姜黃素類似物對Aβ25—35誘導的AD細胞模型細胞凋亡的影響

李超++畢鵬翔++董妍++雷佳宇++袁曉環++郭艷芹

[摘要] 目的 研究姜黃素類似物H8對Aβ25-35（β-amyloid protein 25-35）誘導的PC12細胞凋亡相關基因Caspase-3、Bcl-2、Bax表達的影響。 方法 CCK-8法檢測Aβ25-35及姜黃素類似物H8的細胞毒性，以Aβ25-35誘導PC12細胞（大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞）建立AD細胞模型，并使用不同濃度的H8進行干預，通過RT-qPCR法檢測各組凋亡相關基因Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達。 結果 H8在實驗濃度范圍內幾乎無細胞毒性，Aβ25-35具有明顯的細胞毒性并呈濃度依賴性，經過H8干預后細胞存活率明顯升高，其中以20 μmol/L的H8作用最明顯（P<0.001）。經過H8作用后能降低Aβ25-35誘導的Caspase-3、Bax mRNA表達，升高Bcl-2 mRNA表達。 結論 姜黃素類似物H8能夠抑制Aβ25-35誘導的凋亡相關基因，發揮抗凋亡作用。

[關鍵詞] 姜黃素類似物；細胞凋亡；Caspase-3；Bcl-2；Bax

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）10-0001-04

Effects of curcumin analogues on cell apoptosis induced by Aβ25-35 in AD cell model

LI Chao BI Pengxiang DONG Yan LEI Jiayu YUAN Xiaohuan GUO Yanqin

Mudanjiang Medical College， Mudanjiang 157011， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of curcumin analogue H8 on the expressionof apoptosis-related genes Caspase-3， Bcl-2 and Bax in PC12 cells induced by Aβ25-35（β-amyloid protein 25-35）. Methods The cytotoxicity of Aβ25-35 and curcumin analogue H8 were detected by CCK-8. The AD cell model was established using PC12 cells （rat adrenal pheochromocytoma cells） induced by Aβ25-35 and the cells were treated with different concentrations of H8. The expression of Caspase-3， Bcl-2 and Bax mRNA were detected by RT-qPCR. Results H8 had almost no cytotoxicity in the experimental concentration range， while Aβ25-35 had obvious cytotoxicity and concentration-dependent. The cell survival rate was significantly increased after H8 intervention， among them， 20 μmol/L H8 was most significantly（P<0.001）. After treatment with H8 could reduce Aβ25-35-induced Caspase-3， Bax mRNA expression and increase Bcl-2 mRNA expression. Conclusion Curcumin analogues H8 can inhibit Aβ25-35-induced apoptosis-related genes， with anti-apoptotic effect.

[Key words] Curcumin analogues；Cell apoptosis；Caspase-3；Bcl-2；Bax

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種進行性發展的神經系統退行性疾病，表現為認知功能不斷惡化，日常生活能力進行性減退和喪失[1]。AD的發病機制十分復雜，研究表明，神經細胞凋亡在AD發生發展中具有重要作用[2]。姜黃素（curcumin）是一種低分子量酚類化合物，提取于姜黃、郁金等姜黃屬植物的根莖中，藥理作用廣泛，具有抗炎、抗氧化、免疫調節、抗腫瘤、神經保護等多方面的藥理作用[3，4]。近年來研究發現姜黃素能夠抑制Aβ誘導的神經細胞凋亡。然而，姜黃素在體內的生物活性低、代謝快、吸收少、生物利用率低，極大地限制了其應用[5]。本實驗以姜黃素為母體去掉其β-二酮基團，設計了穩定的、分子量更小的戊-1，4二烯-3-酮類似物（H8）。本研究利用Aβ25-35誘導大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（PC12細胞）建立AD細胞模型，觀察姜黃素及其類似物對Aβ25-35誘導PC12細胞凋亡的影響并觀察其中凋亡相關基因及蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3表達的變化，闡明姜黃素類似物H8治療AD的可能機制，為研究和治療阿爾茨海默病提供實驗依據。

1材料與方法

1.1 藥品與試劑

DMEM培養基、青鏈霉素混合液、胎牛血清、胰蛋白酶（美國Gibco公司）；CCK-8試劑盒（上海同仁化工DOJINDO）；Trizol（美國Invitrogen公司）；逆轉錄試劑盒（美國羅氏公司Roche）；PCR引物（上海生工生物工程股份有限公司）；SYBR Green熒光染料（美國羅氏公司Roche）；姜黃素類似物H8[本課題組合成其化學名稱為：（2E，5E）-2，5-雙亞芐基環戊酮，HPLC檢測純度為99.3%]；Amyloid β-Protein Fragment 25-35（美國Sigma，貨號A4559）。

1.2 儀器

CO2恒溫培養箱（美國Thermo Fisher）、倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；低溫高速離心機（德國Eppendorf公司）；超凈工作臺（德國ESCO）；PCR儀（德國Eppendorf公司）；分光光度計（美國Beckman公司）；熒光定量PCR儀（美國 ABI stepone）。

1.3 細胞

PC12細胞（大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞）購自上海中國科學院細胞庫。

1.4 Aβ25-35配制方法

將1 mg Aβ25-35溶于943 μL三蒸水，配成1000 μmol/L母液，置于37℃培養箱孵育7 d，使之老化，分裝，于-20℃凍存。

2 實驗方法及分組

2.1 PC12細胞的培養

大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（PC12），為貼壁生長細胞，使用DMEM高糖培養基培養[內含10%胎牛血清及青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（100 μg/mL）]，于5% CO2的37℃恒溫培養箱中培養。第2天細胞貼壁后換液，當細胞匯合度達到70%～80%時傳代，細胞傳代貼壁后呈梭型，并有較長的突觸，取對數期生長細胞用于實驗。

