尼羅羅非魚NITR基因的克隆鑒定與組織表達分析

汪志文 黃瑜 張海艷 湯菊芬 簡紀常 魯義善

（廣東海洋大學水產學院 廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室 廣東省教育廳水產經濟動物病害控制重點實驗室，湛江 524088）

尼羅羅非魚NITR基因的克隆鑒定與組織表達分析

汪志文 黃瑜 張海艷 湯菊芬 簡紀常 魯義善

（廣東海洋大學水產學院 廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室 廣東省教育廳水產經濟動物病害控制重點實驗室，湛江 524088）

從尼羅羅非魚脾臟組織中克隆獲得新型免疫受體（NITR，Novel immune-type receptor）基因的編碼區序列（GenBank登錄號：KX989509；命名為On-NITR），該基因cDNA全長1 119 bp，ORF為1 026 bp，可編碼341個氨基酸，理論分子量為 37.38 kD，等電點為8.28。通過NCBI BLAST比對發現羅非魚NITR與其他已報道的物種NITR氨基酸序列相似度為27%-46%。氨基酸序列分析顯示：On-NITR具有1個信號肽區域、2個胞外Ig-domain區、1個跨膜結構域，以及1個胞質尾區，該胞質尾區含有NITR典型的免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM）和一個ITIM類似基序itim，且具有較高的保守性。熒光定量PCR分析顯示，On-NITR在健康尼羅羅非魚組織中均有表達，在腸道、皮膚、肝臟表達水平較高，在胸腺、鰓、脾臟、心臟、腦組織中的表達量較低，在頭腎組織中的表達量最低。

尼羅羅非魚；NITR蛋白；基因克隆；組織表達分析

免疫球蛋白基因超家族（IgSF）是一類分子結構中含有類似免疫球蛋白結構域（Ig 結構域）、不依賴Ca2+的細胞黏附分子。IgSF的所有成員都有3個共同保守區域：免疫球蛋白樣結構域（Ig）、跨膜結構域（Transmembrane）和胞質尾區（Cytoplasmicregion）。IgSF的蛋白功能主要體現在免疫系統中，負責參與相關免疫應答及免疫調節反應。在先天性免疫和獲得性免疫受體中的IgSF有很多類型，如免疫球蛋白（Ig）和 T細胞抗原受體（TCR）、自然殺傷細胞受體和細胞黏附分子等［1-3］。NITRs作為IgSF家族中的一員，在相關結構上高度保守。主要包括1-2個胞外免疫球蛋白結構域（1個IgV和1個Ig（V / C2）域）、1個跨膜區和1個含有1-2個免疫受體酪氨酸抑基序（ITIMs）的胞質尾區。在功能研究上，斑馬魚ITIM在哺乳動物細胞系中的表達驗證了ITIM在體外具有調節免疫抑制信號功能［4，5］；斑點叉尾鮰NITR［6］的發現確定了它的免疫生物學功能，并有11種不同類型的NITR基因在斑點叉尾鮰上被鑒定出來，這些不同類型的NITR基因在胞外Ig結構域、連接區（Joining regions）、跨膜結構域和ITIM的數量上展現出多樣性的特征。目前NITR已在7種硬骨魚類中被鑒定發現：河豚（Spheroides nephelus）［7，8］，斑馬魚（Danio rerio）［9］，斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）［6］，虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［10］、鯉（Cyprinus carpio）［11］、日本比目魚（Paralichthys olivac-eus）［12］和 青 鳉（Oryzias latipes）［13］。但是迄今為止NITR及其同系物并沒有在哺乳動物中被鑒定發現［14］。

近年來，針對NITRs的功能及其在進化過程中作用的研究正成為熱點。Shen等［15］在鯰魚NK-like細胞中檢測到NITR，但是NITRs的特定細胞譜系并不確定。另外，NITR的特異性結合配體現在也不清楚，但是可以確定它們能與某些異體細胞表面上的靶位結合［16］。Rojo等［17］發現斑馬魚對鰻利斯頓氏菌發生免疫應答后的NITR在轉錄水平上發生上調，并推測NITR在免疫方面有著重要作用。Litman 等［14］發現NITRs的整體結構和胞質信號與哺乳動物的自然殺傷性細胞免疫球蛋白樣受體（KIRs）類似，推測NITR可能是先天性免疫和適應性免疫系統進化過程中重要的組成階段。

