不同品種綿羊發(fā)情周期LEPRb mRNA表達(dá)分析

盧守亮 李良遠(yuǎn) 高磊 沈敏 萬(wàn)鵬程 石國(guó)慶 代蓉

（新疆農(nóng)墾科學(xué)院 省部共建綿羊遺傳育種與健康養(yǎng)殖國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832000）

不同品種綿羊發(fā)情周期LEPRb mRNA表達(dá)分析

盧守亮 李良遠(yuǎn) 高磊 沈敏 萬(wàn)鵬程 石國(guó)慶 代蓉

（新疆農(nóng)墾科學(xué)院 省部共建綿羊遺傳育種與健康養(yǎng)殖國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832000）

為了探討LEPR在綿羊季節(jié)性發(fā)情中的表達(dá)特點(diǎn)，以季節(jié)性發(fā)情的中國(guó)美利奴和常年發(fā)情的多浪羊?yàn)檠芯繉?duì)象，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)繁殖季節(jié)不同發(fā)情階段LEPRb mRNA在下丘腦、卵巢和子宮組織中的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，在發(fā)情間期、前期和發(fā)情期中國(guó)美利奴卵巢和子宮組織LEPRb的相對(duì)表達(dá)水平都低于下丘腦，但在發(fā)情后期卵巢和子宮LEPRb的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于下丘腦。不同發(fā)情時(shí)期，兩品種綿羊同一組織的LEPRb的表達(dá)變化幅度有所差異，但趨勢(shì)相似。且中國(guó)美利奴各組織LEPRb的表達(dá)水平都高于常年發(fā)情的多浪羊。LEPRb的表達(dá)變化與綿羊發(fā)情存在相關(guān)關(guān)系。

綿羊；LEPRb；表達(dá)水平；發(fā)情周期；實(shí)時(shí)定量PCR

在進(jìn)化的長(zhǎng)河中，自然界中的動(dòng)、植物為了種族的延續(xù)和發(fā)展，逐漸進(jìn)化形成在特定的繁育特性，綿羊的季節(jié)性繁殖就是一個(gè)自然選擇和適應(yīng)的結(jié)果。許多綿羊品種特別是細(xì)毛羊品種具有季節(jié)性繁殖特點(diǎn)。在現(xiàn)代綿羊養(yǎng)殖生產(chǎn)中，提高綿羊的繁殖效率是增產(chǎn)增收的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。結(jié)合MOET技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)綿羊一年兩產(chǎn)或兩年三產(chǎn)，但需要投入大量的人力物力，而且在非繁殖季節(jié)外源激素處理的效果有時(shí)也差強(qiáng)人意。因此打破發(fā)情特性實(shí)現(xiàn)常年發(fā)情，提高綿羊的繁殖效率，選育具有常年發(fā)情特性的細(xì)毛羊品種是規(guī)模化養(yǎng)殖過(guò)程中急需解決的問(wèn)題，而深入解析綿羊季節(jié)性發(fā)情的分子基礎(chǔ)和作用機(jī)制是定向選育的第一步。

