一株產鼠李糖脂菌株的篩選、鑒定及其產物特性分析

王江鞠酒曹海龍郭衛華尹恒

（1. 大連海洋大學水產與生命學院，大連 116023；2. 中國科學院大連化學物理研究所天然產物與糖工程課題組 遼寧省碳水化合物重點實驗室，大連 116023；3. 大連海洋大學食品科學與工程學院，大連 116023）

一株產鼠李糖脂菌株的篩選、鑒定及其產物特性分析

王江1，2鞠酒2，3曹海龍2郭衛華1尹恒2

（1. 大連海洋大學水產與生命學院，大連 116023；2. 中國科學院大連化學物理研究所天然產物與糖工程課題組 遼寧省碳水化合物重點實驗室，大連 116023；3. 大連海洋大學食品科學與工程學院，大連 116023）

鼠李糖脂是最常見，研究最深入，應用最廣泛的一類生物表面活性劑。從油田附近、沼氣池旁的土壤中分離得到了25株菌，通過硫酸-苯酚反應，乳化實驗，排油性實驗，薄層色譜實驗篩選產鼠李糖脂的菌株并表征產生的鼠李糖脂，通過16S rDNA 序列確定細菌的種屬。硫酸-苯酚反應顯示有2株菌可能產鼠李糖脂；5株菌的發酵液具有明顯的乳化效果，命名為“其紅”這株菌的乳化指數可達58.97%；1株菌的發酵液上清稀釋10倍后排油圈直徑仍可達3.53 cm；薄層色譜實驗也顯示“其紅”菌產鼠李糖脂。在四個實驗中 “其紅”菌都檢測到了鼠李糖脂，故確認“其紅”菌可以產鼠李糖脂。16S rDNA序列分析表明“其紅”菌屬于希瓦氏菌屬（Shewanella）并與腐敗希瓦菌（S.putrefaciens LMG 26268（T））相似度最高。

表面活性劑；鼠李糖脂；菌株篩選；產物特性；希瓦氏菌屬

表面活性劑是一類素有“工業味精”之稱的重要化工原料，在環境、石油、化妝品、紡織、食品等領域有著廣泛的應用。傳統的表面活性劑是以石油為原料合成的，有著原材料價格波動較大，易造成環境污染等缺陷。隨著生物技術的飛速發展，生物來源的表面活性劑逐漸引起人們的重視，它是由一些微生物分泌產生的，集親水基團和疏水基團于一身的兩親化合物［1］。

與傳統化學合成的表面活性劑相比，生物表面活性劑具有的特性和優點有：（1）化學結構較為復雜和龐大，在表面擁有更多的活性基團，因此表面張力和界面張力較低，乳化活性較高［2］；（2）具有一些化學方法難以合成的基團，結構更特殊，專一性更強，賦予了其具有一些化學表面活性劑不具有的性質和生理功能，如抗菌、抗病毒等［3］；（3）穩定性較強，可以在較高的溫度、鹽度下保持特定的活性［4］；（4）生物表面活性劑大多是以天然副產物為原料，產生的副產物毒性小，而且其性能較強，用量少，具有生物可降解性，所以在生產、使用的過程對環境的污染和破壞較小［5］；（5）生物表面活性劑的生產原料來源方便、價格便宜、可再生，工藝簡單，因此生產成本較低［6］。

生物表面活性劑依據其不同的化學結構可以分為糖脂、脂膚、磷脂、脂蛋白、中性脂肪酸酸脂以及脂多糖聚合物等［7］。目前，糖脂是最重要且品種最多的一類生物表面活性劑［8］，在該類生物表面活性劑中，糖是以共價鍵的形式結合在脂肪酸上，其脂肪酸的烷基部分是親油基團，糖環部分為親水基團［7］。鼠李糖脂是最常見且應用最廣泛的一類糖脂［8］，其于1949年首次被報道由銅綠假單胞菌產生，是由一個或者兩個鼠李糖以共價鍵的形式與一個或者兩個β-羥基脂肪酸結合而成［9］。鼠李糖脂除了在石油、化工、環境等方面的用途外，還可以用來生產鼠李糖，生產的鼠李糖可以廣泛應用到食品、醫藥工業中［10］。

