利用放線菌酮提高黃素單氧化酶FMO_GS-OX1亞細胞定位的準確性

夏洪宇 孔穩穩 徐蕊 蒼煒 李晶

（東北農業大學，哈爾濱 150030）

利用放線菌酮提高黃素單氧化酶FMO亞細胞定位的準確性

夏洪宇 孔穩穩 徐蕊 蒼煒 李晶

（東北農業大學，哈爾濱 150030）

研究蛋白質亞細胞定位的常規方法是構建由35S啟動子驅動目的基因與綠色熒光蛋白基因（GFP）融合的表達載體，在細胞中瞬時或穩定表達來確定該蛋白質在細胞中的定位。35S啟動子的優勢是能夠獲得較強的GFP信號，但同時也可能因為蛋白質合成量過大，導致部分蛋白滯留在運輸途徑中或出現在其真實定位以外的區域。為了解決這一問題，以模式植物擬南芥中黃素單氧化酶FMOGS-OX1為例，利用蛋白質抑制劑放線菌酮處理過量表達FMOGS-OX1-GFP融合蛋白的煙草葉片。結果表明：未經放線菌酮處理的煙草葉片表皮細胞，細胞質和內質網中均呈現了較強的熒光信號，放線菌酮處理后，內質網上的信號消失，而細胞質則呈現出穩定的信號，因此判斷FMOGS-OX1合成后可能是經過內質網運輸到細胞質中的。上述結果證明適當的放線菌酮處理，能夠避免強啟動子驅動報告基因造成的蛋白質合成過量的問題，可有效地提高蛋白質亞細胞定位的準確性。

GFP；FMOGS-OX1；亞細胞定位；放線菌酮；內質網

綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）是一種發現于水母、珊瑚等動物體內的生物發光蛋白。當綠色熒光蛋白與生物有機體蛋白相融合時，能夠保持原有活性，其發光能力不受到影響，在熒光顯微鏡下可以清晰地觀測到融合蛋白的定位、運動和活性等情況［1］。由于GFP自發的熒光較為穩定，觀察具有容易操作、靈敏度高等優點，所以GFP作為報告基因已經被廣泛地應用于基因表達的組織定位及蛋白質的亞細胞定位研究中。GFP能夠在不破壞細胞和化學染色的情況下直接成像，也可用于活體實時定位和動態的研究［2，3］，基于上述原因GFP逐漸成為分子生物學和細胞生物學研究中的一種重要技術工具［4-7］。盡管GFP熒光蛋白的檢測有很多優點，但它并不能像酶一樣能將底物無限加工而使熒光信號放大，GFP在轉基因細胞中要有一定的轉錄本和轉錄后修飾才能產生成熟的GFP并適量積累才能觀測到細胞中的熒光信號。如果使用基因的內源啟動子可能出現熒光信號水平過低而難以檢測的問題，因此通常采用強啟動子來驅動GFP融合基因的強烈表達［8，9］。但由于GFP蛋白合成量過大，有時會導致部分蛋白滯留在運輸途徑中（如內質網或運輸囊泡中）或超出內源蛋白質的真實定位范圍，對蛋白質的準確定位造成混淆。

放線菌酮（Cycloheximide，CHX）是從灰色鏈霉菌中分離出來的一種化合物，對真核生物蛋白質的合成具有顯著的抑制作用，它可作用于80S核糖體，能夠干擾蛋白質合成過程中tRNA的移位因而阻礙翻譯過程［10，11］。由于放線菌酮能夠特異性地抑制新蛋白質的合成而不影響已經合成的蛋白在細胞內的運輸，因此常作為蛋白質翻譯過程的有效抑制劑，應用于蛋白的表達、細胞凋亡機制等代謝調控方面的研究，并在農學、醫學、藥學和分子生物學等研究領域中得到了廣泛的應用［12，13］。

本研究以黃素單氧化酶（Flavin-containing monooxygenase，FMOGS-OX1）的亞細胞定位研究為例，用放線菌酮處理過量表達FMOGS-OX1基因的煙草表皮細胞，控制FMOGS-OX1的產量，從而獲得了FMOGS-OX1的準確定位。芥子油苷是一種存在于十字花科植物中與植物生物脅迫抗性密切相關的次生代謝產物，FMOGS-OX1是芥子油苷合成途徑中的重要側鏈修飾酶，這種側鏈結構的修飾對芥子油苷的生物活性有很大的影響［14，15］。本研究討論了放線菌酮在植物蛋白質亞細胞定位研究中的應用，旨為提高蛋白質亞細胞定位的準確性提供技術方法上的參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 以擬南芥（Arabidopsis thaliana）和煙草（Nicotiana benthamiana）作為實驗材料。植物生長在溫度為20℃，相對濕度為70%，光合通量為100 μ Ei的植物培養箱中，16 h/8 h光/暗周期條件下培養。

