, 2004, 56（4）：671-688.

［6］ Felton GW, Donato KK, Broadway RM, et al. Impact of oxidized plant phenolics on the nutritional quality of dietary protein to a noctuid herbivore, Spodoptera exigua［J］. Journal of Insect Physiology, 1992, 38（4）：277-285.

［7］ Yang ZW, Duan XN, Jin S, et al. Regurgitant derived from the tea geometrid Ectropis obliqua suppresses wound-induced polyphenol oxidases activity in tea plants［J］. Journal of Chemical Ecology, 2013, 39（6）：744-751.

［8］ 王丹, 陳亮. 茶樹對茶尺蠖抗性機制研究［J］. 茶葉科學, 2014, 34（6）：541-547.

［9］ Han Y, Wang Y, Bi JL, et al. Constitutive and induced activities of defense-related enzymes in aphid-resistant and aphid-susceptible cultivars of wheat［J］. Journal of Chemical Ecology, 2009, 35（2）：176-182.

［10］ 陳青, 張銀東. 3 種氧化酶與辣椒抗蚜性的相關性［J］ . 熱帶作物學報, 2004, 25（3）：42-46.

［11］ 李遷, 盧芙萍, 陳青, 等. 木薯種質對朱砂葉螨的抗性評價［J］.熱帶作物學報, 2015, 36（1）：143-151.

［12］ Lu FP, Chen Q, Chen ZS, et al. Effects of heat stress on development, reproduction and activities of protective enzymes in Mononychellus mcgregori［J］. Experimental and AppliedAcarology, 2014, 63（2）：267-284.

［13］ Xu J, Duan X, Yang J, et al. Enhanced reactive oxygen species scavenging by overproduction of superoxide dismutase and catalase delays postharvest physiological deterioration of cassava storage roots［J］. Plant Physiology, 2013, 161（3）：1517-1528.

［14］ Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR［J］. Nucleic Acids Research, 2001, 29（9）：e45-e45.

［15］ Ray PD. Huang BW, Tsuji Y. Reactive oxygen species（ROS）homeostasis and redox regulation in cellular signaling［J］. Cell Signal, 2012, 24（5）：981-990.

［16］ Marco H, Gregg AH. Host plant-specific remodeling of midgut physiology in the generalist insect herbivore Trichoplusia ni［J］. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2014, 50（3）：58-67.

［17］ Juan MA, Bernardus CJ. Schimmel, Joris JG, et al. Spider mites suppress tomato defenses downstream of jasmonate and salicylate independently of hormonal crosstalk［J］. New Phytologist, 2015, 205（2）：828-840.

［18］ Gregg AH and Georg J. Plant immunity to insect herbivores［J］. Annual Review of Plant Biology, 2008, 59（1）：41-66.

［19］ Franzen, LD, Gutsche AR, Heng-Moss T, et al. Physiological and biochemical responses of resistant and susceptible wheat to injury by Russian wheat aphid［J］. Journal of Economic Entomology, 2007, 100（5）：1692-1703.

［20］ 張春妮. 甘藍苗期對桃蚜抗性的生化機制研究［D］. 楊陵：西北農林大學, 2005.

［21］ Krishnan N, Kodrík D. Antioxidant enzymes in Spodoptera littoralis（Boisduval）, are they enhanced to protect gut tissues during oxidative stress［J］. Journal of Insect Physiology, 2006, 52（1）：11-20.

［22］ Barbehenn RV. Gut-based antioxidant enzymes in a polyphagous and a graminivorous grasshopper［J］. Journal of Chemical Ecology, 2002, 28（7）：1329-1347.

（責任編輯 狄艷紅）

Preliminary Study on the Function of Polyphenol Oxidase in Cassava Resistance to Mite

LIANG Xiao1LU Fu-ping1LU Hui1WU Chun-ling1CAO Xian-hong2CHEN Qing1
（1. Environment and Plant Protection Institute，China Academy of Tropical Agricultural Sciences/Laboratory of Pests Comprehensive Governance for Tropical Crops，Ministry of Agriculture/Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests/Hainan Engineering Research Center for Biological Control of Tropical Crops Diseases and Insect Pests，Haikou 571101；2. College of Environment and Plant Protection，Hainan University，Haikou 570228）

So far，the function of polyphenol oxidase（PPO）in cassava resistance to mite has not been understood clearly. In order to validate this function，we used quantitative real-time PCR（qPCR）and enzymatic assay to determine the changes of expression and activities of PPO in either cassava or Tetranychus cinnabarinus after the mite-resistant and mite-susceptible cassava cultivars were damaged by T. cinnabarinus. The results showed that，in one hand，compared to those in the same leaves before damaged，the transcriptions of MePPO and total activities of PPO only increased to 0.99-，1.02-fold and 1.05-，1.03-fold while the mite-susceptible cassava cultivar BRA900 was damaged by T. cinnabarinus for 1 d and 8 d，respectively. However，the corresponding values in 1 d- and 8 d-damaged leaves of mite-resistant cassava C1115 increased to 1.78-，1.74-fold and 1.74-，1.72-fold，respectively，thus significantly higher than those of mite-susceptible cassava. In the other hand，compared with those before feeding，the expressions of TcPPO and activities of PPO in T. cinnabarinus were 0.98-，0.97-fold and 0.98-，1.10-fold，respectively after feeding on BRA900 for 1 d and 8 d；while the corresponding values in T. cinnabarinus feeding on C1115 decreased to 0.52-，0.64-fold and 0.54-，0.57-fold，respectively. This study preliminarily validated the function of PPO in cassava resistance to T. cinnabarinus.

polyphenol oxidase；Tetranychus cinnabarinus；cassava；resistance to mite

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.018

2016-08-21

國家木薯產業技術體系害蟲防控崗位科學家專項（CAR S-12-hncq）（CARS-12-hncq）

梁曉，男，博士，助理研究員，研究方向：生物化學與分子生物學及作物抗蟲性；E-mail：liangxiaozju@126.com

陳青，男，博士，研究員，研究方向：生物化學與分子生物學及作物抗蟲性；E-mail：chqingztq@163.com