蒙古沙冬青AmMYB4-like基因的克隆與表達分析

肖自華 高飛 孫會改 周宜君

（中央民族大學生命與環境科學學院，北京 100081）

蒙古沙冬青AmMYB4-like基因的克隆與表達分析

肖自華 高飛 孫會改 周宜君

（中央民族大學生命與環境科學學院，北京 100081）

基于已有研究工作基礎，從蒙古沙冬青［Ammopiptanthus mongolicus（Maxim）Cheng. f］中分離到1個編碼MYB類轉錄因子基因，命名為AmMYB4-like。該序列長度為1 145 bp，含有一個由960 bp 組成的開放閱讀框，編碼319個氨基酸，具有R2和R3保守結構域，屬于R2R3-MYB轉錄因子。熒光定量PCR分析結果表明，AmMYB4-like 在葉片中參與低溫和干旱脅迫應答，在根中主要參與干旱脅迫應答。構建了pPZP212-AmMYB4-like 植物表達載體，旨為進一步研究AmMYB4-like 的功能奠定基礎。

蒙古沙冬青；AmMYB4-like；基因克隆；表達分析；植物表達載體構建

MYB類轉錄因子是迄今為止在植物中發現的成員數量最多的轉錄因子。自1987年Paz-Ares等［1］從玉米中克隆得到與色素合成相關的MYB類轉錄因子基因（C1）以來，已經從多種植物中分離和鑒定了大量的MYB類轉錄因子，如擬南芥中198個［2］、水稻中183個［3］、蘋果中229個［4］、甜橙中177個［5］、谷子（Setaria italica）中209個［6］，獲得MYB類轉錄因子的成員數量在100以上是普遍的。結構上，MYB轉錄因子各家族成員的N-端具有高度保守的結構域，即DNA binding 結構域，也稱為MYB結構域，由1-4個不等的MYB重復單元組成。根據MYB結構域所含重復單元個數，將MYB轉錄因子劃分為4種類型：4R-MYB（4個MYB重復單元）、3R-MYB（3個MYB重復單元）、R2R3-MYB（2個MYB重復單元）以及MYB-related（1個或部分MYB重復單元），其中R2R3-MYB類轉錄因子數量最多［7-9］。

隨著對植物中更多的MYB轉錄因子的功能解析，人們發現不同類型的MYB轉錄因子具有不同的功能，參與生長發育、細胞形態建成、激素和環境因子應答等許多生命活動過程的調節，特別是參與植物初級和次級代謝的調節［10］。研究表明，擬南芥的類黃酮合成途徑相關基因（如EBGs和LBGs）受AtMYB11及AtMYB75等調控［8，9］，棉花的GmMYB042基因的過表達使轉基因煙草的類黃酮代謝途徑部分關鍵酶基因（如PAL、CHS 和FLS）的表達量明顯上升［10］，玉米的ZmMYB111和ZmMYB148可同時調節PAL基因，涉及類黃酮和木質素的合成［11］。

蒙古沙冬青（A. mongolicus）是我國西北荒漠地區唯一的強旱生常綠闊葉灌木，同時也是阿拉善荒漠區特有的建群物種，對維持當地生態平衡發揮至關重要的作用。沙冬青長期生活在干旱、低溫等逆境環境中，具有極強的抗旱、抗寒能力，其形態結構和生理方面都有與之相適應的特征，這為提高水分的利用率、應對水分虧缺、極端嚴寒、高溫、風蝕沙埋等逆境環境提供了條件［12，13］，因此沙冬青是研究植物抗逆機理和篩選抗逆基因的資源植物，具有重要的科學研究價值。

