外生菌根真菌彩色豆馬勃（Pisolithus tinctorius）輔助植物修復重金屬Cu污染土壤的應用潛力

溫祝桂王杰湯陽澤史良洪立洲沈振國陳亞華

（1. 南京農業大學生命科學學院，南京 210095；2. 江蘇沿海地區農業科學研究所，鹽城 224002；3. 南京農業大學農村土地資源利用與整治國家地方聯合工程研究中心，南京 210095）

外生菌根真菌彩色豆馬勃（Pisolithus tinctorius）輔助植物修復重金屬Cu污染土壤的應用潛力

溫祝桂1，2王杰1，3湯陽澤1，3史良1，3洪立洲2沈振國1，3陳亞華1，3

（1. 南京農業大學生命科學學院，南京 210095；2. 江蘇沿海地區農業科學研究所，鹽城 224002；3. 南京農業大學農村土地資源利用與整治國家地方聯合工程研究中心，南京 210095）

旨在研究Pisolithus tinctorius（Pt）菌種的耐銅性以及對宿主植物黑松（Pinus thunbergii）幼苗生長發育、營養元素以及重金屬Cu吸收的影響，探究其修復重金屬污染土壤的應用潛力。采用液體純培養，0、5、50、100、250和500 μmol/L濃度Cu處理研究Pt菌種耐Cu性；幼苗盆栽實驗（Pt菌根或未菌根化），分析幼苗生長、各部分營養元素及Cu含量。結果顯示，Pt菌種具有很強的耐Cu性，其半抑制濃度達200 μmol/L；與非接菌相比，Pt菌種的侵染可以顯著（F=44.57，P=0.003）促進黑松幼苗的生長，提高宿主幼苗根及莖中P和Ca的含量，緩解Cu毒害；接種后幼苗地上部重金屬濃度雖有所降低，但可通過增加宿主生物量來提高植物對土壤中重金屬的提取效率；接種Pt，可降低土壤中可交換態Cu含量，降低Cu對植物的毒害。耐Cu性的 Pt菌種可以促進宿主幼苗的生長及營養元素的吸收，減少Cu毒害，提高黑松對Cu的提取效率，在Cu污染地的生物修復、植被恢復中具有一定的應用潛力。

彩色豆馬勃；黑松；Cu耐性；提??；植被恢復

隨著全球工農業的快速發展，環境污染問題日益嚴重，其中，重金屬是主要的環境污染物之一。金屬污染物具有隱蔽性、滯留時間長、移動性差、不能被微生物降解等特點，土壤中的有害金屬的污染直接影響土壤質量、水質狀況、作物生長、農產品產量及品質，還能夠通過食物鏈富集到人體和動物中，危害人畜健康，引發人類癌癥和其它疾病等［1，2］。其次，土壤的重金屬污染還間接導致大氣、地表水和地下水污染以及生態系統退化等其它次生生態環境問題。因此，如何有效地防治和解決土壤重金屬污染問題，越來越受到世界各國的重視。目前，重金屬污染土壤的修復方法有很多，主要可分為物理、化學、生物方法。其中傳統的物理、化學治理方法，如排土填埋、稀釋、淋洗、物理分離和電化學等方法，雖效果好、歷史短，但往往存在費用高、能耗大、容易造成二次污染等不足［3，4］，在大規模應用上受到一定的限制［4，5］。近年來，植物、微生物修復方法得到了廣泛的重視，尤其是在植物-微生物聯合修復方面，取得了顯著進展。微生物-植物聯合修復重金屬污染技術是利用與植物共生的真菌、細菌等微生物的聯合作用降解、吸附污染物，以達到修復的目的。

微生物可以用于輔助、強化植物進行土壤重金屬污染修復，主要基于以下兩方面：（1）根際微生物通過代謝活動產生有機酸、氨基酸、酶類以及其它代謝產物，可以有效地溶解重金屬以及含重金屬的礦物，使土壤中呈固態的重金屬活化成為可溶態或交換態，有利于植物的吸收和富集，達到提高植物修復重金屬污染土壤的效率［5］；（2）根際微生物可以合成一些植物激素，如生長素和赤霉素，同時還可以分泌鐵載體，具有溶磷、固氮等作用，能夠有效地促進植物生長［6，7］；有些微生物還可以通過競爭、拮抗作用抑制或是殺死病原微生物，提高植物的抗逆性［8］；其次，還有的細菌具有ACC脫氨酶活性，能夠將乙烯的代謝前體ACC分解，減少植物體內乙烯的含量，從而減輕重金屬對植物根系生長的抑制作用，增強植物對重金屬脅迫的抗性［9，10］?？梢?，微生物輔助植物修復重金屬污染土壤是一條集高效、經濟、環境友好于一體，具有發展前景的生物修復新途徑。

