水稻OsRhoGAP1基因的序列特征及表達特性分析

閆鑫甜 黃俊駿 樓晨 葛慧雯 梁衛(wèi)紅

（河南師范大學生命科學學院，新鄉(xiāng) 453007）

研究報告

水稻OsRhoGAP1基因的序列特征及表達特性分析

閆鑫甜 黃俊駿 樓晨 葛慧雯 梁衛(wèi)紅

（河南師范大學生命科學學院，新鄉(xiāng) 453007）

OsRhoGAP1是本實驗室前期從水稻幼穗cDNA文庫中分離獲得的功能未知基因。通過生物信息學和現(xiàn)代分子生物學技術(shù)，系統(tǒng)探討了水稻OsRhoGAP1的組織表達特性和不同激素處理下的表達情況。生物信息學分析表明，OsRhoGAP1具有植物RhoGAP蛋白典型的結(jié)構(gòu)特征，即CRIB基序和RhoGAP結(jié)構(gòu)域。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示該基因的表達具有時空特異性，幼苗期主要在根和葉中表達，幼穗期主要在幼穗和葉中表達，成熟期則主要在根中表達。同時，經(jīng)ABA、SA、GA和MeJA處理后，OsRhoGAP1基因表達量有明顯上調(diào)，經(jīng)IAA和6-BA處理后，OsRhoGAP1基因表達量出現(xiàn)顯著下調(diào)，表明該基因的表達受到多種激素調(diào)控。

水稻；OsRhoGAP1基因；序列分析；表達分析；植物激素

OsRhoGAP（Rho GTPase）是水稻Rho/Rop蛋白內(nèi)在酶的激活蛋白。OsRhoGAP最有代表性的功能就是作為信號網(wǎng)絡(luò)中Rho/Rop的活性調(diào)控組分，參與到依賴于細胞骨架重組和極性囊泡運輸?shù)然炯毎^程中，如細胞極性、細胞形態(tài)發(fā)生和細胞運動［1］。最初對RhoGAP的認識來自對動物細胞的研究，研究發(fā)現(xiàn)RhoGAPs的功能是作為Rho/ROP的相互作用蛋白，通過與GTP結(jié)合形式的Rho/ROP結(jié)合，激活后者內(nèi)在的GTP酶活性，促進其轉(zhuǎn)換成為GDP結(jié)合的失活形式，從而涉及多種細胞過程，包括運動、收縮、生長、分化和發(fā)育［2］。迄今，已從真核生物中分離鑒定的RhoGAPs有70余種，但是，對植物RopGAP的研究非常有限。

目前普遍認為植物RhoGAP/RopGAP涉及多種植物細胞生理過程，如參與了Rho/ROP對極性生長的調(diào)節(jié)。有研究顯示，擬南芥REN1（ROP1 enhancer 1）編碼的RopGAP蛋白能夠抑制花粉管頂端的AtROP1活性，該基因的缺失會影響花粉管的極性生長［3］。Ulrich通過轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炞C實，煙草NtRhoGAP1的保守氨基酸突變會導致花粉管膨大［4］，這與煙草Rho基因過表達的結(jié)果一致，說明NtRhoGAP1與NtRAC5的功能相關(guān)。大麥RopGAP蛋白MAGAP1與Rop家族成員RACB相互作用，調(diào)控根毛延伸過程［5］。此外，有研究表明，RopGAP還參與植物生物及非生物脅迫應(yīng)答。Baxter-Burrell等［6］發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtRopGAP4參與氧脅迫的耐受性調(diào)控；Hoefle等［5］則證實大麥中與微管結(jié)合的MAGAP1能通過調(diào)節(jié)微管骨架的動態(tài)變化，抵御真菌侵襲。植物中對煙草、擬南芥RopGAPs的研究已取得重要進展，但是有關(guān)水稻RhoGAP/RopGAP的研究尚未見報道。

水稻不僅是主要的糧食作物，而且是重要的模式植物。水稻育性控制的研究對于探討水稻產(chǎn)量形成具有重要意義。研究表明，水稻ROP基因OsRacD與水稻育性相關(guān)［7-9］。為了研究該基因在育性控制過程中的功能和作用機制，以該基因組成型激活形式G15V-OsRacD為誘餌進行酵母雙雜交篩選，從雌雄蕊形成期水稻幼穗中分離到一些潛在的相互作用蛋白編碼基因［10，11］，其中包括OsRhoGAP1（GenBank登錄號AY364310）。本研究基于實驗室的前期工作基礎(chǔ)，對水稻Rho蛋白OsRacD潛在互作蛋白編碼基因OsRhoGAP1進行了生物信息學和表達模式分析，旨在為深入研究該基因的功能及作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 水稻材料為粳稻栽培品種日本晴（Oryza sativa L. japonica.cv. Nipponbare），種植于河南師范大學生命科學學院水稻實驗基地（北緯35.18，東經(jīng)113.52）。

