擬南芥FD與14-3-3/GRF7蛋白的相互作用研究

袁敏 王莉 葛偉娜 張嵐

（華北理工大學 生命科學學院基因組學與計算生物學研究中心，唐山 063000）

擬南芥FD與14-3-3/GRF7蛋白的相互作用研究

袁敏 王莉 葛偉娜 張嵐

（華北理工大學 生命科學學院基因組學與計算生物學研究中心，唐山 063000）

為了明確擬南芥FD與14-3-3/GRFs家族成員14-3-3/GRF7之間的互作關系，利用酵母雙雜交和雙分子熒光互補兩種技術分別做了研究。在酵母中，與陰性對照相比，共轉化FD-BD與14-3-3/GRF7-AD的酵母菌落在-Leu/-Trp/-His/-Ade四缺培養基上生長良好，表明在酵母中FD與4-3-3/GRF7之間存在直接的相互作用。在煙草中，與陰性對照相比，轉化FD-cYFP與14-3-3/ GRF7-nYFP，以及FD-nYFP與14-3-3/GRF7-cYFP載體的農桿菌共注射煙草細胞之后均在細胞核內觀察到很強的熒光信號，表明在煙草細胞中FD與14-3-3/GRF7之間存在直接的相互作用。兩種技術的結果共同證實FD與14-3-3/GRFs家族成員14-3-3/GRF7之間存在直接相互作用。

FD；14-3-3/GRF7；酵母雙雜交；雙分子熒光互補

堿性亮氨酸拉鏈（Basic leucine zipper，bZIP）轉錄因子是真核生物中最保守、分布最廣泛的一類轉錄因子。目前，科學家們已經在擬南芥、大豆、水稻等多個物種的基因組中發現了大量的bZIP轉錄因子家族成員［1-3］。這些不同家族的bZIP轉錄因子成員廣泛參與植物的生長發育、光信號轉導、病菌防御、對逆境脅迫的響應、花的發育、葉片衰老、種子成熟和植物激素信號轉導等多種生物學過程［4-7］。

近年來的研究表明，bZIP轉錄因子家族成員FD（bZIP14）及其同源基因FDP在植物開花控制過程中發揮重要作用，擬南芥fd突變體表現出非常明顯的晚花表型［8，9］，FD蛋白主要在頂端分生組織中表達。植物開花素蛋白FT在葉片中合成，經維管束的長距離運輸到達頂端分生組織，促進開花［10］。目前，已經在一些物種中證實，其FD同源蛋白與FT同源蛋白在頂端分生組織形成復合體發揮作用。玉米中，bZIP轉錄因子蛋白DLF1與玉米中FT的同源蛋白ZCN8在酵母中相互作用［11，12］。水稻中過表達OsFD1與水稻FT同源蛋白Hd3a能夠上調花分生組織識別基因OsMADS15的表達［13，14］。但是，這些FD同源蛋白與FT同源蛋白之間并不存在直接的相互作用，而是需要14-3-3蛋白的介導形成復合體。其中FT與14-3-3互作的證據主要來自番茄和水稻中同源蛋白的相互作用。番茄中，14-3-3的一個亞型14-3-3/74與番茄中FT的同源基因SP在酵母中直接相互作用，過表達番茄14-3-3能夠恢復SP缺失的表型［15］。在水稻中發現的8個14-3-3家族成員中，有4個與水稻FT的同源基因Hd3a相互作用。如果同時下調這4個水稻14-3-3蛋白的表達量，那么，因過表達Hd3a與OsFD1被上調的OsMADS15的表達量也會在一定程度上降低［16］。目前，FD與14-3-3互作的證據主要來自水稻同源蛋白。14-3-3蛋白識別的特異序列通常是R/K-S-X-P或者R/K-XX-S-P，在水稻中14-3-3蛋白正是與水稻OsFD1的C末端SAP結構域直接相互作用［14］。但是在擬南芥中，FD是否與14-3-3/GRFs之間存在直接的相互作用目前還不清楚，基于此，本研究利用酵母雙雜交和雙分子熒光互補技術來研究FD與14-3-3/GRF7之間的相互作用，旨為FT-14-3-3-FD蛋白復合體的存在提供更多的證據。