Leptin（瘦素）是肥胖基因（Obese gene，Ob）的表達(dá)產(chǎn)物，是一種由脂肪細(xì)胞分泌的多功能細(xì)胞因子，在能量平衡、食欲調(diào)節(jié)和繁殖方面起重要作用，主要在脂肪組織中表達(dá)，在其他組織中也有少量表達(dá)［1］。脂肪細(xì)胞分泌的leptin與血清蛋白結(jié)合，運(yùn)輸?shù)桨薪M織，轉(zhuǎn)變成游離的leptin［2］，與受體結(jié)合作用于代謝調(diào)節(jié)中樞從而發(fā)揮其生物學(xué)功能。1996年小鼠的leptin受體被成功克隆［3］。Leptin受體包括6種異構(gòu)體（LEPR a-f），其中長(zhǎng)型受體LEPRb為主要的功能性受體，在leptin的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。有研究表明leptin及其受體的表達(dá)變化與哺乳動(dòng)物繁殖性能有一定關(guān)系［4］。ob/ob（leptin基因突變）和db/db（LEPRb基因突變）肥胖小鼠均無(wú)繁殖能力，ob/ob小鼠皮下注射外源leptin可使其體重和繁殖性能恢復(fù)正常［5］，給性成熟前的小鼠注射人重組leptin會(huì)使小鼠的初情期提前［6］，青春期時(shí)血清leptin會(huì)早于生殖激素/性激素開(kāi)始上升，激活性腺軸，進(jìn)而對(duì)青春期生殖功能的發(fā)育進(jìn)行調(diào)節(jié)。Di等［7］發(fā)現(xiàn)給性成熟前的兔子注射大劑量的letpin會(huì)抑制排卵，但低劑量長(zhǎng)時(shí)間的注射會(huì)促進(jìn)幼兔卵泡發(fā)育和排卵。我們前期研究中發(fā)現(xiàn)，在常年發(fā)情和季節(jié)性發(fā)情綿羊外周血中的leptin含量存在顯著的品種差異［8，9］，推測(cè)leptin參與綿羊發(fā)情調(diào)控，但其具體的調(diào)控機(jī)制和作用方式仍不明確。因此，本研究以發(fā)揮leptin主要生物學(xué)功能的長(zhǎng)型受體為研究對(duì)象，分析其在發(fā)情周期的不同階段和不同組織中的表達(dá)變化，為探討leptin參與調(diào)控綿羊發(fā)情的作用機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇年齡相近（3-4歲）、體況相似、健康的中國(guó)美利奴（軍墾型）（新疆農(nóng)墾科學(xué)院試驗(yàn)羊場(chǎng)）和多浪羊（新疆農(nóng)墾科學(xué)院試驗(yàn)羊場(chǎng)）各12只，統(tǒng)一飼養(yǎng)管理。秋分后開(kāi)始早晚公羊試情，跟蹤2個(gè)情期后采集不同發(fā)情時(shí)期的組織樣品（下丘腦、卵巢和子宮）［10］，并迅速置于液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA的合成 Trizol（Invitrogen）一步法提取各組織總RNA，0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性，核酸蛋白分析儀（Implen）檢測(cè)RNA濃度及純度。參照Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（Roche）說(shuō)明書(shū)合成cDNA第一鏈。

1.2.2 綿羊LEPRb基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 分別以各組織樣品的cDNA為模板，以持家基因GAPDH 為內(nèi)參，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè) LEPRb的表達(dá)水平，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。參考綿羊LEPRb（U62124.1）序列和GAPDH（NM_001190390.1）序列信息設(shè)計(jì)檢測(cè)引物（表1）。依照LightCycler 480 SYBR Green I Master（Roche）試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃ 10 s；60℃ 20 s；72℃ 25 s；45個(gè)循環(huán)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物信息

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析 采用2-ΔΔCT法分析不同組織中LEPRb基因表達(dá)變化，SPSS 16.0軟件單因素方差分析對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 總RNA的提取及目的基因擴(kuò)增

提取的各組織總RNA 經(jīng)0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示總RNA完整性較好且無(wú)蛋白和基因組DNA污染；核酸蛋白分析儀檢測(cè)OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，各組織總RNA濃度及純度符合試驗(yàn)要求。分別以不同組織總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。以cDNA為模板，利用LEPRb與GAPDH特異引物擴(kuò)增目的片段，PCR 產(chǎn)物與預(yù)期大小相符且擴(kuò)增片段特異。

2.2 LEPRb在不同品種綿羊發(fā)情不同時(shí)期的組織表達(dá)變化

將下丘腦組織LEPRb 表達(dá)水平定義為1，對(duì)定量PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。圖1所示為L(zhǎng)EPRb在不同綿羊品種不同發(fā)情階段各組織表達(dá)情況。整個(gè)發(fā)情過(guò)程中，LEPRb在下丘腦、卵巢和子宮組織中均有表達(dá)，但表達(dá)變化趨勢(shì)不同。

