思茅松轉錄組SSR分析及標記開發

趙能原曉龍繆福俊王毅陳偉李江吳濤王娟

（1. 西南林業大學林學院，昆明 650224；2. 云南省林業科學院 云南省森林植物培育與開發利用重點實驗室，昆明 650201）

思茅松轉錄組SSR分析及標記開發

趙能1原曉龍2繆福俊2王毅2陳偉2李江2吳濤2王娟2

（1. 西南林業大學林學院，昆明 650224；2. 云南省林業科學院 云南省森林植物培育與開發利用重點實驗室，昆明 650201）

基于思茅松轉錄組測序數據進行其SSR標記開發，為豐富思茅松SSR數據庫提供參考。采用MISA軟件對思茅松59 636條Unigene進行SSR搜索，共獲得3 745個SSR位點，分布頻率為6.28%，平均11.36 kb出現一個SSR位點。SSR重復類型以三核苷酸基序為主，其次是二核苷酸基序，所占比例分別為49%和24%，其主要重復單元分別為AGC/CTG和AT/TA。隨機挑選224個位點進行引物設計及合成，瓊脂糖凝膠檢測發現其中29個位點具有多態性且效果良好，但僅12個位點符合SSR重復類型的倍數大小且擴增效率高于85%。利用這12對熒光標記引物，對2個居群42份樣本進行遺傳多樣性分析，共檢測到35個等位基因，多態性信息量（PIC）為0.093 2-0.480 9，平均為0.306 9。4個位點為低度多態位點（0＜PIC＜0.25），8個位點為中度多態位點（0.25＜PIC＜0.5）。這12個標記可用于思茅松遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、基因定位及克隆等研究，旨為思茅松分子標記輔助育種及變異水平等研究提供技術支持。

思茅松；轉錄組；SSR；引物開發

思茅松（Pinus kesiya var. langbianensis）是松科松屬常綠喬木，為卡西亞松（P. kesiya）的地理變種，主要分布在云南中南部海拔1 800 m以下地區，具有生長快、材質好、紋理正直等特點，木材纖維長且強度高，是云南省重要的造林、采脂、紙漿材及用材針葉樹種，在云南省林業生產和生態環境建設中起著極其重要的作用［1，2］。思茅松的遺傳育種研究一直受到重視，已從育種策略［3］、核型分析［4］和等位酶分析［5］等方面開展了研究。隨著科技的進步，分子標記技術已在近年來開始用于思茅松遺傳多樣性研究。盡管建立了思茅松簡單重復序列區間擴增（Inter-simple sequence repeat，ISSR）［6］和擴增片段長度多態性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）［7］的PCR擴增體系，但已有的思茅松遺傳多樣性研究僅限于隨機擴增多態性（Randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）一種方法［8］，還沒有用簡單序列重復（Simple sequence repeat，SSR）標記分析思茅松遺傳多樣性的報道，因而缺乏思茅松SSR標記的特異性引物。

SSR標記又稱微衛星標記，具有穩定性高、多態性豐富、位點特異性、共顯性遺傳和檢測方便等特點，是廣泛應用于動植物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、親權鑒定、基因定位及克隆等的理想分子標記［9，10］。引物開發是進行SSR分子標記研究的前提。早期開發SSR引物的方法主要有2種，一種是cDNA文庫構建和克隆測序的方法，另一種是通過搜索公共數據庫中的表達序列標簽（EST）進行開發［11］。前者步驟復雜、工作量大、開發成本高，后者需要大量EST數據的支持。由于思茅松分子研究基礎較為薄弱，目前尚無其SSR標記開發及應用的報道。鑒于當前高通量測序技術發展迅速，測序成本顯著降低，利用高通量測序技術對植物進行轉錄組測序，其所產生的巨量數據中包含了大量的EST序列，基于此進行SSR標記開發無疑是便捷有效的方法［12，13］。因此，對思茅松EST-SSR標記進行系統性識別并開發專屬、穩定和有效的標記引物，對于推進思茅松遺傳多樣性及遺傳結構探索、開展種質資源的研究以及選育優良新品種（系）等工作有重要的理論和現實意義。

本研究以思茅松轉錄組測序數據為基礎，對59 636條Unigenes中的SSRs位點進行系統搜索和引物批量設計，對它們在轉錄組中的分布特征進行統計及分析，并且隨機挑選224對引物進行PCR驗證，旨在為思茅松的SSR分子標記開發和利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