1.1.2 試劑 TRIzol總RNA提取試劑、實時定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒SYBR PrimeScript RT-PCR Kit、SYBR? Premix Ex TaqTM均購自大連寶生物公司。實驗所用的植物激素脫落酸（Abscisic acid，ABA）、吲哚乙酸（Indoleacetic acid，IAA）、水楊酸（Salicylic acid，SA）、赤霉素（Gibberellin，GA）、6-芐氨基嘌呤（6-benzyl aminopurine，6-BA）和茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate，MeJA）均購于北京鼎國生物公司。引物由北京金唯智生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 水稻材料的培養(yǎng)及處理 水稻種子以75%酒精消毒后，于2015年5月在水稻實驗基地播種，并進行常規(guī)管理。在水稻生長的幼苗期（30 d）、幼穗期（60 d）、成熟期（90 d）分別采集根、葉以及雌雄蕊形成期的幼穗，液氮速凍后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

植物激素處理采用的是水培法培育的水稻幼苗，水稻種子以75%酒精消毒后，于28℃黑暗培養(yǎng)2-3 d，萌發(fā)后轉(zhuǎn)移到人工氣候箱中培養(yǎng)（光照16 h，28℃ /黑暗8 h，25℃，光照強度16 000 lx）。整個過程以Yoshida［12］培養(yǎng)液培養(yǎng)，每天更換新鮮的培養(yǎng)液。待生長至三葉一心期（約14 d）進行激素（ABA、IAA、SA、GA、6-BA、MeJA）處理，處理方法為100 μmol/L植物激素反復噴灑水稻幼苗葉片，確保植株通過氣孔接受到激素刺激，分別取處理后0 h、3 h、6 h、12 h的葉組織，用液氮速凍后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 生物信息學分析 將OsRhoGAP1基因的cDNA序列提交生物信息學網(wǎng)站NCBI（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/），以Blastn檢索同源序列，并通過 ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf. html）確定其開放閱讀框；以Blastp和ScanProsite軟件分析OsRhoGAP1基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；并在水稻基因組序列數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih. gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi？ taxid=4530）中檢索，使用DNAMAN軟件分析OsRhoGAP1的基因結(jié)構(gòu)，將其基因結(jié)構(gòu)與檢索到的同源序列進行多序列比對，采用clustal1.81軟件和MEGA5.2.2軟件生成系統(tǒng)進化樹。

1.2.3 總RNA的提取及cDNA的合成 按照TRIzol總RNA提取試劑說明書，分別提取水稻根、葉以及雌雄蕊形成期的幼穗的總RNA，經(jīng)DNA 酶消化后，按照SYBR PrimeScript RT-PCR Kit試劑盒說明書要求，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.4 OsRhoGAP1表達的檢測 以水稻OsAct1［13］為內(nèi)參基因，采用 qRT-PCR檢測OsRhoGAP1基因的表達特征性。熒光定量PCR反應(yīng)體系為：cDNA 2 μL；2 x SYBR?Premix Ex TaqTM10 μL；PCR Forward/ Reverse primer（10 μmol/L）各0.4 μL（表1）；ROX Reference DyeⅡ（50x）0.4 μL；DEPC 水6.8 μL。使用ABI 7500 實時PCR 儀（Applied Biosystems）進行PCR 擴增。反應(yīng)采用兩步法PCR擴增標準程序：95℃ 30 s；95℃：5 s；60℃：34 s，進行40個循環(huán)。

記錄并保存各組擴增的CT值。數(shù)據(jù)分析采用ABI PRISM 7500型PCR儀自帶的SDS Software v 1.4軟件，以2-△△Ct法［14］分析基因表達水平，數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用Microsoft Excel軟件，顯著性分析采用Spass v19.0軟件。