羅非魚作為世界上廣泛養殖的經濟魚類，同時也是我國南方重要的養殖魚類之一，具有很高的經濟價值［20］。鑒于NITR在硬骨魚類中的免疫功能中的特殊地位，本研究對羅非魚NITR分子進行了克隆鑒定，并對該基因及其氨基酸序列特征進行了生物信息學分析；同時研究了該基因在羅非魚健康組織中的表達情況，旨在為進一步研究羅非魚NITR分子生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗所用健康尼羅羅非魚購自湛江市東風市場，體質量規格約100±10 g/尾；克隆載體pMD18-T Vector購自TaKaRa公司（大連）；Easy Taq酶、Ex Taq酶來自北京全式金公司；PCR儀購自Bio-Rad公司；DNA膠回收試劑盒購自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 羅非魚Total RNA的提取和cDNA的合成 實驗用羅非魚在實驗室條件下（28±2）℃暫養4周后，取健康尼羅羅非魚脾臟組織10-20 mg，再按照北京全式金TransZol Up Plus RNA Kit試劑盒說明書提取羅非魚脾臟的Total RNA。將提取的羅非魚脾臟Total RNA按照北京全式金EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說明方法反轉成cDNA第一鏈。

1.2.2 羅非魚NITR基因全長的克隆 依據本實驗室羅非魚轉錄組數據預測的NITR分子，利用Primer Premier 5.0設計羅非魚NITR基因克隆引物On-NITR-1F、On-NITR-1026R（表1），然后進行PCR擴增，PCR反應條件參照北京全式金2×EasyTaq PCR SuperMix說明書進行，之后電泳檢測PCR產物，將目的條帶切膠回收后與pMD18-T載體連接，連接產物轉化到DH5α中，挑取單克隆進行菌落PCR鑒定后，將陽性克隆送廣州生工測序。

1.2.3 羅非魚NITR基因的生物信息學分析 陽性克隆的測序結果用DNAMAN Version 6軟件進行拼接，從而獲得On-NITR cDNA全長序列。通過NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行On-NITR序列比對分析；通過ORF Finder（https://www.ncbi. nlm.nih.gov/orffinder/）進行開放閱讀框確定；通過ExPASy ProtParam tool（http://web.expasy.org/protpar am/）進行On-NITR氨基酸序列推導和相關理化性 質 分 析；通 過Softberry（http://linux1.softberry. com/berry.phtml?topic =psite&group=programs&subgro up=proloc）進行氨基酸基本功能位點分布預測；通過 SignalP 4.0 Server（http://www.cbs.Dtu.dk/services/ signalp）進行信號肽序列預測；通過TMHMM Server 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）進行跨膜結構域預測；通過Inter ProScan Sequence search（http://www.ebi.ac.uk/Tools） 和 SMART（http://smart. embl-heidelberg.de/）進行蛋白功能結構域分析；通過 SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl?page=npsa_sopma.html）、SWISSM-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/Interactive）進行二級結構、三維結構預測分析；通過Clutalx和Genedoc軟件進行氨基酸同源序列比對分析。

表1 本實驗所用引物

1.2.4 羅非魚NITR的組織表達分析 重新利用Primer 5.0軟件設計一對特異性引物On-RT-NITR-F、On-RT-NITR-R。以β-actin為內參基因，通過ABI 7500 Real-Time定量PCR儀分析進行qRT-PCR。分析On-NITR在試驗中的各個組織中的表達分布。每個樣本設置3個復孔作為平行。RT-PCR條件參照TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix試劑盒進行。具體的反應條件為：預變性 94℃ 30 s；94℃5 s，60℃ 34 s，40個循環；95℃ 15 s（Dissociation Stage）。通過2-△△Ct方法計算羅非魚NITR基因在不同組織中的相對表達量。