在發(fā)情間期（圖1-A），中國(guó)美利奴下丘腦的LEPRb表達(dá)水平極顯著高于卵巢和子宮（P＜0.01），而卵巢和子宮的相對(duì)表達(dá)水平無(wú)顯著差異；多浪羊LEPRb表達(dá)水平由高到低依次為：子宮、下丘腦、卵巢，其中子宮LEPRb表達(dá)水平顯著高于下丘腦（P＜0.05），極顯著高于卵巢（P＜0.01）。

發(fā)情前期（圖1-B）兩品種綿羊在3個(gè)組織中的表達(dá)變化相同，下丘腦LEPRb表達(dá)水平極顯著高于卵巢和子宮（P＜0.01），卵巢中的表達(dá)水平最低，子宮組織LEPRb基因表達(dá)水平均略高于卵巢組織，同一品種子宮和卵巢組織的表達(dá)水平無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

與發(fā)情前期的變化趨勢(shì)相似，發(fā)情期（圖1-C）的中國(guó)美利奴LEPRb表達(dá)水平由高到低依次為下丘腦、卵巢、子宮，且下丘腦的表達(dá)水平極顯著高于卵巢和子宮（P＜0.01），子宮和卵巢LEPRb表達(dá)水平無(wú)顯著差異。多浪羊LEPRb表達(dá)水平由高到低依次為下丘腦、子宮、卵巢，其中下丘腦中的表達(dá)水平極顯著高于卵巢（P＜0.01），顯著高于子宮（P＜0.05）；子宮中的表達(dá)水平顯著高于卵巢（P＜0.05）。

發(fā)情后期（圖1-D），中國(guó)美利奴和多浪羊各組織LEPRb表達(dá)與前3個(gè)時(shí)期有明顯的差異。LEPRb在中國(guó)美利奴發(fā)情后期的子宮中表達(dá)水平最高，但不同組織中的表達(dá)水平無(wú)顯著差異。多浪羊子宮和下丘腦的LEPRb表達(dá)水平較高，極顯著地高于卵巢（P＜0.01）。

圖1 LEPRb在不同綿羊品種不同發(fā)情時(shí)期的組織表達(dá)變化

2.3 不同發(fā)情階段不同組織LEPRb的表達(dá)變化

發(fā)情季節(jié)不同發(fā)情階段各組織中LEPRb 表達(dá)變化如圖2所示。同一品種相同組織發(fā)情間期的表達(dá)水平為對(duì)照，以比較分析同一組織不同時(shí)期LEPRb的表達(dá)變化。圖2-A為下丘腦LEPRb 相對(duì)表達(dá)水平。與發(fā)情間期相比，中國(guó)美利奴下丘腦中LEPRb的表達(dá)呈現(xiàn)出從發(fā)情間期向發(fā)情期逐漸下降趨勢(shì)，至發(fā)情期LEPRb的表達(dá)水平有所回升，但與發(fā)情間期和發(fā)情前期的差異不顯著（P＜0.05），發(fā)情期至發(fā)情后期急劇減少，發(fā)情后期的表達(dá)水平極顯著低于其它階段（P＜0.01）。多浪羊下丘腦組織不同發(fā)情時(shí)期LEPRb的表達(dá)水平在發(fā)情前期達(dá)到最高點(diǎn)，然后逐漸下降至發(fā)情間期時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)，發(fā)情前期表達(dá)水平是發(fā)情間期的2.14倍（P＜0.01）。

從圖2-B中可以看出，中國(guó)美利奴卵巢LEPRb表達(dá)水平從發(fā)情期的最低點(diǎn)開(kāi)始逐漸升高，至發(fā)情前期達(dá)到最高水平，發(fā)情前期的表達(dá)水平極顯著高于其他3個(gè)階段（P＜0.01）。多浪羊卵巢LEPRb表達(dá)水平從發(fā)情前期開(kāi)始逐漸升高至發(fā)情后期達(dá)到最高點(diǎn)后下降，發(fā)情后期LEPRb表達(dá)水平極顯著高于其他3個(gè)階段（P＜0.01）。