1 材料與方法

1.1 材料

酵母菌株AH109、酵母雙雜交載體PGADT7和PGBKT7、酵母轉化試劑、酵母培養基均購于Clontech公司；pCRTM8克隆試劑盒（K2520-20）和LR重組試劑盒（11791020）購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 酵母雙雜交載體的構建 使用FD基因特異性引物，cDNA作為模板擴增得到FD全長基因，利用pCRTM8克隆試劑盒將其構建到入門載體pCRTM8上，轉化大腸桿菌DH5α，菌落PCR和測序鑒定后獲得FD入門載體（FD-pCRTM8）。將FD-pCRTM8分別與目標載體PGADT7和PGBKT7利用LR重組試劑盒進行LR重組，轉化大腸桿菌DH5α，菌落PCR和測序鑒定獲得目標載體FD/PGADT7（FD-AD）和FD/PGBKT7（FD-BD）。

1.2.2 酵母雙雜交試驗 將0.5 μg FD-BD和0.5 μg 14-3-3/GRF7-AD共同加入到酵母感受態細胞中，室溫孵育過夜。42℃水浴中熱激30 min。冰上放置1-2 min。取適量酵母轉化液涂布在-Leu/-Trp雙缺固體培養基上，30℃培養箱中培養2-4 d直至克隆長出。各個對照組也利用上述方法進行轉化。待酵母克隆長至合適大小，挑取酵母單克隆溶于50-100 μL無菌水中，各吸取10 μL滴在-Leu/-Trp/-His/-Ade四缺固體培養基上，培養2-4 d觀察菌落生長情況。

1.2.3 BiFC載體的構建 利用LR重組試劑盒，將入門載體FD-pCRTM8和14-3-3/GRF7-pCRTM8分別與BiFC系統目標載體px-nYFP和px-cYFP重組，轉化大腸桿菌DH5α，菌落PCR鑒定和測序鑒定，獲得正確的目標載體后轉化農桿菌GV3101。

1.2.4 煙草注射與熒光信號的觀察 分別接種要注射的農桿菌于5 mL LB液體培養基中搖培過夜，室溫離心收集菌體，用注射緩沖液（10 mmol/L MES，pH5.6；10 mmol/L MgCl2，150 μmol/L acetosyringone）洗滌2-3次，每次離心3 000 r/min。利用注射緩沖液重懸菌體至OD600約為0.6-0.8，室溫緩慢搖培2-4 h。取等體積的兩種農桿菌液體混勻，用去掉針頭的注射器將混勻的農桿菌菌液緩慢注射入煙草葉片下表皮，并做好標記。注射好的煙草放回培養室培養36-48 h。取生長良好的煙草葉片，距針孔周圍5 mm處剪下大約5 mm的葉片，平放在載玻片上，用熒光顯微鏡觀察和拍照。

2 結果

2.1 酵母雙雜交載體的構建

使用FD基因特異性引物擴增得到858 bp的FD全長基因（圖1-A），利用pCRTM8克隆試劑盒將其構建到入門載體pCRTM8上，菌落PCR和測序鑒定后獲得FD入門載體（FD-pCRTM8）（圖1-B）。將FD-pCRTM8與目標載體PGBKT7利用LR重組試劑盒進行重組，獲得目標載體FD/PGBKT7（FD-BD）。

圖1 FD-pCRTM8入門載體的構建

2.2 酵母雙雜交試驗驗證FD與14-3-3/GRF7的相互作用

將FD-BD與14-3-3/GRF7-AD共 轉 化 酵 母AH109感受態細胞，同時共轉化AD與BD，AD與FD-BD，14-3-3/GRF7-AD與BD作為陰性對照。轉化后將酵母細胞涂布于-Leu/-Trp雙缺培養基上培養2-4 d。待酵母克隆長至合適大小，從每個平板上挑取3個酵母單克隆分別溶于50-100 μL無菌水中，各吸取10 μL滴在-Leu/-Trp/-His/-Ade四缺培養基上，培養2-4 d觀察菌落生長情況，相同的酵母菌液同時滴在-Leu/-Trp雙缺培養基上作為對照。生長2-4 d后，在保證酵母菌落在雙缺培養基上生長良好的情況下，觀察-Leu/-Trp/-His/-Ade四缺培養基上酵母菌落生長情況。共轉化AD與BD，AD與FD-BD，14-3-3/GRF7-AD與BD的酵母菌落在-Leu/-Trp/-His/-Ade四缺培養基上都沒有生長，而共轉化FD-BD與14-3-3/GRF7-AD的酵母菌落與陰性對照相比，生長良好（圖2）。結果表明，FD與14-3-3/GRF7在酵母中直接相互作用。

