蘇云金芽胞桿菌cry2Ab34基因的克隆、表達和殺蟲活性分析

張月 李海濤 劉榮梅 高繼國

（東北農業大學生命科學學院，哈爾濱 150030）

蘇云金芽胞桿菌cry2Ab34基因的克隆、表達和殺蟲活性分析

張月 李海濤 劉榮梅 高繼國

（東北農業大學生命科學學院，哈爾濱 150030）

旨在對蘇云金芽胞桿菌cry2Ab34基因進行分子鑒定和生物活測定，從殺蟲活性高的Bt BJH500 菌株中提取基因組DNA，通過 PCR 法克隆得到cry2Ab34基因（GenBank 登錄號為KX357382）。這個基因序列已被國際Bt基因命名委員會正式命名為 cry2Ab34，結果顯示，對cry2Ab34基因進行表達，獲得大小約70 kD的表達產物，將該基因在大腸桿菌E.coli BL21中表達之后進行生物活性測定，結果表明對鱗翅目害蟲小菜蛾（Plutella xyllostella）和棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）都具有一定的殺蟲活性，其校正死亡率10 μg/mL為31.25 %，100 μg/mL為62.5 %和校正死亡率10 μg/mL為29.4%，100 μg/mL為52.9 %。

蘇云金芽胞桿菌；cry2Ab34基因；殺蟲晶體蛋白；殺蟲活性；小菜蛾；棉鈴蟲

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一種能夠產生多種殺蟲晶體蛋白（Cry）的土壤細菌［1，2］，其形成芽胞的過程中，形成一個或多個伴胞晶體（parasporal crystal）。大多數這種伴胞晶體具有殺蟲活性，所以又稱殺蟲晶體蛋白（ICPs）或 δ-內毒素（δ-endotoxin）。該菌具有高效、對人畜和環境安全且對標靶寄主特異性強的特點，是化學殺蟲劑的重要替代品之一［3］，已成為目前世界上開發產量最大、時間最長、應用最廣的生物殺蟲劑，總占生物殺蟲劑量的90% 以上，已有60多個國家登記了120多個品種，期間取得了巨大的經濟、生態和社會效益［4］。Bt 蛋白殺蟲活性對非靶標生物無害，因此被制成生物殺蟲劑廣泛地應用于農業、林業以及衛生害蟲的防治［5，6］。Bt的cry基因已成功轉入很多主要農作物包括玉米、棉花、番茄等，使它們具有抗蟲特性［7-10］。原理是因為Cry 晶體溶解后，原毒素由昆蟲中腸蛋白酶降解成約60 kD、具有蛋白酶抗性的活性毒素［11］，而多數鱗翅目昆蟲中腸的蛋白酶為胰蛋白酶類［11］或胰凝乳蛋白酶類［12］。所以，原毒素的激活過程與殺蟲特異性有一定的關系。如Cry1Ab7用鱗翅目昆蟲的中腸液激活后對鱗翅目昆蟲表現出活性；蚊子的中腸液激活，則對雙翅目昆蟲表現出殺蟲活性［13］。有發現Cry1 類殺蟲晶體蛋白對鱗翅目害蟲具有特異毒性，在微生物和植物基因工程中得到了廣泛的應用，但其存在著殺蟲譜狹窄、昆蟲產生抗藥性等問題［14，15］。而Cry2類蛋白在結構和殺蟲機制方面不同于Cry1 類，如 Cry2Aa既對鱗翅目害蟲有毒性又能殺害雙翅目害蟲［16］。