石油是重要的能源物質，在世界的發展中有著不可替代的地位。我國石油的消耗量較大，儲量相對較少，現在超過一半的石油需要進口，但是以目前的技術，原油的開采率較低［11］，造成開采收率低的主要原因有：（1）常規開采后高粘稠原油比例的提高使得原油的流動性降低；（2）某些地方的油質本身的滲透性較低，難以流動；（3）油水間的表面張力很高使得毛細管力升高。正是由于這些原因，使得石油進一步開采的難度增加了。為了克服這些問題，在原油的開采過程中，往往會向地層中注入一些表面活性劑以改變巖石表面的憎水性，降低表面和界面的張力，促進原油的乳化，改善油水的流度比進而提高石油的采收率。傳統的表面活性劑大多是化學合成品，如石油磺酸鹽等，但是生產石油磺酸鹽的原材料——石油在不同時期的價格、來源不穩定，在使用的過程中還會產生嚴重的環境污染，而鼠李糖脂這類生物表面活性劑可以有效解決這些問題。鼠李糖脂除了在降低表面張力，改變巖石的憎水性，促進原油的乳化方面的性能與磺酸鹽相似外，在熱穩定方面比磺酸鹽更好，在地層水中的溶解性更強，能夠更好的發揮作用。大慶油田將鼠李糖脂發酵液與磺酸鹽混合使用，可以產生明顯的協同效應，使得價格昂貴的磺酸鹽用量大幅減少，有效的降低了成本，減輕了環境污染［12］。鼠李糖脂還可以用來幫助治理被石油污染的環境，它聚集在油水的界面，降低界面張力，促進乳化作用，從而增強油水的流動性，實現油相在水相的分散，使得石油可以快速的進入微生物細胞體內進而被分解掉，快速修復被石油污染的環境［8，13］。

本研究從油田附近、沼氣池旁的土壤中分離得到了幾十株菌，經過硫酸-苯酚反應、乳化實驗、排油性實驗及薄層色譜實驗證實了“其紅”菌可以產生鼠李糖脂。通過分析其16S rDNA的序列，確定該菌屬于希瓦氏菌屬（Shewanella），與腐敗希瓦菌（S.putrefaciens LMG 26268（T））相似度最高，旨在為進一步研究該類菌特性及其應用提供借鑒參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 沼氣池旁、油田附近、排水溝處的土壤樣品共計9份。

1.1.2 培養基與溶液 液體富集培養液：蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏3 g/L，NaCl 5 g/L，（固體培養基還加入20 g/L的瓊脂），調pH值7.0，121℃滅菌15 min，用于菌株的分離純化。

發酵培養液：甘油20 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋 白 胨10 g/L、 酵 母 膏5 g/L、NaH2PO42 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、調節pH 7.0，121℃滅菌15 min。用于發酵產鼠李糖脂。

硫酸苯酚溶液：1 mL 6%苯酚和5 mL濃硫酸后混勻。用于檢測鼠李糖脂。

展開劑：氯仿∶甲醇∶水比例為65∶15∶2，100 mL體積再滴加2滴乙酸。用作薄層色譜實驗。

染色劑組成：3 g苯酚和5 mL 98%的濃硫酸溶于95 mL無水乙醇中。用作薄層色譜后的染色。

1.2 方法

1.2.1 分離、純化菌株 將樣品用無菌水稀釋后取上清接于液體富集培養液中培養2 d，將菌液梯度稀釋后取200 μL涂布于固體的富集培養基上面，28℃培養3 d，挑取形態、顏色不同的單菌落在固體富集培養基上面劃線，分離純化細菌，菌長起來以后再劃五次確保獲得的菌株是純的。

