一氧化氮(NO)對鎘脅迫下小麥幼苗氧化損傷的影響

馬曉麗冀瑞萍田保華霍建新

（1. 晉中學院生物科學與技術學院，晉中 030600；2. 山西大學生命科學學院，太原 030006）

一氧化氮(NO)對鎘脅迫下小麥幼苗氧化損傷的影響

馬曉麗1冀瑞萍1田保華2霍建新1

（1. 晉中學院生物科學與技術學院，晉中 030600；2. 山西大學生命科學學院，太原 030006）

為探討一氧化氮（NO）對重金屬鎘脅迫后小麥幼苗氧化損傷的影響。采用營養液水培法，以“晉麥8號”為材料，一氧化氮供體硝普鈉（SNP），NO清除劑牛血紅蛋白（Hb）及SNP類似物亞鐵氰化鈉（SF）分別處理小麥幼苗，研究NO在鎘（Cd）脅迫下對小麥幼苗抗氧化系統的影響。結果顯示，SNP處理可以緩解鎘脅迫對幼苗生長抑制，顯著增加可溶性蛋白、葉綠素和GSH含量，減少丙二醛（MDA）和過氧化氫（H2O2）的含量，并降低超氧陰離子（O2·-）產生速率、可溶性糖和脯氨酸的積累。而NO清除劑牛血紅蛋白（Hb）處理使鎘脅迫對小麥幼苗的毒害增強，SNP類似物亞鐵氰化鈉（SF）處理則沒有緩解效應；進一步實驗發現，SNP降低了鎘脅迫下超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽還原酶（GR）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）等抗氧化相關酶的活性，減輕了鎘脅迫的氧化損傷。NO可以通過調節抗氧化酶系統來緩解Cd對植物的毒害。

小麥幼苗；鎘脅迫；一氧化氮；氧化損傷

重金屬鎘（Cadmium，Cd）是植物非必需元素，具有高的毒性和移動性。隨著工業和農業生產，農田土壤受Cd污染越來越嚴重［1］。生長在Cd污染土壤中的作物，積累的Cd通過食物鏈進入人體，進而危害人類健康。鎘可導致植物細胞中活性氧產生、擾亂抗氧化系統、破壞光合作用、影響營養元素的吸收和運輸，最終致使作物品質和產量下降［2，3］。而植物本身可通過提高抗氧化系統酶活性、增加抗氧化劑產生、調節蛋白質水解、促進脯氨酸積累，提高色素含量，改善光合作用等途徑［4］，減輕鎘脅迫的傷害。

一氧化氮（Nitric oxide，NO）是一種廣泛分布于生物體內的小分子信號物質。近年來的研究發現NO參與植物生長發育［5］和響應非生物脅迫［6，7］等生理過程。用0.1 mmol/L硝普鈉（Sodium nitroprusside，SNP）浸種能顯著提高超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性，降低由NaCl處理引起的小麥氧化損傷［8］。在干旱條件下NO對小麥幼苗葉片的Ps II功能具有調節作用［9］。邱宗波等［10］發現微波預處理可防護鎘脅迫損傷小麥幼苗，其主要是通過NO起作用。在鎘脅迫下，NO還可增強水稻（Oryza sativa L. cv.）、小麥（T. aestivum L.）、大麥（Hordeum vulgare L.）、苜蓿（Medicago truncatula）、大豆（Glycine max L.）等幼苗的耐受性，且不同作物的緩解機制存在較大差異［11，12］。本研究在實驗條件下，以小麥幼苗為材料，采用NO外源供體SNP、SNP類似物亞鐵氰化鈉（Sodium Ferrocyanide，SF）、NO特異清除劑牛血紅蛋白（Hemoglobin Bovine，Hb）處理鎘脅迫下的小麥幼苗，研究NO對鎘誘導的氧化損傷的緩解效應，以期探討NO響應鎘脅迫的生理機制。