表1 qRT-PCR引物對

2 結(jié)果

2.1 OsRhoGAP1的序列特征和同源性分析

將OsRhoGAP1基因cDNA序列進行Blastp檢索和ScanProsite工具分析，發(fā)現(xiàn)其中包含植物RhoGAPs兩個典型的保守結(jié)構(gòu)域，即CRIB基序和RhoGAP結(jié)構(gòu)域（圖1）。根據(jù)已報道的植物RopGAP序列特征，推測OsRhoGAP1的N端還缺少部分氨基酸。將OsRhoGAP1與通過Blastn檢索到的相似性100%的序列進行比對與拼接，再通過 ORF finder軟件分析，預(yù)測OsRhoGAP1的cDNA編碼區(qū)全長1 353 bp，編碼450個氨基酸和1個終止密碼。其中，89-102位和134-315位氨基酸分別對應(yīng)CRIB基序和RhoGAP結(jié)構(gòu)域。

將OsRhoGAP1的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行其同源性的比對分析，發(fā)現(xiàn)來自單子葉植物，如玉米、小麥、谷子的同源序列較多，而來自雙子葉植物的序列相對較少。選擇其中15個蛋白的序列與OsRhoGAP1進行比對，DNAMAN軟件分析的結(jié)果顯示，與單子葉植物中RhoGAP相比，OsRhoGAP1與水稻XP_015620392和EEC96414相似性分別達100%和90%，與高粱蛋白XP_002442-244、谷子蛋白XP_004962865和山羊草蛋白EMT-12220的相似性為99%，與玉米XP_008672984的相似性為96%；但在雙子葉植物中，OsRhoGAP1與擬南芥、煙草、木薯中Rop蛋白的相似性在86%以下。采用DNAMAN軟件進行多序列比對，結(jié)果（圖2）顯示它們的高同源性區(qū)段集中在RhoGAP結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域中包含3個保守的特征序列EGIF/YR，RELP和LNKMN。

利用clustal1.81軟件和MEGA5.2.2軟件以NJ法生成系統(tǒng)進化樹進行Bootstrap檢測。結(jié)果（圖3）顯示，在分析的所有序列中，OsRhoGAP1與水稻蛋白XP_015620392和EEC96414的進化地位最接近。

2.2 OsRhoGAP1基因的組織表達特性

以組成型表達的水稻肌動蛋白OsAct1基因［13］為內(nèi)參，通過實時定量PCR檢測OsRhoGAP1基因在水稻生長至幼苗期、幼穗期和成熟期時的根、葉、幼穗組織中的表達水平。結(jié)果（圖4）顯示，OsRhoGAP1在水稻的多種組織器官及不同的發(fā)育階段中均有表達，但表達水平差異明顯。在幼苗期，該基因主要在根中的表達，在根中的表達量為葉中的1.6倍；在幼穗期，該基因主要在幼穗和葉中表達，表達量分別達到根中的7.1倍和3.6倍；在成熟期，該基因主要在根中的表達，達到了葉中表達量的25倍。說明OsRhoGAP1的表達具有時空特異性，主要在細胞快速分裂的幼根、幼葉、幼穗組織以及成熟根中高表達，提示該基因可能與水稻生長發(fā)育分化有密切聯(lián)系。

圖1 OsRhoGAP1基因編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

圖2 OsRhoGAP1與其他植物RhoGAP氨基酸序列同源比對結(jié)果

圖3 OsRhoGAP1基于其他物種中的RhoGAP氨基酸序列聚合進化樹分析結(jié)果

圖4 OsRhoGAP1在水稻不同發(fā)育階段不同組織中的表達

2.3 激素對OsRhoGAP1基因表達的影響

為了檢測植物激素對OsRhoGAP1基因表達的影響，采用6種激素處理水稻幼苗，以實時定量PCR檢測幼苗地上部分在處理后0 h、3 h、6 h、12 h內(nèi)OsRhoGAP1基因的表達水平。結(jié)果（圖5）顯示，經(jīng)ABA、SA、GA和MeJA處理后，OsRhoGAP1基因表達水平均有明顯上調(diào)，但幅度不同。其中經(jīng)ABA、SA以及MeJA處理后，OsRhoGAP1基因的表達水平均在處理后6 h達到峰值，表達水平達到3倍以上，而后下降；而經(jīng)GA處理后，OsRhoGAP1基因的表達量持續(xù)上升直到12 h后達到峰值，表達水平達到6.4倍。經(jīng)IAA和6-BA處理后，OsRhoGAP1基因表達水平持續(xù)下調(diào)，到12 h后達到原來的0.05%以下。以上結(jié)果說明，在幼苗期，OsRhoGAP1基因?qū)?種激素（ABA、IAA、SA、GA、6-BA、MeJA）響應(yīng)比較靈敏，其中，ABA、SA、GA和MeJA均使該基因上調(diào)，而IAA和6-BA使該基因下調(diào)。