近年來，基于現代分子生物學技術的發展，通過轉錄組測序構建了蒙古沙冬青正常與逆境脅迫下的轉錄本數據庫，為篩選抗逆響應基因、研究抗逆應答機理提供了大量的數據［14-17］，同時，人們研究了沙冬青中重要的功能基因（包括編碼轉錄因子基因）的結構和響應逆境的表達特征，如AmCBL1［18］和AmDREB2［19］等，但關于蒙古沙冬青中的MYB轉錄因子基因的研究還未見報道。近來，本實驗室的研究表明，干旱脅迫下MiR858通過上調MYB轉錄因子的表達而調節類黃酮類物質的合成［20］。由于植物中MYB類轉錄因子數量最多，且參與多種生物學過程，因此，本研究基于本實驗室前期構建的蒙古沙冬青轉錄本數據庫，對獲得的AmMYB4-like基因進行了相關研究，旨在為闡釋MYB類轉錄因子在蒙古沙冬青逆境應答中的特點提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料

蒙古沙冬青（A. mongolicus）種子采自寧夏回族自治區中衛縣。播種于盛有蛭石：珍珠巖：營養土（3:1:1）浸濕的混合土壤的塑料盆中，光照16 h（23℃）/黑暗8 h（18℃），光照強度93 μmol· m-2·s-1，空氣濕度30%-40%。種子發芽后，每周澆一次水。生長8周后，分別以20% PEG6000模擬干旱脅迫、以4℃低溫培養進行低溫脅迫，脅迫時間分別為0 h、1 h、6 h、24 h、7 d，以0 h為對照。分別收獲葉片和根組織，液氮速凍，-80℃冷凍保存。每個處理設置3個生物學重復。

Trizol試 劑 購 自 Invitrogen公 司，FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒、熒光定量試劑盒SYBR Green和無縫重組試劑盒（EasyGeno）購自天根生化（北京）有限公司，KOD FX Neo PCR克隆酶購自東洋紡（上海）生物科技有限公司，膠回收試劑盒購自愛思進生物技術（杭州）有限公司，大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態細胞購自北京博邁德科技發展有限公司，質粒小量抽提試劑盒購自百泰克生物技術有限公司，AT克隆載體購自北京全式金生物。植物表達載體pPZP212為本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 基因分離 根據本實驗室構建的蒙古沙冬青干旱轉錄本數據庫，篩選表達量較高的MYB基因序列作為候選基因，設計引物序列（表1）。用Trizol法提取蒙古沙冬青葉片和根總RNA，cDNA第一鏈合成按天根FastQuant RT kit說明書進行。反應體系（50 μL）：第一鏈cDNA 1 μL、10 mmol/L正向引物1.5 μL、10 mmol/L反向引物 1.5 μL、2 mmol/L dNTPs 10 μL、2×PCR Buffer for KOD Fx Neo 25 μL、1 U/μL KOD FX Neo 1 μL及ddH2O 10 μL。PCR擴增條件：94℃預變性2 min，98℃變性10 s，61℃退火30 s，68℃延伸60 s，循環34次。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收目的片段，送至生工（上海）測序。

1.2.2 序列分析 將獲得的基因序列在NCBI網站進行BLAST查詢，獲得相關同源基因信息。使用在線的ORF（Open reading frame，ORF）查詢網站確定基因的ORF（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）。用于進化樹分析的序列來源于NCBI數據庫。用MEGA5.1軟件進行蛋白序列比對及進化樹分析，用鄰接法（Neighbor-Joining）構建系統進化樹。使用在線軟件（http://web.expasy.org/compute_pi/）預測等電點及相對分子質量大小，使用在線軟件（http://www. csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc/）對亞細胞定位進行預測，使用NetPhos3.1Serve在線軟件（http://www. cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預測磷酸化位點。使用在線軟件（http://weblogo.berkeley.edu/examples.html）進行保守結構域分析。