轉錄組測序材料為云南省普洱市普文鎮普文林場的高產脂單株“KHR01”，采集其樹干韌皮部和形成層組織，液氮保存。2014年5月，經華大基因公司（北京）通過Illumina Hiseq2000進行轉錄組測序，共獲得59 636條Unigene，總長42 526 184 nt，平均長度713 nt。

SSR擴增所用思茅松樣本于2015年8月采自景谷林場和普文林場的2個人工林居群，每個居群各取21株單株樣本。樣品取健康的當年生針葉，硅膠干燥保存，用于DNA提取。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用DNAsecure Plant Kit（北京天根）試劑盒，提取思茅松各單株的基因組DNA，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，稀釋成20 ng/ μL，置于-20℃保存備用。

1.2.2 SSR序列 來源 使用軟件Micro Satellite（MISA）對59 636條Unigene進行SSR位點查找。查找標準：單、二、三、四、五、六核苷酸的最小重復次數分別為12、6、5、5、4、4次，并且SSR位點側翼序列長度≥50 bp。

用Primer5和Oligo7軟件進行引物設計和評價。設計引物時設置的主要參數為：GC含量40%-70%，退火溫度58-60℃，引物長18-25 bp，預期擴增產物長度100-300 bp，且無二級結構和二聚體。引物命名為YAFP加序號，如YAFP-001。

1.2.3 SSR引物篩選 隨機選取224對SSR引物，由Invitrogen（上海）公司合成。PCR擴增所用的2×Taq PCR Master Mix購自北京康為世紀生物科技有限公司。PCR反應體系（20 μL）為：Master Mix10 μL，DNA模版1 μL，Primer F與Primer R各0.4 μL，ddH2O 8.2 μL。利用BioRad基因擴增儀（T100）進行擴增，PCR擴增程序為：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環；72℃延伸5 min。

用6個思茅松單株DNA樣品的混合模板對224對引物進行初篩，PCR產物用2%瓊脂糖凝膠于5 V/cm下電泳60 min，電泳結束后EB染色，用GENE GENIUS凝膠成像系統進行觀察拍照，檢測有無明顯目的條帶。有目的條帶的引物再用思茅松12個DNA模版進行SSR引物復篩，檢測是否具有多樣性。

1.2.4 SSR遺傳多樣性分析 選擇12對條帶清晰、擴增結果穩定且具有多態性位點的引物，合成熒光標記引物，以2個居群的42個思茅松單株DNA樣品為模板，按照上述PCR反應體系及擴增程序進行SSR位點擴增。取1 μL PCR擴增產物，于ABI3730 DNA分析儀上進行毛細管電泳，并收集數據。用GeneMapper 4. 0軟件對收集的原始數據進行分析，通過內標讀取SSR標記片段的大小。按照大寫英文字母順序記錄等位基因，即同一位點最大的等位基因記為A，其余等位基因則依次記為B，C，D等；只有1個峰值的按照純合基因型處理。用POPGENE 1.31軟件統計分析等位基因數（Na）、Shannon信息指數（I），利用PowerMarker 3.25軟件計算多態性信息量（PIC）。

2 結果

2.1 思茅松轉錄組中SSR位點的分布特點

經過MISA軟件篩選，在思茅松轉錄組的59 636個Unigene序列中發現共3 745 SSR位點，SSR的分布頻率（SSR的個數與總Unigene的數量比）為6.28%。思茅松轉錄組中SSR重復單元的分布特征如表1所示。可以看出，思茅松轉錄組中SSR的主要重復類型是三核苷酸重復，占SSR位點總數的49%，其次為二核苷酸重復，占SSR總數的24%，其余核苷酸重復類型的數量較少，總計27%（表1）。

表1 思茅松轉錄組SSR分布特征

在出現頻率最多的三核苷酸重復中，出現頻率最高的核苷酸類型是AGC/CTG，占三核苷酸重復類型的24%；其次為AAG/CTT，占三核苷酸重復類型的20%；出現頻率第三和第四的分別是AGG/CCT和ATC/ATG，分別占三核苷酸重復類型的19%和12%；其余核苷酸類型的數量較少，總計25%（圖1）。