有研究發現cry2類基因可以編碼對鱗翅目害蟲有活性的毒素蛋白，Cry2A毒素蛋白的大小約65-70 kD，其殺蟲活性范圍寬。Cry2Aa［17］、Cry2Ag［18］對鱗翅目和雙翅目的幼蟲都有有毒性。而已報道Cry2Ab［17］和Cry2Ac［19］只對鱗翅目有毒性。此外，還報道了Cry1A不與Cry2A分享膜上的結合位點［20］，因此，新分離的蛋白具有不同的序列，具有更高的毒性和更廣泛的殺害蟲范圍。目前的研究表明，Cry2Al1有廣闊的殺蟲活性，對斜紋夜蛾（LC50= 2.448 μg/mL）和棉鈴蟲（LC50= 3.374 μg/mL）都有一定的殺蟲活性。據報道，Cry2Aa14蛋白對斜紋夜蛾的殺蟲活性LC50為694 ng/cm2和122 ng/cm3［21］，而且Cry2Aa蛋白有71.4%的殺蟲死亡率和濃度在81%-99%時，有嚴重體重抑制作用，進行1周殺蟲活性測定，對棉鈴蟲的幼蟲體重抑制作用為2.3 μg/μL［22］。據相關的研究表明Cry2Ab毒素蛋白基因單獨轉化植物表達載體PSR784d，為進一步轉化植物和研究其單價轉基因植物的抗蟲性奠定了基礎［23］。Cry2Ab，Cry2Ae，Cry2Af蛋白僅對鱗翅目害蟲有活性，其中Cry2Ab蛋白對棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）、大豆食心蟲（Leguminivora glycinivorella）、小菜蛾（Plutella xylostella）和水稻二化螟（Chilo suppressalis）等鱗翅目害蟲具有高毒力［24］。基于以上研究背景，本研究采用分離Bt菌株進行高活性的篩選與基因鑒定的方法，來發掘對小菜蛾和棉鈴蟲具有高效殺蟲活性的菌株， 為解決農業害蟲的防治提供了新的微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 Bt BJH500菌株由本實驗室分離得到，表達菌株E. coli BL21與載體 pEB 由本實驗室自己保存。

1.1.2 培養基 液體LB 培養基：胰蛋白胨5 g、酵母提取物2.5 g、氯化鈉 5 g、蒸餾水 500 mL、pH7.0，121℃高溫高壓滅菌20 min。 固體 LB 培養基：在液體 LB 培養基中加 13 g/L 的瓊脂。固體 1/2LB 培養基：胰蛋白胨5 g、酵母提取物2.5 g、氯化鈉5 g、瓊脂13 g、蒸餾水1 000 mL，pH7.0，121℃高溫高壓滅菌20 min。

KOD酶、Taq DNA聚 合 酶、pMD19-T Simple Vector、Amp、X-Gal、IPTG、DNA Marker、蛋白質分子量標準均購自TaKaRa公司。質粒DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒購自美國Axygen公司。引物由金維智生物有限公司（北京）有限公司合成。分析純化學試劑均為市售。

小菜蛾和棉鈴蟲為科云生物有限公司（河南）所提供的標準化試蟲。

1.2 方法

1.2.1 土樣來源及Bt菌株的分離 土樣采自于中國海南地區，采用溫度法進行Bt菌株的篩選［25］。

1.2.2 晶體形態觀察 將 Bt 菌株BJH500 在1/2LB培養基上培養48 h后，將胞晶混合液滴于載玻片上，涂抹均勻，烘干固定，石炭酸復紅染液染色3 min，清水沖洗，100× 油鏡進行鏡檢［26］。

1.2.3 Bt基因組的提取 分離純化后的Bt菌在固體LB培養基上30℃過夜培養12 h，采用張彥蕊等［27］的方法提取基因組。

1.2.4 cry2Ab基因的克隆和測序 將提取基因組DNA，使用引物上游序列（5'-ATGAATAGTGTATTGAATAGCGGAA-3'）和下游序列（5'-TTAATAAAGTGG TGAAATATTAGTT-3'）擴增cry2Ab34基因，引物設計基于cry2Ab的全長序列。PCR 擴增時使用 KOD高保真酶，PCR 反應程序：94℃ 3 min；94℃ 30 s，51.9℃ 30 s，68℃ 2 min，30個循環；最后 68℃延伸10 min。擴增產物的回收純化參照Axygen公司的膠回收試劑盒說明書進行。將回收的PCR 產物分別連接pMD19-T Simple Vector克隆載體和pEB表達載體并轉入E. coli BL21中［28］，篩選陽性克隆進行PCR驗證，以便確認其是否連有目的片段。提取連接正確的重組細菌的質粒送至吉林省庫美生物科技有限公司進行測序。