1.2.3 脅迫條件下的基因表達分析 用Trizol法提取20% PEG6000及4℃低溫處理的蒙古沙冬青葉片和根的總RNA，反轉錄合成單鏈cDNA。將單鏈cDNA產物濃度稀釋5倍后作為熒光定量PCR反應的模板。在熒光定量PCR儀MYIQ2（Bio-Rad）上進行熒光定量PCR擴增，引物序列見表1。反應體系（20 μL）：2×FastFire qPCR PreMix（with SYBR Green I）10 μL、ddH2O 7 μL、10 mmol/L上下游特異引物（見表1）各1 μL和cDNA 1 μL。擴增條件：95℃預變性1 min，95℃變性5 s，55℃退火10 s，72℃延伸15 s，循環40次。以蒙古沙冬青AmeIF1基因為內參基因［21］。采用2-△△Ct方法計算目的基因的相對表達量。

表1 基因特異引物序列

1.2.4 植物表達載體的構建 利用無縫重組試劑盒（EasyGeno）使用無縫重組方法將目的基因連接到植物表達載體pPZP212上，選擇Xba I和Sac I作為插入位點，引物序列見表1。重組反應體系（10 μL）：0.5 μL線性化載體（110 ng/μL）、2 μL插入片段（180 ng/μL）、5 μL 2×EasyGeno Assembly Mix、2.5 μL ddH2O。具體步驟參考說明書進行。將重組載體轉化E. coli DH5α，在含有100 μg/mL壯觀霉素的LB固體培養基上篩選轉化菌落，進行菌液PCR驗證及測序驗證。

2 結果

2.1 AmMYB4-like基因的擴增

以蒙古沙冬青葉片總RNA 反轉錄后獲得的cDNA 為模板，AmMYB4-like-F和AmMYB4-like-R為引物進行PCR 擴增。圖1顯示，擴增的目的條帶大小約1 000 bp。經過測序，該序列長度為1 145 bp。將得到的序列在NCBI網站進行Blast檢索，該序列與大豆GmMYB4-like的核苷酸序列相似性最高（89%），因此將獲得的基因命名為AmMYB4-like。

圖1 AmMYB4-like PCR擴增產物凝膠電泳圖

2.2 AmMYB4-like基因的生物信息學分析

2.2.1 AmMYB4-like全長基因序列的結構特征 所獲得的蒙古沙冬青編碼MYB蛋白的目的基因全長為1 145 bp，其中5'UTR長度為157 bp，3'UTR長度為28 bp，開放閱讀框長度為960 bp，編碼319個氨基酸（圖2）。在線軟件分析表明，該蛋白的等電點（pI）為5.09，相對分子質量（MW）為 78.530 21 kD。對其進行MYB結構域分析，AmMYB4-like含有R2和R3保守結構域，屬于典型的R2R3-MYB類轉錄因子（圖2，圖3）。

圖2 AmMYB4-like的核苷酸序列及推測的蛋白序列

對AmMYB4-like進行亞細胞定位預測，結果表明其定位于細胞核中。利用在線軟件預測AmMYB4-like具有41個磷酸化修飾位點，其中Ser 24個，Thr 15個，Tyr 2個。

2.2.2 AmMYB4-like的同源序列比對與系統進化分析 在NCBI中搜索與AmMYB4-like相近的10個編碼MYB的氨基酸序列與本研究獲得的AmMYB4-like進行多序列比對。結果顯示（圖3-B），所有序列的N-端都具有R2和R3保守結構域，皆屬于R2R3-MYB類轉錄因子。在R2保守結構域中含有3個色氨酸殘基（W），相互間的間隔為19個氨基酸。在R3保守結構域中的第一個色氨酸殘基（W）被苯丙氨酸（F）所取代，另外2個色氨酸殘基（W）不變。此外多序列比對顯示各序列在C-端變異較大（圖3-A）。對N-端的R2和R3保守結構域進一步采用在線軟件分析氨基酸序列特點，結果顯示保守性很強（圖3-B）。