1 材料與方法

1.1 材料

晉麥8號（Triticum aestivum，Jinmai 8），由山西省農科院小麥研究所提供。NO和Cd2+的供體及適宜濃度已由預備試驗完成：CdCl2提供Cd2+；硝普鈉（［Na2Fe（CN）5］NO，SNP，Sigma公司）提供NO，4℃避光保存，現配200 μmol/L的母液，再按所需濃度稀釋現用；牛血紅蛋白（Hb，Sigma公司）為NO的清除劑。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 試驗在山西大學溫室內進行。選取籽粒飽滿，大小均勻的小麥種子，經0.1% HgCl2表面消毒后，培養于盛有濕濾紙的培養皿內，30粒/盤，25℃催芽。種子露白時，轉移至光照培養室（生長條件光照16 h/d，光通量密度400 μmol/（m·s）），25℃培養，相對濕度60%，每3 d澆灌1次1/2 Hoagland營養液。生長20 d后，挑選長勢基本一致的幼苗洗凈轉入裝有1/2 Hoagland營養液的水培盆中預培養，預培養3 d后開始處理。試驗設置7種處理：（1）CK（1/2 Hoagland營養液）；（2）SNP（1/2 Hoagland營 養 液+100 μmol/L SNP）；（3）Cd（1/2 Hoagland營養液+100 μmol/L CdCl2）；（4）Cd+SNP（1/2 Hoagland營養液+100 μmol/L CdCl2+100 μmol/L SNP）；（5）Cd+SF（1/2 Hoagland營養液+100 μmol/L CdCl2+100 μmol/L亞鐵氰化鈉）；（6）Cd+Hb（1/2 Hoagland營養液+100 μmol/L-CdCl2+0.1% Hb）；（7）Cd+Hb+SNP（1/2 Hoagland營 養 液 +100 μmol/L CdCl2+0.1% Hb+100 μmol/L SNP）。各處理重復3次，為保證處理濃度穩定，每隔2 d更換一次處理液，間歇通入空氣。處理7 d后，取相同節位的葉片用于分析測定。

1.2.2 測定項目與方法

1.2.2.1 株高測定 取不同處理長勢一致的20株小麥幼苗，用直尺測量小麥幼苗株高（cm）。

1.2.2.2 有機物質生理指標的測定 參考張志良等［13］的方法略作改進測定可溶性糖含量，采用紫外吸收法測定可溶性蛋白含量［14］，脯氨酸含量和葉綠素含量的測定采用李合生等［15］的方法進行。

1.2.2.3 膜質過氧化產物含量和自由基含量的測定 硫代巴比妥酸法測定丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量［14］，過氧化氫（Hydrogen peroxide，H2O2）含量測定采用Velikova等［16］的方法，超氧陰離子產生速率測定參考王愛國等［17］的方法。

1.2.2.4 抗氧化酶活性測定 提取小麥幼苗葉片的粗酶液，5 000 r/min離心3 min，取上清液測定超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）酶活參照Velikova等的方法［16］；谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，GR）活性測定參照Brennan等的方法［17］。還原型谷胱甘肽（Reduced glutathion，GSH）含量測定［18］。

1.2.3 數據處理 所有數據均采用3個生物學重復的平均值，差異顯著性分析采用SPSS 13.0（IBM，New York，USA）軟件進行t檢驗，然后用SigmaPlot10.0（Systat Software Inc.，London，UK）軟件進行繪圖。

2 結果

2.1 NO對鎘脅迫下小麥幼苗株高的影響

圖1顯示，與CK相比，鎘脅迫抑制小麥幼苗生長，株高降低41.0%（P＜0.01）；SNP+Cd處理緩解了鎘脅迫對幼苗生長的抑制，株高只降低13.7%（P＜0.05），Hb+Cd處理顯著抑制了小麥幼苗的生長，株高降低45.7%（P＜0.01）。與SNP+Cd相比，SNP+Hb+Cd處理的SNP緩解作用被Hb抑制，具有顯著差異（P＜0.05）；而SF+Cd處理沒有緩解作用。

圖1 NO對鎘脅迫下小麥幼苗株高的影響

2.2 NO對鎘脅迫下小麥幼苗有機物質含量的影響

鎘脅迫下小麥幼苗脯氨酸和可溶性糖含量分別比CK增加1.6倍和38.8%，可溶性蛋白和葉綠素含量分別降低28.9%和17.3%。與Cd相比，SNP+Cd處理使可溶性蛋白和葉綠素含量升高，游離氨基酸和可溶性糖含量降低；Hb+Cd處理進一步顯著提高脯氨酸和可溶性糖含量（P＜0.05），降低了可溶性蛋白和葉綠素含量（P＜0.05）。與SNP+Cd相比，SNP+Hb+Cd處理使脯氨酸增加17.5%，可溶性糖含量升高8.6%，可溶性蛋白減少5.4%，葉綠素含量降低7.8%，Hb抑制SNP的作用。而亞鐵氰化鈉處理使小麥幼苗中可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸和葉綠素含量與鎘處理無顯著差異（P＞0.05）（圖2）。