菌根作為微生物與植物共生的一個互惠共利的共生系統，是真菌與植物根部形成的有機結合體，影響著宿主植物營養的吸收和土壤結構，受到了長時間的關注與研究：植物為菌根真菌提供碳源，相應的，真菌為宿主植物提供礦質營養元素、水、以及協助宿主抵御病蟲害等脅迫［11］。外生菌根真菌可以通過協助宿主抵御生物和非生物脅迫［12-15］來輔助宿主植物在逆境下定植、生存。已有研究表明，某些地區進行林業引種失敗的原因與缺少特定的菌根真菌密切相關［16］。菌根真菌在輔助、強化宿主植物在重金屬污染土壤修復方面有著重要的意義［17-19］。其作用機理表現為以下兩個方面：一方面，菌根真菌具有“固持作用”，可以通過將重金屬元素吸附、固定并積累在菌絲體［20］、泡囊［21］、和植物根系［22］等部位來限制重金屬元素向宿主植物運輸［23］；另一方面，菌根可以通過影響宿主植物對重金屬的積累和分配模式，來增加積累量［24］，以達到輔助宿主富集重金屬的目的。但在實際應用中，針對不同的重金屬污染土壤，往往會遇到菌種、宿主選擇的難題：菌種是否具有重金屬耐性、是否可以與宿主植物形成菌根、宿主能否在污染區定植，是植物-微生物聯合修復中亟待解決的問題。

研究發現在重金屬污染土壤中能有效定植的大多數宿主植物普遍與具有重金屬耐性的菌根真菌相伴而生，表明這些真菌在與宿主協同進化的過程中已逐漸形成了對受重金屬脅迫的耐性。本研究針對Cu污染土壤，從生態學和重金屬污染生態修復角度，利用篩選（實驗方法待發表）出的高耐銅性外生菌根真菌（Pisolithus tinctorius，Pt）進行耐重金屬特性的研究，基于其普遍存在、易于培養，同時易形成菌根結構的特點，利用其與黑松幼苗共生形成菌根體系，促進宿主生長的同時，輔助宿主對重金屬Cu的富集，以期為重金屬污染地的改良探索出一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物 黑松（Pinus thunbergii）。

1.1.2 菌種 彩色豆馬勃（Pisolithus tinctorius，Pt）。

1.1.3 MMN培養基 KH2PO40.5 g/L，（NH4）2HPO40.25 g/L，CaCl20.05 g/L，NaCl 0.025 g/L，MgSO4· 7H2O 0.15 g/L，維生素B1（thiamine hydrochloride）100 μg/L，FeCl3·6H2O 0.03 g/L葡萄糖10 g/L，麥芽膏3 g/L，瓊脂14 g/L，pH5.50。121℃，0.1 MPa，滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 Pt菌種耐銅性 菌種擴繁：選取生長旺盛的菌種，在菌落邊緣切取直徑約0.8 cm的菌塊倒置于固體MMN培養基平板中，25℃下暗箱純培養，擴繁。

菌種的重金屬耐性：配置的MMN液體培養基中，添加過濾滅菌（通過0.22 μm超濾膜）的重金屬（CuSO4）溶液，使Cu2+的濃度分別達到0、5、50、100、250和500 μmol/L，分裝于250 mL錐形瓶，每個100 mL，5個重復。擴繁菌落邊緣截取0.8 cm的菌塊置于液體培養基中，25 ℃下暗箱培養。60 d后，通過過濾獲得菌絲體，再用超純水沖洗幾次，確保洗凈表面殘留的金屬離子。將菌絲體置于50℃，72 h烘干，稱量干重。對菌絲體高溫消解，AAS分析金屬Cu含量。