圖5 OsRhoGAP1在6種植物激素（SA、ABA、MeJA、GA、IAA、6-BA）處理下的表達分析

3 討論

Rho GTPase作為植物ROP家族的一員，與哺乳動物 Cdc42和Rac GTPases密切相關(guān)，RhoGAP在植物的許多生理過程中發(fā)揮了重要的作用，如Ca2+依賴的花粉管的生長、根毛發(fā)育、H2O2介導的細胞死亡、活性氧（ROS）的生成及植物激素應(yīng)答等［15-18］。在動物和真菌中的RhoGAP蛋白中很少發(fā)現(xiàn)CRIB結(jié)構(gòu)域，但是在大部分高等植物中，如煙草、擬南芥中兩種結(jié)構(gòu)域是同時存在的，RhoGAP高親和性特異性的調(diào)節(jié)不僅需要GAP 結(jié)構(gòu)域中的精氨酸催化劑堿基，而且還需要CRIB結(jié)構(gòu)域的催化機制［19，20］。

本研究對實驗室前期文庫篩選獲得的OsRhoGAP1進行序列分析和拼接，并進行同源檢索，確定該基因含有RhoGAP和CRIB兩個保守結(jié)構(gòu)域，以及RhoGAP結(jié)構(gòu)域中3個保守的典型催化序列。現(xiàn)有研究認為，作為植物RhoGAP特有的結(jié)構(gòu)，CRIB結(jié)構(gòu)域能夠調(diào)控RopGAP與Rop的互作。例如，擬南芥AtRopGAP1的CRIB結(jié)構(gòu)域增強了它對AtRop1的活性［15］；AtRopGAP1和AtRopGAP2的CRIB結(jié)構(gòu)域保守位點突變會影響其與Rop蛋白的結(jié)合［15，19］；煙草NtRhoGAP1的CRIB結(jié)構(gòu)域提高了它對Rop蛋白Rac5的活性［4］。推測OsRhoGAP1通過CRIB結(jié)構(gòu)域介導自身與OsRacD結(jié)合，并通過RhoGAP結(jié)構(gòu)域催化位點激活OsRacD內(nèi)在GTP酶活性，促進其結(jié)合的GTP水解為GDP，最終導致OsRacD失活。同時，前期實驗結(jié)果顯示，OsRhoGAP1只與激活形式的OsRacD結(jié)合，推測OsRhoGAP1只是單純介導GTP向GDP的轉(zhuǎn)換，而不參與其他過程。所以，本實驗所分離的OsRhoGAP1屬于RhoGAP亞家族成員。

同源性分析顯示，OsRhoGAP1與其他植物RhoGAPs在RhoGAP結(jié)構(gòu)域區(qū)段同源程度較高，這與Ulrich研究［4］相符，煙草RhoGAP1的RhoGAP結(jié)構(gòu)域與擬南芥AtRopGAP1、水稻AAX95236、百脈根AAC62624的RhoGAP結(jié)構(gòu)域的相似性分別達到72%、63%和62%。OsRhoGAP1與雙子葉植物RhoGAP相似性達到96%以上；但與單子葉植物RhoGAP相似性在86%以下。高度保守的RhoGAP催化結(jié)構(gòu)域提示了RopGAP在功能或調(diào)控效應(yīng)上的保守性。

水稻的生長發(fā)育是有規(guī)律的，在不同的發(fā)育階段具有不同的特性，如水稻幼苗期的主要發(fā)育特點是根系的生長、分蘗數(shù)增加、葉片增多；在幼穗期，水稻植株最顯著特征是出現(xiàn)幼穗的分化；在成熟期，水稻植株主要進行生殖生長，即籽粒的形成和充實，此時地上部分基本停止生長。已有研究表明RopGAP對植物頂端生長具有調(diào)控作用［3-5］，RhoGAP可通過調(diào)節(jié)F-肌動蛋白動力學來調(diào)控花粉管的生長［21］。因此，我們通過對OsRhoGAP1在水稻不同發(fā)育時期根、葉以及幼穗組織中的表達分析顯示，在幼苗期，OsRhoGAP1主要在根和葉中表達；在幼穗期，OsRhoGAP1的表達明顯集中于幼穗組織；在成熟期，OsRhoGAP1主要在根中表達。上述結(jié)果表明，水稻OsRhoGAP1基因的表達特性與水稻生長發(fā)育緊密聯(lián)系，尤其在快速分裂生長的組織中保持高表達水平。這可能與OsRacD的表達有一定的協(xié)同關(guān)系，暗示二者可能共同參與了水稻組織生長分化相關(guān)的調(diào)控過程。