1.2.2 乳化指數的測定［14］將分離的單菌落接入發酵培養液中培養48 h后，發酵液12 000 r/min離心10 min，留上清。取上清0.5 mL到一個密閉的小玻璃管中，再加入1 mL煤油，充分震蕩，靜置24 h，測量乳化層和整個混合物液面的高度，每個發酵液樣品測3個平行。計算乳化指數。計算公式為：E1%=100%×乳化層高度/混合物高度。

1.2.3 排油圈的測定［14］取30 mL去離子水至干凈的培養皿中，再添加200 μL柴油以形成油膜，將發酵液上清稀釋10倍后取5 μL加到油膜的中央，測定排油圈的直徑。每個發酵液上清樣品測3個平行。

1.2.4 硫酸-苯酚反應［14］將發酵液上清和未接菌的發酵液稀釋10倍后取0.2 mL到密閉試管中，液態的鼠李糖脂標準品稀釋500倍后取0.2 mL至另外的密閉試管中，再加入0.6 mL 硫酸苯酚溶液至試管中，沸水浴中煮15 min，冷卻到室溫以后，取200 μL到96孔板中，使用酶標儀在400 nm至700 nm間，以5 nm為間隔進行全波長掃描。

1.2.5 薄層色譜實驗［14］根據前面測定的結果選擇了5株可能產鼠李糖脂的菌株再接入發酵培養液中培養2 d，發酵液離心，用濃鹽酸將上清的pH值調到2，4℃放置24 h后在4℃下12 000 r/min離心20 min，棄上清，沉淀用真空冷凍干燥機凍干。將制備的鼠李糖脂溶于0.05 mol/L的 NaHCO3溶液中配成終濃度5.93 g/L的鼠李糖脂溶液。用毛細管取鼠李糖脂溶液在距薄層色譜板一端約1 cm處進行點樣，并同時在另一點樣處點上鼠李糖脂的標準品作為參照。將薄層色譜板置于盛有展開劑的展開槽中展開，待展開劑上升到距離色譜板頂端1 cm左右時取出色譜板，自然晾干后噴上染色劑100℃烘烤顯色直至出現棕色斑點為止。測量點樣點距離棕色斑點和展開劑邊緣處的距離以計算遷移率。遷移率（%）=100%×待測物質遷移距離/溶劑展開距離。

1.2.6 菌種鑒定 經過4個實驗確定了一株命名為“其紅”的菌株能產鼠李糖脂，挑取該菌的單菌落接入液體富集培養液中培養12 h，取菌液12 000 r/min離心10 min，用DNA提取試劑盒提取其全基因組。以提取的DNA為模板，以16S rDNA基因的通用引物［15］27F和1 492R擴增該菌的16S rDNA序列。擴增的片段經過膠回收后送華大基因科技服務有限公司測定序列，測得的序列提交到細菌鑒定專用數據庫 ezbiocloud（http://www.ezbiocloud.net/eztaxon） 進行同源性檢索，下載模式菌株的序列，利用MEGA6軟件以Neighbor-Joining（NJ）法構建系統發育樹［16］。

2 結果

2.1 菌株的分離與純化

依據菌落的形態、顏色等的不同，經過5次以上的劃線最終分離得到了25株菌，它們被用作進一步的實驗以篩選產鼠李糖脂的菌。

2.2 乳化指數的測定

分離出來25株菌的發酵液測完乳化指數后，5株有明顯乳化作用菌發酵液的乳化指數，見圖1。“其紅”菌株乳化指數可達58.97%。

圖1 幾株菌的乳化指數

2.3 排油圈的測定

發酵液上清稀釋10倍取5 μL測定了排油圈直徑，具有明顯排油性菌株的排油圈直徑如圖2。編號為C-1-4-1菌的排油性最好，直徑可達3.53 cm。

圖2 幾株菌的排油圈直徑

2.4 硫酸-苯酚反應

發酵液上清進行硫酸-苯酚反應并以5 nm為間隔進行全波長掃描，結果（圖3）顯示鼠李糖脂的標準品在475 nm處有吸收峰，未接菌的發酵液在485 nm處有吸收峰，編號為“其紅”、1-1-A-1菌的吸收峰在475 nm處。