2 結果

2.1 On-NITR基因的克隆

用On-NITR-1F、On-NITR-1026R作為引物，羅非魚脾臟組織cDNA作為模板進行PCR擴增，獲得的產物測序后經NCBI Blast分析判定該擴增產物為羅非魚NITR基因。用本試驗中羅非魚NITR基因序列命名為On-NITR（GenBank登錄號：KX989509），該基因全長1 119 bp，5'非編碼區為39 bp，3'非編碼區為55 bp，ORF為1 026 bp，可編碼341個氨基酸（圖1）。

2.2 On-NITR生物信息學分析

2.2.1 On-NITR氨基酸序列理化性質分析 ProtParam在線分析結果顯示，羅非魚NITR蛋白的理論分子量為 37.38 kD，理論等電點（PI）為8.28。推測的氨基酸序列中絲氨酸（Ser）的含量最高，比例為10%；亮氨酸（Leu） 含量次之，為9.4%；色氨酸（Trp）含量最低，為0.6%。其中帶正電荷的氨基酸殘基（Arg+Lys）有34個，帶負電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu）有30 個。不穩定指數為36.85，歸類為1個穩定的蛋白。該蛋白脂溶指數（Aliphatic index）為96.04，總的平均親水值為0.098，很有可能是疏水性蛋白且疏水性不強。ProtScale 分析表明羅非魚NITR蛋白疏水性氨基酸殘基數目在整體上稍微略高于親水性氨基酸殘基數目，疏水性不是很明顯（圖2），為疏水性蛋白，與理化分析的結果一致，因此推測羅非魚NITR基因編碼的蛋白質為疏水性蛋白質。

使用Signal P 4.1 Server預測該序列的信號肽（Signal peptide），發現前19個氨基酸為信號肽序列，為分泌型蛋白；利用TMHMM Server 2.0預測跨膜結構域，發現在第251-273位氨基酸之間存在跨膜結構域（圖3）。SoftBerry-Psite預測該序列功能位點，發現該序列酪蛋白激酶II磷酸化位點6個，N-糖基化位點和蛋白激酶C磷酸化位點各有5個，N-豆蔻酰化位點4個，cAMP 和 cGMP相關磷酸化位點、酪氨酸激酶磷酸化位點以及原生質膜脂筏附著位點各有1個，CAAX box 6個，C末端定位信號序列微體6個。蛋白質亞細胞定位預測On-NITR蛋白在細胞中各位置的分布概率：細胞膜（64%），高爾基體（46%）、內質網（膜）（68.5%），內質網（腔）（10%）， 由 Cell-PLoc 2.0（http://www.csbio.sjtu.edu. cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）對On-NITR進行亞細胞定位預測的結果為細胞膜，這與該蛋白作為分泌型免疫受體的預測結果相互佐證。

2.2.2 On-NITR的高級結構和保守結構域預測 通過SOPMA分析羅非魚NITR蛋白的二級結構，發現該蛋白二級結構中由109個氨基酸組成延伸鏈（Extended strand），占31.96%；由97個氨基酸組成α螺旋（Alpha helix），占28.45%；由95個氨基酸組成無規則卷曲結構（Random coil），占27.86%；由40個氨基酸組成β折疊結構（（Beta turn）占11.73%。利用SWISS-MODLE在線預測蛋白質三級結構工具發現，On-NITR蛋白屬于免疫折疊蛋白，且與斑馬魚NITR蛋白具有一定的相似性，分析發現On-NITR蛋白結構模型與預測的蛋白質二級結構結果一致（圖4）。

圖1 羅非魚NITR及其推導的氨基酸序列

圖2 羅非魚NITR蛋白親疏水性預測

圖3 羅非魚NITR蛋白擴膜結構域預測

圖4 羅非魚NITR蛋白（A）與斑馬魚NTIR蛋白（B）三維結構

2.2.3 On-NITR同源性及進化分析 將本研究On-NITR基因編碼的氨基酸序列與NCBI數據庫中已經公布的其他物種的NITR氨基酸序列進行BLAST比對發現它們的相似度為27%-46%（表2），這與目前報道的其他物種間NITR的比對結果一致。