植物激素是調(diào)控植物生長發(fā)育的重要信號分子，參與調(diào)控植物特定的生理過程。對該基因啟動子作用元件進行預(yù)測分析顯示，該基因啟動子區(qū)域有很多激素應(yīng)答元件，故本實驗檢測了6種植物激素對OsRhoGAP1表達的影響。結(jié)果顯示，ABA、SA、GA和MeJA能上調(diào)OsRhoGAP1的表達，尤其是GA上調(diào)幅度最為明顯，達6.4倍。已有資料顯示，GA參與種子發(fā)芽、莖的延長、花與果實的成熟過程［22，23］，ABA和SA有增強植物抗逆性的功能［24，25］，提示該基因的功能可能與激素信號介導的相關(guān)生理過程和抗逆性有關(guān)。本實驗室前期研究顯示，OsRacD的表達也受多種激素調(diào)控，ABA、GAs、6-BA能顯著上調(diào)OsRacD地上部分的表達量，IAA和SA則下調(diào)該基因在地上部分的表達量［26］。根據(jù)現(xiàn)有結(jié)果，ABA、GA均使OsRhoGAP1與OsRacD的表達上調(diào)，IAA使OsRhoGAP1與OsRacD的表達下調(diào)，鑒于OsRhoGAP1與OsRacD的結(jié)合特性，我們推測在植物激素的應(yīng)答反應(yīng)中，OsRhoGAP1可能通過調(diào)控OsRacD的活性來實現(xiàn)生物學功能，其作用機制有待于進一步研究。

綜上所述，OsRhoGAP1在水稻幼穗組織中高表達，提示OsRhoGAP1可能與水稻幼穗的發(fā)育分化過程相關(guān)。該基因的表達與ABA、SA、GA、MeJA、IAA和6-BA等植物激素密切相關(guān)，提示其功能可能涉及到植物生長發(fā)育中的多種過程。同時，在表達模式和激素響應(yīng)方面，OsRhoGAP1與OsRacD的表達有一定的協(xié)同關(guān)系，OsRhoGAP1與OsRacD的相互作用機制，有待進一步的研究。目前，本實驗室正在通過利用各種現(xiàn)代分子生物學技術(shù)對該基因進行功能鑒定，為系統(tǒng)解析其作用機制提供實驗依據(jù)。

4 結(jié)論

對OsRhoGAP1序列進行比對與拼接，預(yù)測OsRhoGAP1的cDNA編碼區(qū)全長1 353 bp，編碼450個氨基酸，具有植物RhoGAP蛋白典型的結(jié)構(gòu)特征，即CRIB基序和RhoGAP結(jié)構(gòu)域。水稻中OsRhoGAP1基因的表達具有時空特異性，主要在細胞快速分裂的幼根、幼葉、幼穗組織以及成熟根中高表達，尤其是幼穗組織。該基因的表達受ABA、SA、GA和MeJA的誘導，受IAA和6-BA的抑制。

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（責任編輯 李楠）

Sequence Characterization and Expression Analysis of OsRhoGAP1 Gene in Rice

YAN Xin-tian HUANG Jun-jun LOU Chen GE Hui-wen LIANG Wei-hong
（College of Life Sciences，Henan Normal University，Xinxiang 453007）

A function-unknown gene was isolated from a cDNA library of young spike of rice and designated as OsRhoGAP1. Based on the bioinformatics and modern molecular biology，we systematically surveyed its expression patterns at different development stages and under different hormones treatments. Bioinformatics analysis showed that OsRhoGAP1 had typical structural feature of plant RhoGAP protein，including CRIB motif and RhoGAP domain. qRT-PCR analysis revealed that OsRhoGAP1 gene presented specifically spatio-temporal characteristics，i.e.，relative high expression levels in root and leave at the seedling stage，in young panicle and leave at the panicle stage，and in root at the mature stage. Furthermore，the transcription of OsRhoGAP1 was strongly induced by ABA，SA，GA，and MeJA，but suppressed by IAA and 6-BA. It was speculated that the expression of OsRhoGAP1 was regulated by hormones.

rice；OsRhoGAP1gene；sequence analysis；expression analysis；plant hormones

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.014

2016-11-15

國家自然科學基金項目（31171182），河南省高?？萍紕?chuàng)新團隊支持計劃（15IRTSTHN020）

閆鑫甜，女，碩士研究生，研究方向：植物分子生物學；E-mail：yxt1004224081@163.com

梁衛(wèi)紅，女，教授，研究方向：植物分子生物學；E-mail：liangwh226@163.com