1.2.2 盆栽實驗 幼苗準備：選取飽滿黑松種子，30% H2O2表面滅菌處理15 min，無菌水沖洗干凈播種于裝有經高溫滅菌處理蛭石的育苗籃中，25℃下培養45 d左右備用。菌根化幼苗的準備：選取長勢一致的黑松，剪去主根，預留1 cm左右后與菌塊（取整個培養皿中菌塊）充分接觸（與空白培養基接觸作為未接菌空白對照）種植于土、蛭石、沙的混合培養基質（V∶V∶V=1∶1∶1）中，置于陽光房中培育，自然光照，溫控25℃/20℃（早/晚）。淋澆去離子水，以保持一定的濕度［（65±10）%相對空氣濕度］，培養6個月，獲得成功侵染Pt菌種的菌根化松樹幼苗。

Pt菌根化幼苗盆栽實驗：選取長勢較為一致的Pt侵染（侵染率：90±5%，侵染率=成功侵染Pt菌種的根尖數量/幼苗總的根尖數×100%）的菌根化幼苗和未接菌的幼苗，忽略移栽時幼苗間的差異。將上述幼苗種植于裝有2.5 kg重金屬Cu污染土壤的盆中，每盆3棵，兩種苗各5盆，培植5個月。設置3個不種植苗的空白盆作為空白對照。污染土壤基本理化性質：pH（水提）6.99、電導0.87 ds/m、陽離子交換量50.09 cmol/kg、有機質2.16%，總P 0.52 g/kg，總K 5.29 g/kg、總N 0.64%，總Cu 905.10 mg/kg。上述盆栽置于陽光房中培育，自然光照，溫控25℃/20℃（早/晚），相同方法淋澆去離子水。

1.2.3 樣品收集和處理 小心取出盆中松樹苗，以保證根部的完整性，用抖土的方法收集幼苗根際土壤，同時將松樹幼苗，洗凈并分為根、莖、葉三部分，分裝，70℃，72 h烘干，稱重。粉碎后經瑪瑙研缽研細過60目篩。秤取一定質量的粉碎樣品，高溫消解，分析測定重金屬Cu元素以及營養元素K、Ca、P。根際土樣經瑪瑙研缽研細過100目篩后高溫消解，分析總Cu含量。利用Tessier五步連續提取法，依次提取未種苗土（原位土壤）以及幼苗根際土樣中的可交換態（Exchangeable）、碳酸鹽結合態（Carbonate）、鐵-錳氧化物結合態（Fe-Mn oxides）和有機結合態（Organic matter）的Cu元素，以總Cu含量減去上述4種形態的Cu得到殘渣態（Residual）。

1.3 數據分析

采用SPSS 22.0統計軟件，對數據進行單因素方差分析（one-way ANOVA，P＜0.05）。

2 結果

2.1 Pt菌種的重金屬Cu耐性

不同Cu濃度處理下，液體培養基中菌絲體干重及菌種菌絲體所含重金屬Cu含量如圖1所示。隨著Cu處理濃度的增加，菌絲體的生長明顯受到抑制，當處理濃度達到200 μmol/L左右時，菌絲生長抑制率達到50%；同時，菌絲體內的Cu含量也隨著處理濃度的增加而增加，在500 μmol/L處理下，菌絲Cu含量接近了6 000 mg/kg。通過液體純培養實驗可以看出，菌種Pt具有很強的Cu耐性，且對Cu具有較強的吸附能力。

圖1 不同Cu濃度處理下Pisolithus tinctorius（Pt）菌種液體純培養菌絲干重（A）及菌絲Cu（B）含量

2.2 Pt菌根化幼苗對黑松生物量的影響

5個月盆栽試驗后，收集黑松苗各部分干重及總生物量如圖2所示。收集獲得的Pt菌根化幼苗仍然保持較高的侵染率（82.1±10.5）%。與未接種的幼苗相比，Pt的侵染可以顯著地（F=44.57，P=0.003）促進宿主幼苗的生長，尤其是根（F=9.66，P=0.036）和葉（F=21.78，P=0.010）

2.3 植物樣Ca、K、P元素含量分析

表1顯示，外生菌根真菌的侵染，可以有效的促進宿主幼苗根及莖中P和Ca的吸收，而宿主植物對K的吸收、幼苗葉片對Ca和P的吸收均沒有受到菌種侵染的影響。

2.4 Pt菌根化對重金屬Cu元素吸收的影響

在Cu污染的土壤中，重金屬Cu主要集中在植物根部，Pt菌種的侵染可以有效地降低重金屬由根部向針葉的轉運，減少重金屬的毒害。由表2可知，Pt菌種的侵染可以顯著（P＜0.001）降低重金屬生物轉運系數（生物轉運系數=針葉的重金屬含量/根部重金屬含量），由不接菌的（15.98±3.38）%降低到（7.50±0.96）%，繼而減少了Cu對宿主植物的毒害作用。盡管如此，Pt菌種的侵染可以通過增加生物量來顯著（F=11.26，P=0.02）提高幼苗體內總Cu量：由不接菌的（33.36±3.89）μg增加到（42.65±2.81）μg。同時，又由于菌根作用，宿主生物量的提高，有效地稀釋了重金屬在宿主體內的濃度，降低了其對宿主植物的毒害。