圖2-C為兩品種綿羊子宮LEPRb表達(dá)變化。從圖中可以看出，兩品種綿羊子宮組織LEPRb表達(dá)變化趨勢(shì)與卵巢相似。在發(fā)情前期中國(guó)美利奴子宮LEPRb表達(dá)水平達(dá)到最高值，極顯著高于其他3個(gè)時(shí)期（P＜0.01）；同期多浪羊子宮LEPRb表達(dá)水平達(dá)到最低值，極顯著低于發(fā)情間期（P＜0.01），顯著低于發(fā)情后期（P＜0.05）。

圖2 LEPRb在不同綿羊品種不同發(fā)情階段的組織表達(dá)變化

2.4 不同品種不同組織LEPRb表達(dá)變化

以相同發(fā)情時(shí)期多浪羊組織LEPRb 表達(dá)水平為對(duì)照組，分析在發(fā)情季節(jié)不同發(fā)情階段中國(guó)美利奴與多浪羊各組織LEPRb 表達(dá)水平變化。從圖3中可以看出在不同發(fā)情階段中國(guó)美利奴各組織中LEPRb表達(dá)水平都高于多浪羊，但在發(fā)情后期各組織、發(fā)情間期和發(fā)情期子宮組織表達(dá)水平在品種之間差異不顯著。

圖3 LEPRb在不同綿羊品種各組織相對(duì)表達(dá)變化

3 討論

Leptin是主要由脂肪細(xì)胞分泌的多功能細(xì)胞因子，是聯(lián)系機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育和下丘腦促性腺激素釋放激素釋放系統(tǒng)的外周信號(hào)之一。大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)leptin能顯著刺激雄性大鼠下丘腦分泌GnRH［11，12］，使正中隆起弓狀外植體釋放促黃體素釋放激素（LHRH），刺激垂體前葉釋放FSH和LH［13］，添加leptin可促進(jìn)LHRH和LH的分泌［14］。leptin可以直接作用于卵巢，影響卵泡發(fā)育和排卵［15］。LEPR蛋白由一個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、一個(gè)小的疏水跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成，其中細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)短決定了受體亞型。長(zhǎng)型受體LEPRb有完整的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，是leptin的功能性受體。目前研究已證實(shí)leptin長(zhǎng)受體在大鼠和羊下丘腦［16-18］、垂體［16，17，19］和卵巢［20-22］中均有表達(dá)。Leptin及其受體的mRNA和蛋白在山羊卵泡中均有表達(dá)［23］，且在牛小卵泡中表達(dá)量很高，并隨著卵泡的生長(zhǎng)和E2濃度的增加而顯著下調(diào)，表明leptin對(duì)卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟有潛在的調(diào)控作用［24］。在體外培養(yǎng)卵巢試驗(yàn)中，添加不同濃度的leptin均可以增加leptin受體的表達(dá)，且低leptin濃度促進(jìn)孕酮分泌，高leptin濃度則抑制孕酮分泌［14］。在大鼠卵巢排卵過(guò)程的研究發(fā)現(xiàn)低濃度leptin促進(jìn)排卵，高濃度抑制排卵。Luoh等［25］發(fā)現(xiàn)LEPRb是在下丘腦表達(dá)的主要受體亞型。人LEPRb突變會(huì)導(dǎo)致早發(fā)性病態(tài)肥胖，而且純合型突變致使青春期停滯、生長(zhǎng)激素和促甲狀腺素的分泌減少［26］。LEPRb的表達(dá)變化可能改變了機(jī)體對(duì)leptin的敏感性。在ob/ob和db/db小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，主要的功能性受體LEPRb在弓狀核中mRNA含量比+/ob小鼠高2.3倍。與注射生理鹽水的對(duì)照組相比，ob/ob小鼠注射leptin后弓狀核LEPRb mRNA含量下降30%。正常小鼠禁食48h后，弓狀核LEPRb mRNA水平極顯著升高。此外，禁食48 h的大鼠的LEPRb mRNA水平在弓狀核和腹內(nèi)側(cè)核分別提高40%和75%［23］。