圖3 AmMYB4-like與其他物種已知MYB蛋白的多序列比對（A）及R2和R3保守結構域分析（B）

為研究AmMYB4-like與其他植物MYB序列的進化關系，除了上述10個序列外，又選取了4個編碼MYB的氨基酸序列：擬南芥（Arabidopsis thaliana）AtMYB14（NP_180676.1），煙草（Nicotiana tabacum）NtMYB4-like（NP_001312823.1），玉米（Zea mays）ZmMYB4（NP_001296459.1）和水稻（Oryza sativa）OsMYB4（XP_015633465.1），采用鄰接法（N-J）構建進化樹。結果（圖4）顯示，雙子葉植物的MYB4序列和單子葉植物的MYB4序列明顯的聚為2類，而屬于豆科植物的8個序列聚為1類，親緣關系較近。盡管本研究中的AmMYB4-like與所研究的豆科植物的7個MYB4序列親緣關系最近，但表現獨為一支。

圖4 AmMYB4-like的系統進化樹分析

2.3 AmMYB4-like的表達模式分析

2.3.1 干旱脅迫下的表達特征 采用qRT-PCR技術分析正常條件下AmMYB4-like 在葉片和根中的表達特點。結果（圖5）表明，AmMYB4-like在葉片和根中都表達，且葉片中的表達量較高，約為根中的1.46倍。以20% PEG6000模擬干旱脅迫，處理1 h時與對照相比，AmMYB4-like在葉片和根中都表現為上調表達，分別為對照水平的3.08倍和4.04倍。而脅迫處理6 h時，AmMYB4-like在葉片中的表達量降低、與對照水平相同，而根中的表達量繼續增加，為對照水平的4.23倍。當脅迫處理24 h時，AmMYB4-like在葉片中的表達量與對照基本相同，而根中的表達量降低為對照水平的59.8%。當脅迫處理時間維持7 d時，AmMYB4-like在葉片中的表達量降低，為對照水平的61.2%，根中的表達量增加，為對照水平的2.52倍（圖6）。

圖5 AmMYB4-like在不同組織中的表達特征

圖6 20%PEG6000脅迫下AmMYB4-like在不同組織中的表達特征

2.3.2 低溫脅迫下的表達特征 采用qRT-PCR技術分析4℃低溫處理下AmMYB4-like 在葉片和根中的表達特點。結果（圖7）顯示，AmMYB4-like 在葉片和根中表達不同。4℃低溫處理1 h和6 h時，與對照相比，AmMYB4-like在葉片表現為上調表達，分別為對照水平的2.93倍和7.86倍，當脅迫時間延長，AmMYB4-like表達量降低，與對照水平基本相同。而根中的AmMYB4-like表達量在脅迫6 h增加，為對照水平的1.77倍，在其他處理條件下都低于或近于對照水平。

圖7 4℃低溫脅迫下AmMYB4-like在不同組織中的表達特征

2.4 pPZP212-AmMYB4-like植物表達載體構建

采用無縫重組法構建表達載體pPZP212-AmMYB4-like，轉化E. coli DH5α，在含有Spec的LB固體培養基上篩選轉化菌落，菌液PCR驗證結果（圖8-A）顯示，在1 000 bp位置附近具有與目的基因大小一致的條帶，進一步測序顯示結果正確，同時對構建好的重組載體進行了酶切驗證，結果（圖8-B）顯示在1 000 bp位置附近具有與目的基因大小一致的片段，以上結果表明pPZP212-AmMYB4-like植物表達載體構建成功。

圖8 pPZP212-AmMYB4-like重組載體菌液PCR驗證（A）及酶切驗證（B）

3 討論

植物的MYB轉錄因子是具有成員數量最多的轉錄因子超家族，在4種類型的MYB轉錄因子中，屬于R2R3-MYB轉錄因子數量最多，但不同物種的數量不同，如大豆（G. max）244個［22］，棉花（Gossypium raimondii）205個［23］，毛果楊（Populus trichocarpa）192個［24］，玉米（Z. mays）157個［25］，擬南芥126個［26］，葡萄（Vitis vinifera）108個［27］，水稻（O.sativa）88個［28］。有研究者認為R2R3-MYB轉錄因子數量多少與基因數量多少有關［23］，也就是說物種基因組中所含有的基因數量越多，R2R3-MYB轉錄因子數量增加。