圖 2 P. tinctorius（Pt）菌根化幼苗和非（Control）菌根化幼苗不同部位干重

2.5 菌根化對土壤重金屬Cu形態的影響

由表3可見，供試土壤中Cu主要以鐵-錳氧化物結合態（Fe-Mn oxides）、有機結合態和殘渣態的形式存在。植物的種植，可以顯著的降低土壤中碳酸鹽結合態Cu含量，由原位土壤的7.87%分別降低到4.86%（不接菌）和5.42%（接菌處理），菌根的侵染顯著降低了土壤中可交換態Cu的含量，由原位土壤的0.58%降低到0.35%，而種植未接菌的幼苗，只降低到0.42%。

3 討論

早期的研究表明，Pt菌種含有的金屬結合蛋白，如金屬硫蛋白、蛋白硫化物［25］，可以有效提高Pt菌種對Cu的耐性，本研究中液體純培養耐Cu性實驗，很好地驗證了這一點，且隨著Cu含量增高，菌絲體內Cu含量也增加。Pt菌種除可與很多常見樹種（如松樹、櫟樹、栗樹等）形成菌根形態，還可以與一些生長在不同生境下的重要樹種共生［26-28］，在全球分布很廣。它們可影響森林生態系統［26，29］，特別是在外界逆境脅迫下，可以有效地促進宿主植物對P、K、Ca的吸收，通過輔助宿主植株吸收營養礦質元素來提高其對外界環境脅迫（重金屬、干旱等）的適應性［30-34］，基于Pt菌種具有重金屬耐性、普遍存在，容易實驗室培養、回接（與宿主幼苗形成菌根）等優點，其在逆境下森林恢復中具有很高的應用前景。

表1 菌根化（Pt）及未菌根化（Control）幼苗各部位營養元素K、P和Ca含量

表2 菌根化（Pt）及未菌根化（Control）幼苗各部位重金屬Cu含量、積累量及生物轉運系數

表3 Tessier五步連續提取法土壤重金屬Cu含量百分比

菌根真菌的侵染可以通過增加營養元素的吸收、降低重金屬的吸收來抵御重金屬脅迫［35-37］，外生菌根真菌普遍存在森林土壤中，也包括那些重金屬含量比較高的地方，這些菌根真菌在提高宿主植物耐受重金屬毒害方面發揮著巨大的作用［11，38］，可以提高污染土壤中植被的恢復［39］。在重金屬脅迫下，相對于針葉部分，幼苗的根和莖部更易受到重金屬的毒害。本研究結果顯示，菌根Pt的存在，可以有效地促進宿主植物根、莖部營養元素（Ca、P）的吸收，以抵制重金屬對幼苗的毒害。而對于K元素的吸收，在我們的研究中發現，菌根真菌Pt的侵染對其影響并不顯著，由此推測，在K元素豐富的土壤環境下，宿主不需要通過菌根來增加體內的K含量。有關菌根在輔助宿主于不同K濃度下吸收K的原理，有待進一步的探索研究?？梢姡婢鶳t可以輔助宿主植株黑松在重金屬Cu污染土壤中定植，同時可以有效地促進宿主對營養元素的吸收，促進宿主植株的生長。研究還發現，外生菌根真菌Pt的侵染，減少了逆境脅迫下重金屬Cu由地下部分向地上部的轉運，提高了宿主重金屬Cu耐性，同時通過提高宿主的生物量，提高了重金屬在植物體內的總含量，從而提高污染土壤中重金屬的植物提取效率，在輔助植物修復重金屬Cu污染土壤應用中表現出積極的作用。