圖3 “其紅”、1-1-A-1發酵液與鼠李糖脂標準品和未接菌發酵液的全波長掃描吸收峰圖

2.5 薄層色譜進一步確定產物特征

層析染色后發現與鼠李糖脂標準品一樣，“其紅”這株菌在相對應的位置也有一個棕色斑點（圖4），其他菌未發現明顯的棕色斑點。據Zhang等［17］報道，有棕色斑點的可認為是糖脂。測量了這2個圖譜中溶劑與樣品的遷移距離，“其紅”樣品的遷移距離是4.0 cm，溶劑的遷移距離是7.4 cm，所以“其紅”樣品的遷移率為4.0/7.4×100%=54%。鼠李糖脂標準品的遷移距離是3.9 cm，溶劑的遷移距離是7.4 cm，所以鼠李糖脂標準品的遷移率為3.9/7.4×100%=53%。

圖4 薄層色譜分析“其紅”菌株的鼠李糖脂產物

2.6 菌種鑒定

經過前面一系列的實驗確定了“其紅”這株菌可以產鼠李糖脂。使用通用引物擴增出1 500 bp左右的16S rDNA序列。該序列測序后共有1 430個有效堿基，將其提交到ezbiocloud數據庫后下載與之相近的模式菌株并建構建系統發育樹后發現該菌屬于希瓦氏菌屬，與腐敗希瓦菌（S. putrefaciens LMG 26268（T））相似度最高，達到99.37%，與希瓦氏菌屬內其他種以及相鄰屬的進化距離，見圖5，分支節點上的數值表示1 000次重復的步長值。

3 討論

表面活性劑是一類重要的化工原料，在很多領域有著廣泛的應用，而傳統的化學表面活性劑是以石油為原料合成的，有諸多缺陷，因此需要找一些其他的表面活性劑替代傳統的化學表面活性劑。隨著近幾十年生物技術的飛速發展，由微生物產生的一類生物表面活性劑具有很多優良的性能。例如，表面張力和界面張力低，乳化活性高，專一性強，具有特殊的生理功能，生產過程產生的有毒副產物少，具有生物可降解性，在生產、使用的過程對環境的污染和破壞很小等優良特性。鼠李糖脂是一種典型的生物表面活性劑，篩選可以產鼠李糖脂的微生物是一個重要研究方面。

各菌的發酵液上清和鼠李糖脂標準品經硫酸-苯酚反應后全波長掃描，根據Zhang等［14］報道，若在480 nm處有吸收峰則表明有糖脂，掃描結果顯示鼠李糖脂標準品的吸收峰在475 nm處，未接菌發酵液在485 nm處有吸收峰，編號為“其紅”、1-1-A-1菌的吸收峰也在475 nm處，故可初步判斷這兩株菌產鼠李糖脂。

樣品和標準品薄層色譜實驗結束后可以發現“其紅”菌樣品與鼠李糖脂標準品在相同的位置都有一個棕色斑點，其他菌樣品沒有發現明顯的棕色斑點。據Zhang等報道［17］，有棕色斑點的可認為是糖脂。在薄層色譜分析過程中，硅膠板和展開劑對不同結構物質的吸附能力不同，最終體現在樣品遷移率的不同上，“其紅”菌樣品的遷移率為54%。鼠李糖脂標準品的遷移率為53%，兩者的遷移率接近，僅差1%，表明兩者的結構相似。而且在乳化實驗和排油性實驗中，“其紅”這株菌均檢測到了相應的特征。綜合起來可以認為這兩者屬于同一類物質，即“其紅”菌的發酵液中含有鼠李糖脂。