研究表明，R2R3-MYB轉錄因子具有重要的生物學功能，包括參與初級和次級代謝、生物和非生物脅迫、細胞命運和發育過程等［7］。R2R3-MYB轉錄因子除了在N端具有保守的DNA-binding結構域外，在C端則有轉錄激活/抑制區［23］。許多功能基因的啟動子中含有特殊的MYB 結合元件（核心序列TAACTG），在逆境脅迫情況下，MYB 轉錄因子可以與該元件結合從而激活脅迫應答基因的表達［29］。

本研究從蒙古沙冬青中克隆得到1個編碼MYB轉錄因子基因AmMYB4-like，生物信息學分析表明，其編碼蛋白序列含有高度保守的R2和R3的MYB結構域，屬于R2R3-MYB類轉錄因子。蒙古沙冬青屬于豆科植物，系統進化樹分析顯示AmMYB4-like與同屬于豆科MYB4親緣關系最近，而與其他雙子葉植物物種的親緣關系相對較遠，與單子葉植物（水稻和玉米）MYB4的親緣關系最遠，提示植物MYB4的進化可能存在種屬特異性。

杜海等［10］在研究大豆GmMYB042時發現其受到PEG8000、NaCl及低溫誘導。He等［23］選取了棉花（G. raimondi）中25個屬的R2R3-MYB轉錄因子，分別研究了在葉片和根中應答干旱和高鹽脅迫下的表達特征，結果表明，這些成員在葉片和根中具有不同的響應干旱和高鹽的表達模式，說明可以通過不同的信號途徑參與脅迫應答。本研究中，正常條件下AmMYB4-like在根和葉中都表達，但在不同脅迫條件下，具有不同的表達模式。以20%PEG6000模擬干旱處理，葉片和根中的AmMYB4-like上調表達，葉片中的AmMYB4-like在1 h時達到最高水平，為對照水平的3.08倍，而根中的AmMYB4-like在6 h達到最高水平，為對照水平的4.23倍，表明葉片和根中的AmMYB4-like參與干旱脅迫應答。在4℃低溫處理下，葉片中的AmMYB4-like表達量增加，處理6 h時達到最高水平，為對照水平的7.86倍，但根中AmMYB4-like盡管在4℃低溫處理6 h表達提高，但相對較少。上述結果說明蒙古沙冬青葉片中的AmMYB4-like既響應低溫脅迫，也響應干旱脅迫，而根中的AmMYB4-like主要參與干旱脅迫應答。本研究以7 d作為較長的脅迫時間研究了AmMYB4-like的表達特征，結果顯示，只有根中的AmMYB4-like在干旱脅迫7 d時檢測出上調表達，為對照水平的2.52倍，說明根中的AmMYB4-like參與較長時間的干旱脅迫應答。根作為植物吸水的重要組織部位，對于干旱耐受能力十分重要，蒙古沙冬青是強旱生植物，其根的干旱耐受性十分重要，干旱脅迫下根中的相關基因的表達對其耐受性可能具有一定的意義。

4 結論

從蒙古沙冬青中分離到1個編碼MYB轉錄因子基因，命名為AmMYB4-like。該序列開放閱讀框編碼319個氨基酸，具有典型的MYB轉錄因子保守的R2R3結構域，屬于R2R3-MYB轉錄因子。qRTPCR 分析表明，葉片中的AmMYB4-like參與低溫和干旱脅迫應答，而根中的AmMYB4-like主要參與干旱脅迫應答。構建了pPZP212-AmMYB4-like植物表達載體。

［1］ Paz-Ares J, Ghosal D, Wienand U, et al. The regulatory c1 locus of Zea mays encodes a protein with homology to myb protooncogene products and with structural similarities to transcriptional activators［J］. EMBO J, 1987, 6（12）：3553-3558.