1.1.2 菌株及試劑 大腸桿菌DH5α、農桿菌LBA4404、pCAMBIA 2300-35S-C-GFP載體由本實驗室提供、膠回收試劑盒、iScript cDNA合成試劑盒、DNA Marker DL2000、dNTP、Hotmaster Taq、DNA Ploymerase等購自TAKARA試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取與cDNA合成 選取擬南芥幼嫩的葉片提取總RNA，參照Trizol法提取，DNA酶Ⅰ處理后以備用。將提取好的RNA反轉錄成cDNA，cDNA合成具體方法參考 iScript cDNA合成試劑盒。

1.2.2 植物表達載體的構建 構建植物表達載體35S∶FMOGS-OX1-GFP，以上述獲得的cDNA為模板進行PCR擴增，采用特異性引物5'-GGCTTA AUATGGCACCAACTCAAAACA-CAATC-3'和5'-GGTTTAAUT GATTC GAGGAAATA-AGA AG-3'克隆FMOGS-OX1基因的CDS序列。PCR反應體系參照Hotmaster Taq說明書。將FMOGS-OX1基因的編碼區無終止密碼子的片段，采用USER法［16］克隆到pCAMBIA 2300-35S-C-GFP載體上，構建過量表達FMOGS-OX1和GFP融合基因的植物表達載體35S∶FMO GS-OX1-GFP，將連接好的產物轉入到大腸桿菌感受態細胞中，涂布于含有卡那霉素的LB培養基中篩選，挑取陽性單克隆菌落PCR鑒定并送去測序，將測序正確的質粒用于后續研究。

1.2.3 農桿菌法轉化煙草葉片 采用CaCl2法制備農桿菌LBA4404 感受態細胞，取1 μL 35S∶FMOGSOX1-GFP質粒加入農桿菌感受態菌液中，凍融法進行轉化。挑取農桿菌單菌落分別置于含有卡那霉素、鏈霉素和利福平的YEB液體培養基中篩選，于搖床中28℃ 200 r/min振蕩培養過夜，當菌液OD600約為0.6時3 000 r/min 離心10 min，棄上清液收集菌體，重懸于農桿菌接種緩沖液（4.8 g MES，5 mL1 mol/LMgCl2，乙酰丁香酮120 μm/L，pH值5.6）中，28℃活化3 h后，采用注射器吸入菌液1 mL，將菌液注入待測煙草葉片背面，輕輕的滲入葉片直到看到液體擴散，再侵染下一個葉片，具體實驗方法參考農桿菌滲入法［17］。

1.2.4 蛋白合成抑制劑放線菌酮處理 放線菌酮作為一種蛋白合成抑制劑能夠抑制蛋白的從頭合成，實驗采用5%放線菌酮處理轉基因35S∶FMOGSOX1-GFP煙草葉片1 h、3 h、5 h后對比未處理的35S∶FMOGS-OX1-GFP葉片進行亞細胞定位結果進行分析。

1.2.5 GFP檢測 采用農桿菌滲入法轉化煙草葉片，5 d后檢測葉片表皮細胞中的熒光信號。圖像采用LeicaSP2型激光共聚焦顯微鏡×20（NA0.7）或×60（NA1.2）倍鏡觀察，對材料進行照相采集。在488 nm波長下，光電子倍增調到525-565 nm范圍內檢測GFP。為降低非特異性不規則噪聲的影響，顯微鏡應用xy模式。在364-488 nm的不同光通道內，通過掃描采集圖像獲取連續的圖片。顯微鏡數據處理采用Image J。

2 結果

2.1 基因克隆與表達載體構建

選取擬南芥幼嫩的葉片提取RNA，以反轉錄所獲得的cDNA為模板，擴增得到FMOGS-OX1基因的CDS全長（圖1），電泳結果顯示PCR產物條帶位置與目的片段的大小一致，且測序結果正確。將PCR產物克隆到pCAMBIA 2300-35S-C-GFP載體上（圖2），轉入大腸桿菌中，檢測結果正確，表明35S∶FMOGS-OX1-GFP載體構建成功。檢測正確的菌液提取質粒，并將質粒轉入到農桿菌中，挑取單菌落進行PCR鑒定。鑒定結果與克隆的目的條帶一致（圖3），保留正確菌液以備煙草轉化用。