土壤重金屬總量與其生物有效態、生物效應間關系比較復雜。由于元素形態的組成不同，等量重金屬在不同地理、生態環境下所表現出的環境生物有效性差異較大，采用總量很難科學評價土壤中重金屬的污染水平，因此，生物有效態含量逐漸成為土壤污染評價與風險預測的重要依據。土壤元素生物有效態（Bioavailable Fraction）通常指土壤中生物可吸收的元素形態。Tessier 連續提取法中可交換態與碳酸鹽結合態之和描述的是重金屬在土壤中的生物活性部分的大?。?0］。外生菌根真菌的侵染，可以減少土壤中生物有效態，尤其是可交換態的重金屬（Cu）含量，從而減少重金屬對菌根宿主以及其他植株的毒害，有利于其定植生長。菌根真菌的菌絲體，可以有效地吸附可交換態的金屬，同時，其代謝分泌物對可交換態金屬離子具有固定作用［41-43］，通過這兩個途徑降低了土壤中可交換態Cu的含量。

接種外生菌根真菌，不僅促進宿主植株對營養元素的吸收，同時降低土壤中可交換態重金屬（Cu）的含量，降低了重金屬Cu的毒害性，有利于宿主植物以及周邊其他植物的定植，在植被的恢復中及生物修復等方面具有一定的應用前景。

4 結論

具有一定重金屬耐性的外生菌根真菌（Pt），可以輔助宿主植株在重金屬Cu污染土壤中定植，同時可以有效地促進宿主對營養元素（Ca、P）的吸收，促進宿主植株的生長。

重金屬Cu脅迫下，菌根真菌（Pt）可以通過減少宿主幼苗Cu從地下部分向地上部的轉運，減少重金屬Cu對宿主的毒害，提高宿主生物量，以增加Cu的吸附量，達到輔助修復重金屬Cu污染土壤的目的。

外生菌根真菌Pt的侵染，可以減少土壤中生物有效性的重金屬Cu含量，增加殘渣態的量，減少重金屬Cu對周邊植株的毒害，利于其他植物的定植。

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（責任編輯 馬鑫）

The Application Potential of Ectomycorrhizal Fungus Pisolithus tinctorius Assisting Plant in Phytoremediation of Cu-contaminated Soils

WEN Zhu-gui1，2WANG Jie1，3TANG Yang-ze1，3SHI Liang1，3HONG Li-zhou2SHEN Zhen-guo1，3CHEN Ya-hua1，3
（1. College of Life Sciences，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095；2. Jiangsu Coastal Area Institute of Agricultural Sciences，Yancheng 224002；3. National Joint Local Engineering Research Center for Rural Land Resources Use and Consolidation，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095）

The purposes of this paper are to study copper tolerance of Pisolithus tinctorius（Pt）and the effects of Pt on host pine（Pinus thunbergii）seedlings growth，nutrients and heavy metal（Cu）absorption，and to probe its potential for mitigating Cu-contaminated soil. Pt was treated by Cu at concentrations of 0（control），5，50，100，250，and 500 μmol/L in pure culture with the pot experiment. The growth，nutrients，and Cu concentrations of different parts of seedlings（inoculated with or without Pt）were analyzed. Results showed that Pt strain presented greater Cu tolerance，and its 50% tolerance index（TI）was about 200 μmol/L. Inoculation with Pt significantly improved the growth of host plant（F = 44.57，P = 0.003）and the contents of nutrients such as P and Ca in roots and stems compared with non-inoculated ones，thus mitigating the toxic damage of Cu to host pine. The extraction efficiency of heavy metals in the soil could be improved by increasing biomass of host plants，though Cu concentration in the shoots of inoculated seedlings was decreased. Besides，inoculation with Pt reduced the toxicityof Cu to host plants via reducing the soil exchangeable Cu content. Conclusively，Cu-tolerant fungus Pt may improve the growth and nutrient absorption of host seedlings，as well as reduce the toxicity of Cu to host，improve the extraction efficiency of P. thunbergii to Cu. It shows application potential in phytoremediation and vegetation restoration in Cu-contaminated soil.

Pisolithus tinctorius（Pt）；Pinus thunbergii；copper tolerance；extraction；vegetation restoration

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.019

2016-10-21

國家自然科學基金項目（41571307，31371545），江蘇省科技廳社會發展項目（BE2015680），江蘇省農業科技自主創新資金項目（cx（14）2046），江蘇沿海地區農業科學研究所基金項目（YHS201501）

溫祝桂，男，博士，助理研究員，研究方向：污染土改良利用、群落生態；E-mail：wenzhugui@163.com

陳亞華，男，博士，教授，研究方向：土壤重金屬污染植物修復；E-mail：yahuachen@njau.edu.cn