1.2.5 基因誘導表達及SDS-PAGE 分析 誘導表達重組的大腸桿菌菌株，誘導條件為：IPTG 1 mg/mL，16℃，160 r/min，震蕩培養12 h。將誘導好的培養液在8 000 r/min 的條件下離心5 min 并收集菌體，之后用預冷的20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）懸浮菌體洗兩次。最后用 5 mL 20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）懸浮菌體，并在冰水混合物中超聲波破碎菌體，超聲時工作3 s，間歇3 s，將破碎完全的菌液離心取上清和沉淀以備實驗用［29］。

1.2.6 蛋白濃度的測定 參照蛋白定量試劑盒的使用手冊，以牛血清蛋白（BSA）為標準蛋白制作蛋白濃度標準曲線，進而測定上述參與蛋白SDS-PAGE定量分析的目的蛋白的濃度。再結合ImageMaster VDS軟件對目的蛋白所占比例的分析結果，計算出目的蛋白的濃度。

1.2.7 室內生物活性的測定 小菜蛾：量取10 mL待測蛋白溶液加入滅菌的50 mL離心管中，加入0.1%家用洗滌劑，充分混合均勻；選取新鮮的甘藍葉片，均勻地浸入上述待測樣品溶液中，浸泡20 s左右，使其表面完全沾濕。將毛筆用70%的乙醇處理后，再用無菌水沖洗，然后用毛筆輕輕的接入20頭幼蟲放入每個培養皿中，每個濃度梯度設3個重復，蓋緊防止幼蟲逃逸。放置25℃光照培養箱中進行培養，用光周期為16∶8，在培養箱中放置一水盆以調節濕度，進行每天觀察，24、48、72 h后調查死、活蟲數，計算死亡率。

棉鈴蟲：稱10 g人工飼料置于滅菌培養皿中，加入2 mL待測樣品稀釋液，充分與飼料攪拌混勻，放入室溫中，用毛筆分裝于培養板中，接入生理狀況一致的棉鈴蟲初孵幼蟲，每個接20頭，每個處理3個重復，用Tris-HCl處理飼料作為對照，置于26℃光照培養箱中保持其適當濕度，培養7 d后調查死、活蟲數，并檢測幼蟲取食情況。

2 結果

2.1 晶體形態觀察

Bt BJH500菌株產生的晶體形態，在光學顯微鏡（圖 1）下箭頭所示，從左到右依次為芽胞和晶體。

圖1 光學顯微鏡下Bt BJH500的晶體形態

2.2 cry2Ab34基因的克隆和序列分析

PCR 擴增結果（圖2）所示，將測序結果提交到 GenBank，獲得登錄號為KX357382。該基因序列已被國際Bt基因命名委員會正式命名為cry2Ab34。cry2Ab34序列全長為1 902 bp，編碼633個氨基酸殘基。cry2Ab34與其他來源于GenBank報道的Bt cry2Ab34基因有99% 的相似度。