圖1 FMOGS-OX1基因的擴增

2.2 FMOGS-OX1亞細胞定位的結果

采用農桿菌滲入法將菌液注入煙草葉片，5 d后取瞬時表達35S∶FMOGS-OX1-GFP 的煙草葉片，通過激光共聚焦顯微鏡進行表皮細胞的觀察，發現熒光信號幾乎充滿了整個細胞，內質網的網狀結構清晰可見（圖4-B）。在這種情況下，由于熒光信號過于強烈，很難確定這些位置是否都是FMOGS-OX1行使功能的準確位置。為了降低熒光信號的強度，我們采用5%放線菌酮對轉基因煙草葉片進行了不同長度時間（1 h、3 h和5 h）的處理。結果表明，經5%放線菌酮處理1 h后（圖4-C），細胞內整體熒光信號顯著減弱，內質網的結構仍然清晰可見，處理3 h 后（圖4-D）熒光信號進一步減弱，內質網上的信號逐漸消失。由此我們推測內質網可能并不是FMOGS-OX1執行生理功能的最終位置，內質網可能只是負責FMOGS-OX1蛋白的修飾或運輸。放線菌酮處理后，新蛋白質的合成受到了抑制，而滯留在內質網上的蛋白質經修飾被釋放或運輸到目的地，因而信號逐漸消失。當放線菌酮處理達到5 h時（圖4-E），內質網上的熒光信號基本消失，而在細胞周邊區域熒光信號顯著加強，且隨著處理時間的延長熒光信號強度和位置趨于穩定。

對放線菌酮處理5 h以上的35S∶FMOGS-OX1-GFP葉片表皮細胞進行高倍鏡的觀察發現（圖4-F），熒光信號主要出現在細胞邊緣位置，在細胞內部可以清晰觀察到由于液泡的存在而形成的原生質索，因此這些熒光信號應該是來源于細胞質，在外圍靠近細胞膜的區域熒光信號較強烈，可觀察到一些顆粒狀的信號中斷（圖4-G），很可能是懸浮于細胞質中的葉綠體等細胞器形成的。由于熒光信號沒有呈現明顯的細胞膜的輪廓，我們推斷FMOGS-OX1應該特異性地存在于細胞質中，而且FMOGS-OX1在翻譯以后很可能經過內質網的加工和修飾或是經由內質網運輸釋放到細胞質中行使生理功能。

3 討論

在現代分子生物學研究中綠色熒光蛋白GFP已經成為一個非常重要的報告分子，能夠作為活細胞探針用于亞細胞定位的研究。對轉基因擬南芥、煙草等植物的研究表明，GFP對植物的生長發育不會產生毒害，因此采用GFP檢測蛋白的表達可以適用于活體實時定位和動態研究［18-20］。一般通過構建目的基因與綠色熒光蛋白相融合的表達載體，對其進行過量表達，通過對GFP熒光信號的檢測來分析該蛋白質在細胞內行使功能的位置［21］。為了研究FMOGS-OX1在細胞中行使功能的位置，我們構建了由CaMV35S啟動子驅動FMOGS-OX1與GFP融合基因的植物表達載體35S∷FMOGS-OX1-GFP，在煙草（Nicotiana benthamiana）細胞中進行瞬時表達。對芥子油苷合成酶FMOGS-OX1進行亞細胞定位研究時發現，在整個細胞尤其是內質網及細胞質中檢測到極強的GFP信號，我們推測很可能由于FMOGS-OX1被過量合成，導致部分蛋白滯留在合成、加工及轉運的位置上，干擾了對FMOGS-OX1的準確定位。很難判斷這些信號是否能代表FMOGS-OX1在細胞中執行功能的準確位置，為了獲得FMOGS-OX1真實的定位信息，避免信號過強帶來的困擾。我們采用放線菌酮對轉35S∷FMOGS-OX1-GFP 的煙草葉片細胞進行了處理，研究結果表明，經放線菌酮的處理，發現適當濃度和時間的放線菌酮處理后，細胞中內質網上的GFP信號逐漸減弱并消失，最后只有細胞質中可持續檢測到較強的GFP信號，證明FMOGS-OX1是在細胞質中行使功能的。我們推測FMOGS-OX1蛋白合成過程可能需要在內質網上進行修飾、濃縮等步驟，較強的GFP信號出現在內質網等亞細胞區域，可能是由于過量的蛋白質在運輸到細胞質之前暫時滯留在內質網上，需要在內質網上進行運輸，因此大量的熒光信號出現在內質網上。而經放線菌酮處理后，新蛋白質的合成受到了抑制，而內質網上的蛋白質被陸續運輸至細胞質中，因而在細胞質中觀察到了穩定的GFP信號。