圖2 FD與14-3-3/GRF7在酵母中直接相互作用

2.3 BiFC試驗驗證FD與14-3-3/GRF7的相互作用

在酵母中驗證了FD與14-3-3/GRF7的相互作用之后，又進一步利用BiFC技術驗證FD與14-3-3/GRF7在煙草細胞中是否直接相互作用。首先將FD與YFP的C端（cYFP）融合，14-3-3/GRF7與YFP的N端（nYFP） 融 合 獲 得FD-cYFP和14-3-3/GRF7-nYFP融合載體。通過農桿菌介導的轉染技術將轉化有FD-cYFP與14-3-3/GRF7-nYFP的農桿菌菌液共注射到煙草葉表皮細胞中，36-48 h內在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光表達情況。轉化FD-cYFP與14-3-3/GRF7-nYFP載體的農桿菌共注射煙草細胞之后，在細胞核內觀察到很強的熒光信號（圖3-A）。而轉化FD-cYFP載體與px-nYFP（空載體）的農桿菌共注射煙草細胞之后沒有觀察到熒光信號（圖3-B）；轉化px-cYFP（空載體）與14-3-3/GRF7-nYFP載體的農桿菌共注射煙草細胞之后也沒有觀察到熒光信號（圖3-C）。

為排除標簽的影響，試驗中又做了標簽互換，將FD與YFP的N端（nYFP）融合，14-3-3/GRF7與YFP的C端（cYFP）融合，獲得FD-nYFP和14-3-3/GRF7-cYFP融合載體。結果顯示，轉化FD-nYFP與14-3-3/GRF7-cYFP載體的農桿菌共注射煙草細胞之后仍然在細胞核內觀察到很強的熒光信號（圖4-A）；而轉化FD-nYFP載體與px-cYFP（空載體）的農桿菌共注射煙草細胞之后沒有觀察到熒光信號（圖4-B）；轉化px-nYFP（空載體）與14-3-3/GRF7-cYFP載體的農桿菌共注射煙草細胞之后也沒有觀察到熒光信號（圖4-C）。

綜上所述，FD-cYFP和14-3-3/GRF7-nYFP在煙草細胞中共注射時，在細胞核內能觀察到很強的綠色熒光信號；FD-nYFP和14-3-3/GRF7-cYFP在煙草細胞中共注射時同樣在細胞核內觀察到很強的綠色熒光信號。由此說明，在煙草細胞中FD與14-3-3/GRF7之間存在直接相互作用。

圖3 FD-cYFP與14-3-3/GRF7-nYFP在煙草中直接相互作用

圖4 FD-nYFP與14-3-3/GRF7-cYFP在煙草中直接相互作用

3 討論

蛋白質作為生物體生命活動的主要承擔者，幾乎參與細胞中的每一個生理過程，諸如DNA包裝、基因表達調控、細胞信號轉導等。在蛋白質組學方面，關于蛋白質相互作用的研究是一個重點。蛋白間的相互作用會產生蛋白復合體，調控生物體的生命活動，研究蛋白質間的相互作用是了解生物體生命活力過程的關鍵。關于蛋白質相互作用的研究手段很多，如酵母雙雜交（YTH）、雙分子熒光互補（BiFC）、凝膠孵育（Overlay）、免疫共沉淀（Co-IP）等，這些技術各有其優缺點，互為補充。我們利用酵母雙雜交和雙分子熒光互補兩種技術共同證實了植物開花調控途徑中的轉錄因子FD和14-3-3/GRF7之間存在直接的相互作用。