［2］ Chen YH, Yang XY, He K, et al. The MYB transcription factor superfamily of Arabidopsis：expression analysis and phylogenetic comparison with the rice MYB family［J］. Plant Mol Biol, 2006, 60（1）：107-124.

［3］ Cao ZH, Zhang SZ, Wang RK, et al. Genome wide analysis of the apple MYB transcription factor family allows the identification of MdoMYB121 gene conferring abiotic stress tolerance in plants［J］. PLoS One, 2013, 8（7）：e69955.

［4］ Hou XJ, Li SB, Liu SR et al. Genome-wide classification and evolutionary and expression analyses of citrus MYB transcription factor families in sweet orange［J］. PLoS One, 2014, 9：e112375.

［5］ Muthamilarasan M, Khandelwal R, Yadav CB, et al. Identification and molecular characterization of MYB transcription factor superfamily in C4 model plant foxtail millet（Setaria italica L.）［J］. PLoS One, 2014, 9：e109920.

［6］ Du H, Zhang L, Liu L, et al. Biochemical and molecular characterization of plant MYB transcription factor family［J］. Biochemistry（Mosc）, 2009, 74（1）：5-16.

［7］ Ambawat S, Sharma P, Yadav NR, et al. MYB transcription factorgenes as regulators for plants：an overview［J］. Physiol Mol Biol Plants, 2013, 19（3）：307-321.

［8］ Lepiniec L, Debeaujon I, Routaboul JM, et al. Genetics and biochemistry of seed flavonoids［J］. Annu Rev Plant Biol, 2006, 57（1）：405-430.

［9］ Gonzalez A, Zhao M, Leavitt JM, et al. Regulation of the anthocyanin biosynthetic pathway by the TTG1/bHLH/Myb transcriptional complex in Arabidopsis seedlings［J］. Plant J, 2008, 53（5）：814-827.

［10］ 杜海, 冉鳳, 馬珊珊, 等. GmMYB042 基因對類黃酮生物合成的調控作用［J］. 作物學報, 2016, 42（1）：1-10.

［11］ Zhang JJ, Zhang SS, Li H, et al. Identification of transcription factors ZmMYB111 and ZmMYB148 involved in phenylpropanoid metabolism［J］. Front Plant Sci, 2016, 7：131-134.

［12］ 周宜君, 劉春蘭, 馮金朝, 等. 沙冬青抗旱、抗寒機理的研究進展［J］. 中國沙漠, 2001, 21（3）：312-315.

［13］ 郭生祥, 劉志銀, 郝昕. 沙冬青的研究進展［J］. 甘肅林業科技, 2005, 30（4）：5-8.

［14］ Zhou YJ, Gao F, Liu R, et al. De novo sequencing and analysis of root transcriptome using 454 pyrosequencing to discover putative genes associated with drought tolerance in Ammopiptanthus mongolicus［J］. BMC Genomics, 2012, 13, 266.

［15］ Gao F, Wang J, Wei SJ, et al. Transcriptomic analysis of drought stress responses in Ammopiptanthus mongolicus leaves using the RNA-Seq technique［J］. PLoS One, 2015, 10, e0124382.

［16］ Wu YQ, Wei W, Pang X, et al. Comparative transcriptome profiling of a desert evergreen shrub, Ammopiptanthus mongolicus, in response to drought and cold stresses［J］. BMC Genomics, 2014, 15：671.

［17］ Pang T, Ye CY, Xia X, et al. De novo sequencing and transcriptome analysis of the desert shrub, Ammopiptanthus mongolicus, during cold acclimation using Illumina/Solexa［J］. BMC Genomics, 2013, 14, 488.

［18］ Chen JH, Sun Y, Sun F, et al. Tobacco plants ectopically expressing the Ammopiptanthus mongolicus AmCBL1 gene display enhanced tolerance to multiple abiotic stresses［J］. Plant Growth Regul, 2011, 6（3）：259-269.