圖1 三核苷酸重復中不同重復單元比例

2.2 思茅松轉錄組SSR引物的有效性檢測

用6個思茅松單株樣本的DNA混合模板對224對引物進行初篩，其中123對引物擴增效果明顯，能夠獲得帶型清晰、與預期大小相符的目的片段，擴增率為54.91%。之后選用思茅松12個單株樣本的DNA模板對這123對引物進行復篩，得到帶型清晰且擴增穩定的引物共29對，占所有設計引物的12.95%。圖2展示了引物YAFP-04擴增12個模板的瓊脂糖凝膠電泳結果。圖3展示了引物YAFP-04分別擴增4個樣品的毛細管電泳結果。這29對引物擴增出的目的片段長度基本在100到280 bp，但經ABI3730毛細管電泳分析后，其中17對引物的擴增片段大小不符合SSR重復類型的倍數大小或存在較多的無效擴增，僅12對引物（表2）的擴增效率不低于85%，擴增結果的峰型清晰且具有多態性，用于后續的思茅松群體遺傳多樣性分析。

圖2 引物YAFP-04擴增12個樣本的瓊脂糖凝膠電泳結果

表2 12對SSR引物序列

表3 12對SSR引物的遺傳多樣性分析

2.3 思茅松遺傳多樣性分析

通過GeneMapper4.0軟件進行數據讀取，采用POPGENE 1.31和PowerMarker軟件進行統計分析，42個樣本在12個SSR位點檢測到的遺傳變異見表3。12對引物共檢測到35個等位基因，平均每對引物檢測到2.92個等位基因，其中引物YAFP-04在42個樣本中檢測的等位基因數量最多，為5個（圖3）。12個位點的多態性信息量（PIC）為0.093 2-0.480 9，平均為0.306 9。根據Botstein等［14］的理論，有4個標記為低度多態位點（0＜PIC＜0.25），8個標記為中度多態位點（0.25＜PIC＜0.5），無高度多態位點（PIC＞0.5），YAFP-11位點的PIC最高（0.480 9）。

圖3 引物YAFP-04對4個樣本的基因型分型結果

3 討論

思茅松轉錄組中微衛星種類豐富且數量眾多，從單核苷酸重復到6核苷酸重復都有出現，主要重復類型為二、三核苷酸重復類型，占到所有重復類型的73%，這與張振等［15］對紅松（Pinus koraiensis）轉錄組SSR標記的分析結果一致。同為松屬植物，紅松EST中的SSR重復類型也是以二核苷酸與三核苷酸重復類型居多，且以三核苷酸重復類型為主。大別山五針松（Pinus dabeshanensis）［16］也呈現相同結果，甘蔗（Saccharum officinarum）［17］和普通小麥（Triticum aestivum）［18］等農作物同樣是以三核苷酸重復類型為主，其三核苷酸重復類型分別為90%和67%。二核苷酸重復單元中AT／TA和AG／TC（占全部二核苷酸重復單元的88.28%）占主導地位，但GC/CG單元只出現一次，這一結果與黃海燕等人［19］在杜仲（Eucommia ulmoides）的轉錄組SSR中GC/CG單元只出現一次的結果一致，表現出明顯的偏倚性，這一結果可能與思茅松本身基因組特性有關。

從轉錄組數據中搜索SSR位點，搜索結果與搜索標準有關［19］。本項研究中，從思茅松59 636個Unigene序列中發現3 745個SSR位點，分布頻率為6.28%，略高于馬尾松（Pinus massoniana）（3.62%）［20］， 日 本 落 葉 松（Larix kaempferi）（3.85%）［21］及火炬松（Pinus taeda）（4.32%）［22］。思茅松轉錄組數據的Unigene序列總長為42 526 184bp，平均11.36 kb發現1個SSR位點，其SSR分布距離與楊樹（Populus，14.0 kb）［23］、銀杏（Ginkgo biloba，12.02 kb）［24］和胡椒（Piper nigrum，12.86 kb）［25］相近，低于橡膠（Hevea brasiliensis，3.93 kb）［26］、 茶 樹（Camellia sinensis，3.68 kb）［27］和柑 桔（Citrus，5.7 kb）［28］， 高 于 油 菜（Brassica napus）［29］、杜仲（26.13 kb）［19］等。這一方面說明本項研究設定的SSR位點搜尋標準較為適宜，另一方面也提示，當搜尋結果獲得的SSR位點數量較少而難以開發滿意數量的SSR標記時，可適當調整搜索標準。