圖2 cry2Ab34全長基因擴增結果

2.3 Cry2Ab34蛋白結構分析

由DNA序列推導的氨基酸序列結果，Cry2Ab34蛋白由633個氨基酸組成，相對分子質量為158 921.4。其中亮氨酸 Leu（L）、天冬酰胺 Asn（N）、絲氨酸 Ser（S）、蘇氨酸Thr（T）較多，分別為10.3%、11.4% 、9.0%和8.2% 。該蛋白等電點 pH 5.01，為弱酸性蛋白。通過NCBI Conserved Domain對cry2Ab34基因分析結果（圖3）所示，該基因所編碼的蛋白的 Domain I由N端第142-786位共644個氨基酸組成，Domain II由第799-1 416 位，共617個氨基酸組成，Domain III由第 1 480-1 884 位，共404個氨基酸組成。故Cry2Ab34蛋白的活性區域估計在N端的142-1 884個氨基酸附近。Cry2家族含有芽胞桿菌產生的殺蟲毒素，在芽胞形成過程中會產生晶體蛋白，其蛋白質的N末端和C末端的延伸部分會裂解出一些成分，一旦激活內毒素結合到腸上皮細胞會導致細胞裂解死亡。該激活區域δ-內毒素是由3個結構域，N末端的螺旋結構區域插入膜的孔隙形成過程中，第2個和第3個區域參與受體結合，結合到昆蟲特異性受體的腸道上皮細胞中。

圖3 Cry2Ab34蛋白的保守結構域分析

2.4 cry2Ab34在大腸桿菌中的表達

對cry2Ab34基因進行誘導表達，提取蛋白并進行SDS-PAGE 電泳檢測。結果（圖 4）顯示，表達產物的大小約 70 kD。以空質粒pEB 轉入E.coli BL21菌株作為陰性對照，未發現 70 kD 的蛋白，說明在大腸桿菌中成功表達Cry2Ab34蛋白。

圖4 Cry2Ab34表達蛋白SDS-PAGE電泳

2.5 生物活性分析

對在大腸桿菌中表達的Cry2Ab34蛋白進行對鱗翅目昆蟲小菜蛾幼蟲和棉鈴蟲幼蟲的殺蟲活性測定。利用20 mmol/L Tris-Cl溶液作為陰性對照，結果顯示對小菜蛾和棉鈴蟲都有一定的毒力。表達活性蛋白對鱗翅目害蟲小菜蛾生測的校正死亡率為10 μg/mL為31.25 %，100 μg/mL為62.5 %。棉鈴蟲的校正死亡率為10 μg/mL為29.4%，100 μg/mL為52.9%（表1）。

表1 Cry2Ab34蛋白濃度對供試昆蟲毒力的校正死亡率

3 討論

目前，對Bt新基因的發掘是我國的重點研究項目，并多年致力于研發轉基因植物，因此充分發掘Bt菌株新基因資源是一項重要工作。由于土壤成分、酸堿性、含水量和植被分布情況不同，對蘇云金芽胞桿菌在土壤中的分布都存在影響，其沙壤中匱乏營養物質會限制 Bt的生存，與之相反，植被覆蓋率高、營養豐富的土壤則有利于 Bt分布。此外，Bt 的分布也受氣候的影響，熱帶、亞熱帶土壤 Bt 分布［30］。蘇云金芽胞桿菌（Bt）菌株可以從不同的棲息地區分離出來，得到的Bt cry基因表達的蛋白有著不同的毒力和殺蟲譜［31］，因此其成功的應用于生物殺蟲劑中。但隨著Bt基因在抗蟲轉基因植物中應用的不斷擴大，Bt抗蟲基因在農田應用過程中毒性不強、殺蟲譜窄、持效期不長、害蟲易產生抗藥性等問題逐漸顯現［32］，cry基因編碼的晶體蛋白均在不同程度上引起昆蟲抗藥性的產生［33］。本研究克隆了cry2Ab基因，該基因表達的Cry2Ab34蛋白是對小菜蛾有一定殺蟲活性的毒素蛋白。對Cry2Ab34蛋白生物信息學分析，其中亮氨酸 Leu（L）、天冬酰胺 Asn（N）、絲氨酸 Ser S）、蘇氨酸Thr（T）較多，分別為10.3% 、11.4% 、9.0%和8.2%。可能是與Cry2Ab34蛋白的活性有相關性。對Cry2Ab34蛋白的跨膜區域分析發現，親水域與疏水域是相互交替的。Cry2Ab34蛋白保守結構域分析，其中含有3個結構域。Bt菌株和產品數量還相對較少，還需深入研究其殺蟲分子機理，同時擴大其殺蟲譜測定，尤其是對不同鱗翅目害蟲的毒性篩選，并進行田間防治劑型及應用方式的研究，將其應用到實踐中。