圖2 NO對鎘脅迫下小麥幼苗有機物質含量的影響

2.3 NO對鎘脅迫下小麥幼苗膜質過氧化產物和自由基含量的影響

鎘脅迫下小麥幼苗葉片中MDA和H2O2的含量及O2·-產生速率顯著增加，葉片中MDA和H2O2含量及O2·-產生速率分別比CK增加65.7%、62.2%和31.2%，且差異顯著（P＜0.05）。與Cd相比，SNP+Cd處理降低了MDA和H2O2含量及O2·-產生速率（P＜0.05）。鎘脅迫下，添加NO清除劑Hb處理使MDA和H2O2含量和O2·-產生速率增加，Hb處理下添加SNP則減少了MDA和H2O2的含量及降低O2·-產生速率。與SNP+Cd處理相比，亞鐵氰化鈉+Cd處理的幼苗中MDA和H2O2含量和O2·-產生速率顯著增加（P＜0.05）（圖3）。

圖3 NO對鎘脅迫下小麥幼苗膜質過氧化產物和自由基含量的影響

2.4 NO對鎘脅迫下小麥幼苗抗氧化系統的影響

與CK相比，鎘脅迫處理降低了小麥幼苗葉片中CAT和APX活性，而SOD和GR活性顯著提高，GSH含量顯著增加。與Cd相比，SNP+Cd處理使CAT、APX和GR活性顯著升高，分別升高26.1%、12.6%和97.3%，GSH含量提高1.43倍（P＜0.05），而SOD活性降低30%。Hb+Cd處理的SOD、CAT和APX活性與Cd處理比無顯著差異（P＞0.05），而GR活性僅為Cd的83.8%（P＜0.05），GSH含量降低3.1%。添加SNP可緩解了Hb+Cd處理對SOD、APX、GR活性的影響。亞鐵氰化鈉對鎘脅迫下小麥幼苗葉片SOD、CAT、APX和GR活性與Cd處理無顯著差異（P＞0.05）（表1）。

3 討論

在生理條件下，細胞間活性氧（ROS）水平和NO的產生是平衡的，它們可促進下游信號或翻譯后修飾。在鎘脅迫的植物的細胞水平上，氧化應激增加體內ROS積累，從而干擾了酶與非酶的抗氧化系統；同時也擾亂了NO合成的水平，進而導致ROS/NO的不平衡［19］。研究發現不同的NO供體可用來模擬植物體中內源NO的響應［20］。目前，NO供體包括SNP、S-亞硝基谷胱甘肽（Nitrosoglutathione，GSNO）、S-亞硝基-N-乙酰-D-青霉胺（S-nitroso-N-acetyl-D-penicillamine，SNAP）［20］和亞硝酰乙二胺四乙釕（II）（Nitrosyl ethylenediaminetetraacetate ruthenium（II），［Ru（NO）（Hedta）］）［21］等。Floryszak-Wieczorek等［20］研 究 發 現SNP、GSNO和SNAP的半衰期分別為12、7和3 h，且SNP是最適的光敏感NO供體。Osti等用SNP和［Ru（NO）（Hedta）］分別處理巴西松（Araucaria angustifolia）胚胎懸浮細胞21 d后，細胞內源NO水平都升高且SNP處理的NO含量顯著高于［Ru（NO）（Hedta）］處理［21］。同時，SNP廣泛地當作NO供體來增強黑麥草［22］、小麥［8，9，23］和苜蓿［24］等植物對非生物脅迫的耐受性。本研究發現外源100 μmol·L-1SNP顯著減少鎘脅迫下幼苗體內H2O2含量和降低O2·-產生速率，同時增強CAT、GR和APX活性，降低SOD活性。與本研究結果類似，劉建新等［22］發現，外源150 μmol/L SNP顯著促進鎘脅迫下黑麥草幼苗根系和葉片中CAT活性，從而降低H2O2含量及O2·-產生速率。25和100 μmol/L SNP誘導Pb脅迫下小麥幼苗葉片中CAT的活性［23］；100 μmol/L SNP顯著增強紫花苜蓿幼苗SOD活性，增強葉和莖中GR活性，而顯著降低根中GR活性［24］。