表2 羅非魚NITR蛋白與其他物種NITR蛋白比對

運用ClustalW軟件將羅非魚NITR的氨基酸序列與虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、斑馬魚（Danio rerio）、牙鲆（Paralichthys olivaceus）及桔點圓鲀（Spherodoies nephelus）等物種的NITR氨基酸序列進行多重序列比對（圖5）。綜合NCBI 對各物種的BLAST和InterPro在線軟件對各物種氨基酸的功能分析發現該序列含有1個信號肽區域和2個Igdomain區為IgV（25-139）、Ig（147-247），且分別包含1個甘氨酸連接橋區（GXG和FGXG），1個跨膜結構區（251-273），以及1個胞質尾區（274-341），該胞質尾區含有NITR典型的ITIM基序（305-312）（免疫受體酪氨酸抑制基序，Immunoreceptor tyrosinebased inhibitor motifs）和1個ITIM類似基序itim（321-326），且具有較高的保守性（圖5）。

2.3 On-NITR的組織表達分析

通過ABI 7500Real-Time定量PCR儀進行qRT-PCR分析，檢測健康羅非魚各組織NITR基因的表達量，結果（圖6）顯示，On-NITR基因在所取的9個組織中均能表達，在腸道中表達量最高，其次是皮膚、肝臟，在胸腺、鰓、脾臟、心臟、腦中的表達量較少，在頭腎組織中的表達量最少。

圖5 羅非魚NITR與其他物種的同源性比較

圖6 羅非魚NITR在不同組織中的表達情況

3 討論

本研究對依托實驗室轉錄組數據預測的羅非魚NITR分子進行了克隆鑒定，并推導出編碼的NITR氨基酸序列。BLAST分析顯示On-NITR序列與其他已報道的硬骨魚類之間的同源性為27%-46%。

盡管On-NITR與硬骨魚類的比對呈現較低的同源性，但是結構上都具有胞外免疫球蛋白結構域（Ig domain）—IgV和Ig（V/C2），并包含相應的甘氨酸連接橋基序（The glycine bulges of the joining mitif）［21］，1個跨膜結構域以及1個含有免疫抑制酪氨酸基序（ITIM）的胞質尾區，并且高度保守。On-NITR的兩個胞外Ig結構域內各含有一個甘氨酸連接橋區域GXG（GQG128）和FGXG（FGNG241），并含有8個保守的半胱氨酸殘基，這與斑馬魚、虹鱒等［6，8］其他硬骨魚類相一致。所有的半胱氨酸殘基都位于胞外區域，表明On-NITR蛋白可能與其他物種的Ig區半胱氨酸具有相同的功能—形成二硫鍵結合區；此外，On-NITR（N-X-S/T-X）的5個N-糖基化位點也全部都位于胞外Ig區，其他已報道的硬骨魚類含有2-7個，這些Ig區域的糖基化位點與該受體的黏附作用和識別其他抗原的功能息息相關［22］，這意味著On-NITR的Ig區可能在細胞間的黏附作用中起著關鍵作用。

在On-NITR的胞質尾區，含有1個免疫抑制酪氨酸抑制基序（ITIM，LHYAAL312）和1個類似 ITIM基 序 —itim（CVYSRV326）。On-NITR的ITIM區結構上與Ravetch等［23］提出的ITMI基序結構（I/V/L/S）XYXX（V/L）相一致，具有較高保守性，而itim基序不盡相同。Blery等［24］發現（I/V/S）TYSX（L/V）型基序只是屬于7種自然殺傷性細胞受體基序的一種，itim基序的出現表明ITIM基序在硬骨魚類中也存在一定的多樣性［25］。已有報道將含有正常的ITIM基序受體和ITIM基序中酪氨酸殘基發生突變的受體進行對比研究發現，ITIM基序在調節自然殺傷細胞受體抑制信號和結合其他免疫球蛋白受體方面具有重要作用［26，27］，On-NITR 的ITIM基序與上游的跨膜結構域相隔33個氨基酸，itim和ITIM中所含有的酪氨酸之間相距23個氨基酸，這與Bléry等［24］報道的哺乳動物自然殺傷細胞受體上的距離長度非常類似，通過蛋白空間構象與功能的密切聯系，可以推測On-NITR上的ITIM基序在功能上可能也相對保守。