［19］ 李章磊, 高飛, 曹玉震, 等. 蒙古沙冬青AmDREB2. 1 基因的克隆及表達分析［J］. 生物技術通報, 2015, 31（3）：108-114.

［20］ Gao F, Wang N, Li HY, et al. Identification of drought-responsive microRNAs and their targets in Ammopiptanthus mongolicus by using high-throughput sequencing［J］. Sci Rep, 2016, 6：34601.

［21］ Shi J, Liu M, Shi J, et al. Reference gene selection for qPCR in Ammopiptanthus mongolicus under abiotic stresses and expression analysis of seven ROS-scavenging enzyme genes［J］. Plant Cell Rep, 2012, 31（7）：1245-54.

［22］ Du H, Yang SS, Liang Z, et al. Genome-wide analysis of the MYB transcription factor superfamily in soybean［J］. BMC Plant Biol, 2012, 12：106.

［23］ He Q, Jones DC, Li W, et al. Genome-Wide Identification of R2R3-MYB genes and expression analyses during abiotic stress in Gossypium raimondii［J］. Sci Rep, 2016, 6：22980.

［24］ Wilkins O, Nahal H, Foong J, et al. Expansion and diversification of the Populus R2R3-MYB family of transcription factors［J］. Plant Physiol, 2009, 149（2）：981-993.

［25］ Du H, Feng BR, Yang SS, et al. The R2R3-MYB transcription factor gene family in maize［J］. PLoS One, 2012, 7, e37463.

［26］ Stracke R, Werber M, Weisshaar B. The R2R3-MYB gene family in Arabidopsis thaliana［J］. Curr Opin Plant Biol, 2001, 4（5）：447-456.

［27］ Matus JT, Aquea F, Arce-Johnson P. Analysis of the grape MYB R2R3 subfamily reveals expanded wine quality-related clades and conserved gene structure organization across Vitis and Arabidopsis genomes［J］. BMC Plant Biol, 2008, 8（1）, 1-15.

［28］ Katiyar A, Smita S, Lenka SK, et al. Genome-wide classification and expression analysis of MYB transcription factor families in rice and Arabidopsis［J］. BMC Genomics, 2012, 13, 544.

［29］ 喬孟, 于延沖, 向鳳寧. 擬南芥R2R3 -MYB類轉錄因子在環境脅迫中的作用［J］. 生命科學, 2009, 21（1）：145-150.

（責任編輯 狄艷紅）

Cloning and Expression Analysis of AmMYB4-like in Ammopiptanthus mongolicus

XIAO Zi-hua GAO Fei SUN Hui-gai ZHOU Yi-jun
（College of Life & Environmental Sciences，Minzu University of China，Beijing 100081）

Based on our previous work，a gene encoding MYB transcription factor was cloned from Ammopiptanthus mongolicus，and it was designated as AmMYB4-like. The full length of the AmMYB4-like cDNA was 1，145 bp，including a 960 bp opening reading frame（ORF）which encoded a 319-amino acid peptide. AmMYB4-like contained R2 and R3 conserved domains and belonged to the R2R3-MYB subfamily. Quantitative real-time PCR（qRT-PCR）analyses revealed that AmMYB4-like was up-regulated in leaves under low temperature and drought stresses，but it was mainly induced by drought stress in roots. Plant expression vector pPZP212- AmMYB4-like was constructed for further research of AmMYB4-like.

Ammopiptanthus mongolicus；AmMYB4-lik；gene cloning；expression analysis；construction of plant expression vector

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.016

2016-10-08

國家自然科學基金項目（31370356，31670335），建設世界一流大學（學科）和特色發展引導專項資金（YDZXXK201619，2015MDTD08C）

肖自華，男，碩士，研究方向：植物抗逆分子生物學；E-mail：xiaozihua1991@163.com

周宜君，女，教授，研究方向：植物抗逆分子生物學；E-mail：zhouyijun@muc.edu.cn