通過轉錄組測序數據開發SSR標記是一種較為快捷有效的方法［30-32］。但由于針葉樹種的基因組序列（10 000-40 000 Mb）較為巨大，是擬南芥（Arabidopsis thaliana，114.5 Mb）的100倍以上，且重復DNA序列較多，導致針葉樹種的SSR標記開發成功率較低［33，34］。海岸松（Pinus pinaster）的成功率為7%［35］，中山杉（Taxodium ‘zhongshansa’）為16%［36］，冷杉（Abies alba）為24%［37］。本研究也表明思茅松SSR標記開發成功率較低，僅為5.36%（12/224）。但所獲得的12對引物經毛細管電泳檢測具有多態性，且成功的在2個居群42個思茅松樣本中進行了遺傳多樣性分析，后續可作為遺傳圖譜構建、基因定位及克隆等研究的理想分子標記。

4 結論

通過對思茅松轉錄組測序分析數據的Unigenes序列進行SSR位點搜索，得到3 745個SSR位點，SSR重復類型以三核苷酸為主（49%）；其次是二核苷酸（24%），主要重復單元分別為AGC/CTG和AT/TA。對其中的224個位點進行引物設計，最終篩選出12個擴增效率高、擴增條帶清晰的多態性位點。這12個SSR標記成功地運用到思茅松2個居群的42個樣本中，印證了利用轉錄組數據開發SSR標記的可行性，為思茅松種質資源的遺傳多樣性水平分析及變異水平的研究奠定了技術基礎。

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（責任編輯 李楠）

Development of SSR Molecular Markers Based on Transcriptome Data of Pinus kesiya var. langbianensis

ZHAO Neng1YUAN Xiao-long2MIAO Fu-jun2WANG Yi2CHEN Wei2LI Jiang2WU Tao2WANG Juan2
（1. College of Forestry，Southwest Forestry University，Kunming 650224；2. Yunnan Province Key Laboratory of Forest Plant Cultivation and Utilization，Yunnan Academy of Forestry，Kunming 650201）

In Simao pine（Pinus kesiya var. langbianensis）breeding programs，lack of co-dominant genetic markers constrains the development of molecular marker assisted breeding. The aim of this study is to develop SSR molecular markers using transcriptome sequencing data. Searching the SSR loci from 59636 unigenes of P. kesiya var. langbianensis with MISA software，total 3745 SSRs were obtained，accounting for 6.28% of the total unigenes，averagely one SSR per 11.36 kb. Trinucleotide and dinucleotide repeats were dominant types among SSRs with the ratio of 49% and 24%，and others were only 27%. AGC/CTG was the most trinucleotide motif and AT/TA was the most dinucleotide motif. The primers were designed and synthetized based on randomly selected 224 SSR loci，verification by agarose gel electrophoresis revealed that 29 loci showed clear polymorphism. While only 12 of the 29 loci satisfied the multiple fragments of SSR repeat motifs in capillary electrophoresis and their amplification efficiencies were higher than 85%. Genetic diversity of 42 Simao pine samples from Jingdong and Puwen populations was investigated with these 12 fluorescently labeled primers. A total of 35 alleles were detected，the polymorphism information content（PIC）of all loci ranged from 0.0932-0.4809（the mean was 0.3069）. Among these，4 loci were classified as lowly polymorphic ones（0 ＜ PIC ＜0.25）and 8 loci as moderately polymorphic ones（0.25 ＜ PIC ＜0.5）. Conclusively，these 12 SSRs may be used in future studies on genetic diversity，linkage mapping，gene location and cloning，providing the technical support for molecular marker assisted breeding and mutation in P. kesiya var. langbianensis.

Pinus kesiya var. Langbianensis；transcriptome；SSR；primer development

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.010

2016-10-24

國家林業公益性行業科研專項項目（201304105）

趙能，男，碩士研究生，研究方向：植物化學和分子生物學；E-mail：247677981@qq.com

吳濤，男，博士，副研究員，研究方向：林木遺傳育；E-mail：ynafwt@126.com王娟，女，博士，教授，研究方向：植物分子生物學和生物多樣性保護；E-mail：schima@163.com