有意思的是，On-NITR蛋白的結構特征與先天性免疫中的自然殺傷細胞免疫抑制受體（KIRs）類似［28］，與白細胞受體集群所編碼的免疫抑制受體所具有的調控位點和其他結構特征一樣，但是KIRs不含有IgV結構域和甘氨酸連接橋基序（J motif）。此外，On-NITR蛋白的結構特征與適應性免疫中的T細胞受體（TCRs）和免疫球蛋白（Igs）也非常相近［9］，都含有IgV結構域和甘氨酸連接橋基序。說明NITR蛋白很可能兼有先天性免疫和獲得性免疫蛋白結構特征。

組織分布結果顯示，On-NITR在羅非魚的腸道、皮膚、肝臟中表達量較高；其次是胸腺、鰓、脾臟、心臟及腦，在頭腎中的表達量最低。目前已報道的不同魚類的NITR基因在各組織中的表達情況差異較大，日本比目魚［12］和鯉［11］NITR在頭腎、脾臟和腸道中發生高水平表達，而斑點叉尾鮰［6］NITR1在頭腎、脾臟中表達量較高，但是NITR 2-4在腸道和頭腎中表達量很低，虹鱒［10］脾臟和頭腎中NITR1、NITR4都很高，但是NITR2、NITR3表達量很低。推測On-NITR的表達情況可能與NITR的類型有關。此外，NITR主要在硬骨魚類的巨噬細胞、B細胞、T細胞及NK-like細胞中被檢測發現，并且在各種不同細胞中的表達情況也具有一定差異［6］，暗示著On-NITR表達的差異情況很可能是由于不同組織的細胞種類不同而造成的。

4 結論

本研究成功克隆并獲得羅非魚NITR基因，該基因cDNA全長1 119 bp，ORF為1 026 bp，可編碼341個氨基酸。利用生物信息學相關方法對On-NITR蛋白結構和功能特點進行分析發現On-NITR具有1個信號肽區域、2個胞外Ig-domain區、1個跨膜結構域，以及一個有NITR典型的免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM）的胞質尾區，且具有較高的保守性。組織表達分析發現On-NITR在健康尼羅羅非魚組織中均有表達，在腸道、皮膚、肝臟表達水平較高，在胸腺、鰓、脾臟、心臟和腦組織中的表達量較低，在頭腎組織中的表達量最低。

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（責任編輯 狄艷紅）

Cloning and Tissue Expression Analysis of NITR in Nile Tilapia（Oreochromis niloticus）

WANG Zhi-wen HUANG Yu ZHANG Hai-yan TANG Ju-fen JIAN Ji-chang LU Yi-shan
（Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemilogy for Aquatic Economic Animals，Key Laboratory of Control for Diseases of Aquatic Economic Animals of Guangdong Higher Education Institutes，Fisheries College of Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088）

The encoding sequence of NITR（Novel immune-type receptor）gene（GenBank accession number：KX989509；designated as On-NITR）was cloned from the spleen of Nile tilapia（Oreochromis niloticus）. The complete cDNA sequence of On-NITR gene was 1 119 bp with an ORF of 1 026 bp encoding 341 amino acids. The deduced amino acid sequence of On-NITR had an estimated molecular weight of 37.38 kD and a theoretical pI of 8.28. Through NCBI BLAST，we found the amino acid sequence identities between On-NITR and previously reported fish NITRs were approximately 27% - 46%. Amino acid alignment indicated that On-NITR consisted of one typical signal peptide，two extracellular immunoglobulin（Ig）domains（V and V/C2），one transmembrane domain，and one highly conserved the cytoplasmic region with an immunoreceptor tyrosine-based inhibitor motif（ITIM）and an ITIM-like motif（itim）. Moreover，the analysis by real time quantitative PCR revealed that the expression of On-NITR was detected in all examined tissues of a healthy Nile tilapia with the higher expression level in intestine，skin and liver，while lower expression in thymus，gill，spleen，heart，and brain as well as the lowest level in head and kidney.

Nile tilapia（Oreochromis niloticus）；NITR protein；gene cloning；tissue expression analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.021

2016-11-06

廣東省科技計劃項目（2015A020209181），2016年廣東海洋大學優秀學位論文培育項目（201602）

汪志文，男，碩士研究生，研究方向：水產動物病害控制；E-mail：1278799202@qq.com

魯義善，男，教授，研究方向：水產動物病害控制；E-mail：fishdis@163.com