有研究從玉米田中篩選出cry2+cry9 復合基因型，對其進行生物學特性研究及分子鑒定，發現其對3種不同供試鱗翅目害蟲幼蟲的毒力差異顯著，僅對亞洲玉米螟幼蟲具有高毒力，對黏蟲和斜紋夜蛾幼蟲毒力不明顯［34］，而本研究中的實驗菌株BJH500含有一種新的cry2基因，其對鱗翅目害蟲的高毒力因素還需對其基因進行克隆、表達研究來進一步闡明。下一步工作需要對其基因進行更深入的研究，來確定其基因表達特性。蘇云金芽胞桿菌的殺蟲活性主要取決于其晶體蛋白的種類，而在蛋白序列中N端序列決定其殺蟲活性的多樣性［35］。研究發現的Cry2A新毒素蛋白與已知的晶體蛋白序列的不同主要位于其N端中，可能會導致其殺蟲活性和殺蟲譜的變化。在以往研究中，Cry2A毒素蛋白對鱗翅目、雙翅目多種害蟲具有殺蟲活性［36］。因此，在今后研究過程中可以當增加生測試蟲的范圍，以擴大殺蟲譜，為基因工程提供有益的基因資源，為生物制劑的開發提供研究材料。

4 結論

本研究從Bt BJH500 菌株中克隆得到cry2Ab34基因，基因序列全長為1 902 bp，編碼 633個氨基酸殘基，分子量約為70 kD，GenBank 登錄號為KX357382。該基因序列已被國際Bt基因命名委員會正式命名為cry2Ab34，將該基因在大腸桿菌E.coli BL21中表達，表達的Cry2Ab34蛋白對鱗翅目小菜蛾和棉鈴蟲具有一定的殺蟲活性，且濃度越大，殺蟲活性越高。

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（責任編輯 狄艷紅）

Cloning，Expression，and Insecticidal Activities of Gene cry2Ab34 from Bacillus thuringiensis

ZHANG Yue LI Hai-tao LIU Rong-mei GAO Ji-guo
（College of Life Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030）

In order to identify and detect insecticidal activities from Bacillus thuringiensis strain，the genomic DNA was extracted from the strain Bt BJH500 with high insecticidal activity，from which the insecticidal gene cry2Ab34（GenBank accession number：KX357382）was cloned by PCR. The gene was designated as cry2Ab34 by International Gene Nomenclature Committee of Bt. Gene cry2Ab34 was expressed and the weight of expressed product was approximate 70 kD. The gene was expressed in Escherichia coli BL21 for the determination of biological activity，results showed that this gene presented certain insecticidal activity to Plutella xyllostella and Helicoverpa armigera of Lepidoptera pests，the corrected mortality of 10 μg/mL was 31.25%，of 100 μg/mL was 62.5 %，of 10 μg/mL was 29.4 %，and of 100 μg/mL was 52.9 %.

Bacillus thuringiensis；gene cry2Ab34；insecticidal crystal protein；insecticidal activity；Plutella xyllostella；Helicoverpa armigera

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.024

2016-09-18

轉基因生物新品種培育科技重大專項（2014ZX0800913B-002），國家基礎科學人才培養基金資助項目（J1210069），國家自然科學基金項目（31401812），黑龍江省教育廳科學技術研究項目（12521021）

張月，女，碩士，研究方向：生物防治微生物功能基因的發掘、研究和利用；E-mail：1581039932@qq.com

高繼國，男，博士生導師，研究方向：生物大分子的分離純化，蘇云金芽胞桿菌抗性機理、生物安全性；E-mail：gaojiguo1961@ hotmail.com