表1 NO對鎘脅迫下小麥幼苗抗氧化系統活性的影響

在植物細胞中，Cd可以結合含硫殘基的化合物，如GSH、MTs和PCs［4］。其中，GSH具有直接清除ROS的能力，本研究發現100 μmol/L SNP處理使鎘脅迫下的小麥幼苗GR活性及GSH含量顯著上升，減少MDA和H2O2含量及降低O2·-產生速率。陳銀萍等也發現不同濃度SNP處理也能增強鎘脅迫下紫花苜蓿（Medicogo sativa L.）幼苗GR活性［24］。NO還可以通過蛋白質的硝基化和巰基亞硝基化來發揮生理功能［25］。在擬南芥中，血紅蛋白（Hb1）、S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS1）、半胱氨酸蛋白酶9（Mc9）、三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）、水楊酸結合蛋白3（SABP3）、甘氨酸脫羧酶復合物（GDC）和NADPH氧化酶等蛋白被證實NO可對其進行巰基亞硝基化修飾，進而抑制這些蛋白的活性［25］。蛋白硝基化研究顯示在向日葵下胚軸［26］和水稻［27］中的GR蛋白分別為酪氨酸硝基化和巰基亞硝基化的靶點。然而，Begara-Morales研究發現ONOO-和GSNO可抑制豌豆的單脫水抗壞血酸還原酶（Monodehydroascorbate reductase，MDAR）的活性，而對葉綠體和胞質中的GR無影響，進而維持胞內還原型GSH的平衡［28］。Innocenti等［29］發現NO處理可以上調蒺藜苜蓿根（Medicago truncatula）中谷胱甘肽合成酶編碼基因（gshs）的表達，表明NO忙于GSH合成相關基因表達的調控。由此可知，NO可以調控體內GSH水平的變化，來解毒重金屬Cd的毒性，從而增強植株抵抗氧化脅迫。

SNP釋放的NO作為信號分子，一方面能直接調節ROS代謝，但不同物種之間NO對抗氧化酶活性調節存在差異，這可能與NO在信號傳導過程中不同的酶所在的位置有關。現已知NO可直接作用于抗氧化酶類中血紅素鐵結合來改變活性［24，30］。另一方面NO通過信號網絡來調節響應機制，如其他信號分子H2S、H2O2、SA、JA等［19］，一起協同作用來調節抗氧化酶類蛋白。

4 結論

NO增強小麥耐受鎘脅迫，主要表現在可溶性蛋白、葉綠素和GSH含量的增加，MDA和H2O2含量的減少，O2·-產生速率的降低，可溶性糖和脯氨酸積累的減少。在鎘脅迫下，NO可調節超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽還原酶（GR）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）等抗氧化酶類的活性，來緩解Cd對小麥的氧化損傷。

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（責任編輯 馬鑫）

Effects of Nitric Oxide on Oxidative Damage Metabolism in Wheat Seedling Under Cadmium Stress

MA Xiao-li1JI Rui-ping1TIAN Bao-hua2HUO Jian-xin1
（1. College of Life Science，Jinzhong University，Jinzhong 030600；2. College of Life Science，Shanxi University，Taiyuan 030006）

This study is to further study the response mechanism of nitric oxide gas signal on oxidative damage of wheat seedlings under cadmium（Cd）stress. Through nutrient solution cultivation，Triticum aestivum ‘Jinmai 8’ was selected as the plant material，and nitric oxide（NO）-donor sodium nitroprusside（SNP），NO-scavenger haemoglobin（Hb），and sodium ferrocyanide（SNP analogue）were used to investigate the effects of NO on oxidative damage metabolism in seedlings under Cd stress. The results showed that SNP alleviated the growth inhibition in wheat seedlings，significantly increased the contents of soluble protein，chlorophyll and glutathion，decreased the contents of malondiadehyde（MDA）and hydrogen peroxide（H2O2），as well as the production of O2·-，and the accumulations of soluble sugar and proline. However，the NO-scavenger hemoglobin treatment increased the toxicity of Cd stress to wheat seedlings，and the SNP analogue treatment presented no effect. Meanwhile，SNP decreased the activities of superoxide dismutase（SOD），catalase（CAT），glutathione reductase（GR）and ascorbate peroxidase（APX），which eliminated the oxidative damage under Cd stress. Conclusively，NO alleviates Cddamage by regulating the antioxidase system.

wheat seedlings；cadmium stress；nitric oxide；oxidative damage

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.015

2016-09-20

國家自然科學基金項目（31501772），山西省高等學校科技創新基金項目（20101129）

馬曉麗，女，副教授，博士研究生，研究方向：細胞生物學；E-mail：mxl425@126.com