植物的開花過程是一個受眾多因素調控的復雜過程。關于植物開花方面的研究一直是生物學領域研究的重點和難點，取得了很多重要的研究進展，但仍然存在很多未解決的問題。已有研究表明，植物的開花時間由光周期途徑、春化途徑、自主途徑和赤霉素途徑這4條途徑交互作用控制。在這些途徑的交匯節點處發揮關鍵作用的是一對同源基因FT與TFL1，二者發揮相反的作用，FT促進開花，TFL1抑制開花［17］。FT蛋白被稱作開花素，過去很長一段時間，人們認為FT蛋白是轉錄因子，直接調控下游基因的表達。直到后來人們才發現FT本身不是轉錄因子，而是在植物頂端分生組織處與轉錄因子FD形成蛋白復合體共同調控下游基因的表達［8，9］。近年來的研究結果又進一步在水稻中證實FT同源蛋白Hd3a與水稻FD蛋白復合體的形成需要14-3-3蛋白的介導［14］。本研究證實擬南芥中FD和14-3-3/GRF7直接互作，為擬南芥FT-14-3-3-FD蛋白復合體的存在提供了更多的證據。14-3-3蛋白也被稱作生長調節因子（GRFs），廣泛參與多種信號轉導通路以及介導多種信號通路之間的交互作用。14-3-3蛋白可以與多種蛋白結合，并且通常與磷酸化的蛋白結合，通過改變這些蛋白的活性、亞細胞定位、穩定性等發揮作用［18］。如在植物激素BR信號轉導通路中，14-3-3蛋白與磷酸化狀態的轉錄因子BZR1結合后，使BZR1滯留在細胞質中而不能進入細胞核調控下游基因表達［19］。那么，在植物開花調控中，14-3-3蛋白是否也通過改變FD或者FT蛋白的定位來發揮作用，其參與開花調控的分子機制目前還不清楚。此外，擬南芥中的FD蛋白第282位蘇氨酸（T282）可以被CPKs蛋白激酶家族成員CPK33和CPK6磷酸化［20］，因此T282是否參與FD蛋白與14-3-3蛋白GRF7的互作目前也不清楚。這些問題都值得進一步深入研究與探索，也將是我們今后工作的方向和重點。

4 結論

本研究構建了FD和14-3-3/GRF7基因的酵母雙雜交載體，利用酵母雙雜交技術證實了FD與14-3-3/GRF7之間存在直接的相互作用。其次，構建了FD與14-3-3/GRF7基因的雙分子熒光互補系統載體，利用雙分子熒光互補技術也證實了FD和14-3-3/GRF7之間存在直接的相互作用。兩種技術互為補充，互相印證，更加確定了結果的真實可靠。

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（責任編輯 馬鑫）

Studies on the Interaction Between FD and 14-3-3/GRF7 in Arabidopsis thaliana

YUAN Min WANG Li GE Wei-na ZHANG Lan
（Genomics and Computational Biology Research Center，College of Life Science，North China University of Science and Technology，Tangshan 063000）

In order to prove whether or not there is any interaction between FD and 14-3-3/GRF7 of 14-3-3/GRFs family，both yeast two hybrid and BiFC assays were performed. In yeast，the yeast colonies co-transformed with FD-BD and 14-3-3/GRF7-AD constructs grew well in -Leu/-Trp/-His/-Ade medium comparing with negative controls，indicating that FD directly interacted with 14-3-3/GRF7 in yeast. In tobacco，comparing with negative controls，the obvious YFP fluorescence signals were detected in the tobacco cells in which Agrobacterium co-transformed with FD-cYFP and 14-3-3/GRF7-nYFP，or FD-nYFP and 14-3-3/GRF7-cYFP vectors was injected，revealing that FD also directly interacted with 14-3-3/GRF7 in tobacco. The results by both assays confirm that there is direct interaction between FD and 14-3-3/GRF7 of 14-3-3/GRFs family.

FD；14-3-3/GRF7；yeast two hybrid；BiFC

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.017

2016-12-05

國家自然科學基金項目（31401212），河北省自然科學基金項目（C2014209134），唐山市科技局項目（14130274a）

袁敏，女，博士，研究方向：植物生長發育；E-mail：yuanmin308@163.com