圖5 “其紅”菌株16S rDNA序列NJ法構建的系統發育樹

自1949年Jarvis和Johnson［9］首次發現銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）可以產鼠李糖脂以來，隨著生物技術的不斷發展，越來越多的微生物被報道可以產鼠李糖脂。在Pseudomonas屬中有：P.fluorescens［18］、P.chlororaphis［19］、P.nitroreducens［20］等；在Burkholderia屬中有B.pseudomallei［21］、B.plantarii［22］、B.thailandensis［23］等。除了在Pseudomonas和Burkholderia這兩大屬中有較多種類的微生物可以產鼠李糖脂外，Enterobacter asburiae、Enterobacter hormaechei、Acinetobacter calcoaceticus、Pantoea stewartii［24］以及革蘭氏陽性菌Renibacterium salmoninarum［25］、Tetragenococcus koreensis［26］和真菌Aspergillus sp MSF1［27］等微生物也可以產生鼠李糖脂。我們從沼氣池和油田附近的土壤中篩選得到了一株與腐敗希瓦菌［S. putrefaciens LMG 26268（T）］相似度最高的一株菌，該菌發酵液上清的乳化指數可以達到58.97%，與目前最典型、研究最深入銅綠假單胞菌的乳化指數（90%以上［28］）還有一些差異，不過對碳源、溫度等培養條件進行優化，應該能夠提高它的乳化效果。據我們了解希瓦氏屬中，幾乎沒有產鼠李糖脂菌的報道，所以本研究可能是首次報道希瓦氏菌屬可以產生鼠李糖脂，增加了一種可以產鼠李糖脂的新菌屬。

4 結論

本研究從油田、沼氣池旁的土壤中分離純化出了25株菌，其中5株菌的發酵液具有明顯的乳化效果，“其紅”菌的乳化指數可達58.97%；6株菌具有明顯的排油性，1株菌排油圈直徑可達3.53 cm；硫酸-苯酚反應發現有2株菌產鼠李糖脂；薄層色譜實驗證實了“其紅”菌產鼠李糖脂。在4個實驗中，“其紅”這株菌都檢測到了鼠李糖脂，故確認這株菌產鼠李糖脂。16S rDNA序列分析后發現這株菌屬于希瓦氏菌屬，與腐敗希瓦菌相似性最高。

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（責任編輯 狄艷紅）

Screening and Identification of Rhamnolipid-producing Strains and Characterization of the Product

WANG Jiang1，2JU Jiu2，3CAO Hai-long2GUO Wei-hua1YIN Heng2
（1. College of Fisheries and Life Science，Dalian Ocean University，Dalian 116023；2. Natural Products and Glyco-Biotechnology，Dalian Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Sciences，Dalian 116023；3. College of Food Science and Engineering，Dalian Ocean University，Dalian 116023）

Rhamnolipid is the most common biosurfactant that has been deepest studied and the most widely applied. Total 25 strains were isolated from soil of the near oil field and biogas plant. The strains that produced rhamnolipid were screened and characterized by sulfuric acid-phenol reaction，emulsification experiment，oil-spreading experiment，and thin layer chromatography experiment. The strains were identified by 16S rDNA sequence analysis. The sulfuric acid-phenol reaction showed that 2 strains might produce rhamnolipid；the fermentation supernatants of 5 strains showed emulsified effect and the emulsifying index of the strain was up to 58.97%. The oil-spreading diameter of the fermentation supernatant，diluted 10 times，of one strain reached 3.53 cm. The thin layer chromatography experiment verified that the strain“Qihong” did produce rhamnolipid. The rhamnolipid in the strain “Qihong” was detected by all four experiments，confirming that strain “Qihong”produced rhamnolipid. The 16S rDNA sequence analysis revealed that the strain “Qihong” belonged to Shewanella，and was the most similar to Shewanella putrefaciens LMG 26268（T）.

surfactant；rhamnolipid；strain isolation；product characterization；Shewanella

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.025

2016-10-28

中科院青年創新促進會（2015144），大連市杰出青年科技人才（2015R010）

王江，男，碩士研究生，研究方向：微生物和酶；E-mail：jiangwang1024@126.com

尹恒，男，博士，研究員，研究方向：糖工程及糖生物學，E-mail：yinheng@dicp.ac.cn；郭衛華，女，博士，副教授，研究方向：殼寡糖促進植物生長，E-mail：1601079113@qq.com