Leptin通過(guò)與其受體結(jié)合發(fā)揮抑制食欲、減少能量攝取、增加能量消耗和抑制脂肪合成等生物學(xué)功能。下丘腦是控制能量平穩(wěn)的區(qū)域，而leptin在脂肪和能量代謝中起重要作用，因此下丘腦是leptin重要的靶器官，而LEPRb就是leptin在下丘腦發(fā)揮作用的連接點(diǎn)。本研究中發(fā)現(xiàn)除發(fā)情后期外，中國(guó)美利奴各組織LEPRb的表達(dá)水平都低于下丘腦，但在發(fā)情后期卵巢和子宮LEPRb的表達(dá)水平都顯著高于下丘腦。Leptin及其受體的mRNA和蛋白在牛小卵泡中高水平表達(dá)，并隨著卵泡的生長(zhǎng)和E2濃度的增加而顯著下調(diào)，表明leptin在卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟方面存有潛在的調(diào)控作用［24］，這與我們的研究結(jié)果相同。在同一組織內(nèi)，兩品種綿羊在不同時(shí)間同一組織的LEPRb的表達(dá)變化趨勢(shì)和變化幅度有所差異。多浪羊中LEPRb在下丘腦組織的表達(dá)變化是從發(fā)情前期開(kāi)始逐漸下降，作為性腺軸的下游靶器官卵巢和子宮中LEPRb的表達(dá)變化滯后于下丘腦，這與下丘腦和卵巢、子宮在性腺軸所處的位置相符。中國(guó)美利奴各組織LEPRb的表達(dá)變化略有不同，但卵巢和子宮LEPRb的表達(dá)水平在發(fā)情前期最高，呈現(xiàn)協(xié)同變化特點(diǎn)。下丘腦LEPRb的表達(dá)變化呈現(xiàn)出明顯的品種特異性。在發(fā)情季節(jié)不同發(fā)情階段中國(guó)美利奴各組織LEPRb的表達(dá)水平都高于常年發(fā)情的多浪羊，這與本研究血清leptin濃度檢測(cè)的結(jié)果趨勢(shì)相同［9］。

4 結(jié)論

通過(guò)分析比較LEPRb在不同綿羊品種不同發(fā)情時(shí)期的不同組織中的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)LEPRb的表達(dá)變化與綿羊發(fā)情存在相關(guān)關(guān)系，但具體的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。

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（責(zé)任編輯 李楠）

The Expression of LEPRb mRNA in the Estrus Cycle of Different Sheep Strains

LU Shou-liang LI Liang-yuan GAO Lei SHEN Min WAN Peng-cheng SHI Guo-qing DAI Rong
（State Key Laboratory of Sheep Genetic Improvement and Healthy Production，Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science，Shihezi 832000）

The aim of the study is to explore LEPR expression characteristics in seasonal estrus of sheep. Chinese merino（seasonal estrus sheep）and Duolang sheep（perennial estrus sheep）were selected to determine the expression changes of LEPRb mRNA in hypothalamus，ovaries and uterus in different stage of estrus cycle by quantitative real-time PCR. The results showed that during the whole estrus cycle，except the metaestrus，the LEPRb levels in the ovarian and uterus were found to be significantly lower than the levels in hypothalamus of Chinese Merino，but the results in metaestrus showed the reverse. Although the expression level of LEPRb varied in the same tissue of 2 cultivars during estrus stage，the trend was similar. Moreover，the LEPRb expression levels in different tissues of Chinese Merino were significantly higher than those in Duolang sheep. The results indicate that the expression variation of LEPRb is correlated with sheep estrus.

sheep；LEPRb；expression level；estrus cycle；real-time quantitative PCR

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.020

2016-09-07

國(guó)家絨毛用羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-40-07），兵團(tuán)博士資金（2014BB015），兵團(tuán)院士資金（2013BB022）

盧守亮，男，助理研究員，研究方向：綿羊繁殖技術(shù)研究；E-mail：lsl912@163.com

代蓉，女，副研究員，研究方向：綿羊分子遺傳及繁育；E-mail：dairong1@163.com石國(guó)慶，男，研究員，研究方向：綿羊育種與繁殖；E-mail：nkkxyxms@163.com