圖2 35S∶FMOGS-OX1-GFP植物表達載體構建示意圖

圖3 35S∶FMOGS-OX1-GFP載體農桿菌菌落PCR鑒定

圖4 放線菌酮處理對35S∶FMOGS-OX1-GFP轉基因煙草表皮細胞中GFP熒光信號的影響

目前，在分子生物學中采用放線菌酮作為蛋白質合成抑制劑處理細胞來研究蛋白質定位及其他特性已經逐步被接受。Guirimand等［22］在研究長春花5-磷酸甲羥戊酸激酶，甲羥戊酸5-二磷酸脫羧酶和法尼基二磷酸合成酶的亞細胞定位時發現，組成型啟動子驅動的GFP融合基因表達信號出現在過氧化物酶體和細胞質中，利用放線菌酮處理后，信號則特異性地呈現在過氧化物酶體中，細胞質中的信號來自于過量合成的無法及時轉運到過氧化物酶體中的蛋白質。此外，他們的研究還發現，放線菌酮的濃度和處理時間在一定范圍內對實驗結果沒有影響，不會改變蛋白質的亞細胞的定位。在本研究中發現，農桿菌介導的滲入法轉化煙草葉片5 d后，用5%的放線菌酮處理5 h以上可以有效地抑制煙草葉片中GFP融合蛋白的過量累積，從而獲得較為適中的熒光信號強度對目標蛋白進行準確的亞細胞定位。這些參數對其他植物蛋白質亞細胞定位中放線菌酮的應用提供了有益的參考。除了用于蛋白質亞細胞定位研究，放線菌酮作為蛋白質合成抑制劑還可應用于蛋白質穩定性的分析，Poutrain等［23］將小長春花中Aux/IAA 蛋白與YFP融合，用放線菌酮處理后觀察生長素誘導該蛋白質的降解過程發現了該蛋白質的不穩定性。

綜合本次的研究結果和其他學者對放線菌酮的不同應用，可以證明放線菌酮作為一種高效的蛋白質合成抑制劑，在有效阻止新蛋白合成的同時，對已有蛋白質的功能不產生明顯的影響，因而可以在蛋白質研究中得到廣泛的應用。

4 結論

本研究證明放線菌酮可以作為一種蛋白質抑制劑應用于蛋白亞細胞定位的研究中，在蛋白質過量表達的情況下，通過抑制蛋白質的合成，避免蛋白質定位出現假陽性信號，獲得更為準確的定位信息。本研究發現，農桿菌介導的滲入法轉化煙草葉片5 d后，用5%的放線菌酮處理5 h以上可以有效地抑制煙草葉片中GFP融合蛋白的過量累積，從而獲得較為適中的熒光信號強度，對目標蛋白進行準確的亞細胞定位。這一結果為植物中其他蛋白質亞細胞定位的研究提供了參考數據。

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（責任編輯 狄艷紅）

Improving the Accuracy of FMOGS-OX1Subcellular Localization Using Cycloheximide

XIA Hong-yu KONG Wen-wen XU Rui CANG Wei LI Jing
（Northeast Agricultural University，Harbin 150030）

The conventional method of protein subcellular localization is to build the vector with the expression of fused target gene and green fluorescent protein gene（GFP）driven by 35S promoter. The subcellular localization of the target protein is then determined in the cells transiently expressing the fusion gene. Utilization of 35S promoter will lead to overexpression of the fusion gene and obtaining strong GFP signal. But sometimes the excessively synthesized protein will possibly remain in the transportation organelle or the areas exceeding the native protein location. The aim of this study is to solve this problem in the study of protein subcellular localization. To accurately determine the subcellular localization of Flavin-Containing Monooxygenase 1（FMOGS-OX1）in model plant Arabidopsis，a protein inhibitor，cycloheximide was applied to repress the over-expression of FMOGS-OX1-GFP fusion protein in tobacco epidermal cell. The results showed that before the treatment of cycloheximide，strong GFP signal was presented in both ER and cytosol. While after treated with cycloheximide，GFP signal disappeared in ER but remained in cytosol. This study demonstrated that proper treatment of cycloheximide may effectively avoid the excessive over-expression of the gene driven by 35S and thus is conducive to precisely determine the intercellular position where the protein facilitates its function.

GFP；FMOGS-OX1；subcellular localization；cycloheximide；endoplasmic reticulum

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.012

2016-10-28

國家自然科學基金基礎科學人才培養基金項目（J1210069），黑龍江省教育廳科學技術研究項 目（12531003）

夏洪宇，女，碩士，研究生，研究方向：植物學；E-mail：xiahongyu0708@sina.com

李晶，女，博士，教授，研究方向：植物次生代謝；E-mail：lijing@neau.edu.cn