2.2 CCK-8法檢測Aβ25-35、H8的細胞毒性

PC12細胞按4000個/孔的密度接種于96孔板，用含10% FBS的DMEM完全培養基進行培養，培養24 h后加入不同濃度的藥物。實驗分組為對照組、H8組、Aβ25-35組。H8組的濃度為1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L，Aβ25-35組的濃度為0、1、5、10、20、40、80 μmol/L，藥物作用24 h后，觀察細胞存活情況，在每孔中加入10 μL CCK-8試劑，避光，置于37℃、5% CO2培養箱中孵育4 h，室溫下避光振蕩3 min后在酶標儀450 nm處測定OD值，計算Aβ25-35的IC50值。細胞存活率（%）=（實驗組OD值-空白對照組OD值）/（對照組OD值-空白對照組OD值）×100%。

2.3 姜黃素類似物H8對Aβ25-35誘導的AD細胞模型細胞活性的影響

根據方法2.2結果最終選擇40 μmol/L的 Aβ25-35為最適造模濃度。將處于對數期生長的PC12細胞按4000個/孔的密度接種于96孔板，每孔100 μL。第一孔為對照孔，第2～6孔分別加入含H8的培養基預處理2 h，使其終濃度分別為2.5、5、10、20、40 μmol/L，然后加入Aβ25-35使其終濃度為40 μmol/L，共處理24 h，每個實驗孔同時設置4個副孔。藥物作用24 h后，觀察細胞存活情況，在每孔中加入10 μL CCK-8試劑，避光，置于37℃、5% CO2培養箱中孵育4 h，室溫下避光振蕩3 min后在酶標儀450 nm處測定OD值。

2.4 RT-qPCR檢測姜黃素及H8對Caspase-3、Bcl-2、Bax基因表達的影響

取對數期生長的PC12細胞按4×105/mL的密度接種于6孔板，實驗分為五組：（1）空白對照組：正常培養基培養細胞；（2）Aβ組：40 μmol/L Aβ25-35處理24 h；（3）低濃度H8+Aβ組：40 μmol/LAβ25-35+5 μmol/L H8；（4）中濃度H8+Aβ組：40 μmol/LAβ25-35+10 μmol/L H8；（5）高濃度H8+Aβ組：40 μmol/LAβ25-35+20 μmol/L H8。各實驗組首先使用H8預處理細胞2 h，然后加入40 μmol/L Aβ25-35共處理22 h，24 h后收集細胞提取RNA，采用RT-qPCR技術檢測各組細胞中Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達，通過2-ΔΔCT計算各基因相對表達水平。

2.5 統計學分析

采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，計量資料以（x±s）表示，使用One-way ANOVA對結果進行分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 姜黃素類似物H8及Aβ25-35的細胞毒性

在進行細胞實驗之前，首先對姜黃素類似物H8及Aβ25-35的細胞毒性進行考察，如表2所示：與對照組（DMSO）相比，不同濃度（1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L）的H8作用于細胞24 h后，均沒有引起明顯的細胞毒性，說明H8在檢測濃度范圍內對細胞幾乎無毒性。 表3示：Aβ25-35干預PC12細胞，藥物濃度為5 μmol/L時，細胞存活率為（86.82±2.74）%，與對照組相比，差異有統計學意義（P<0.05）；隨著Aβ25-35濃度增加，細胞存活率逐漸下降，當Aβ25-35濃度增加到40 μmol/L時，細胞存活率下降至（44.62±1.26）%，與對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.001）。根據SPSS 16.0 軟件計算IC50值為39.6 μmol/L，故選擇40 μmol/L Aβ25-35為造模濃度。

3.2 H8對Aβ25-35誘導的AD細胞模型的影響

加入不同濃度的H8干預后觀察對Aβ25-35誘導PC12細胞活性的影響。如表4所示：與對照組相比，Aβ組細胞存活率明顯下降（P<0.001）；與Aβ組相比，經過10、20、40 μmol/LH8干預后細胞存活率明顯升高（P<0.001），其中20 μmol/L的H8作用最明顯。以上實驗表明姜黃素類似物H8能抵抗Aβ25-35誘導的細胞毒性，發揮保護作用，提高細胞存活率。

3.3 Aβ25-35與H8對PC12細胞形態的影響

按方法2.3 加入不同濃度的Aβ25-35培養24 h后，顯微鏡下觀察細胞形態變化如封三圖1A所示：對照組細胞多呈梭型形，立體感強，細胞飽滿，折光度好，突觸較長，大多數具有小的突起，細胞密集，細胞碎片少。而經過不同濃度的Aβ25-35作用下，細胞總數量相對變少，細胞胞體皺縮，突觸變短消失，貼壁性差，有脫壁漂浮現象，細胞碎片較多。隨著Aβ濃度越大，細胞的狀態越差，細胞碎片也越來越多。經過不同濃度H8干預后細胞數量增加，細胞形態明顯得到改善（封三圖1B）。

3.4 姜黃素類似物H8對凋亡相關基因表達的影響

按方法2.4使用不同濃度的H8預保護2 h，除對照組外其他各組給予40 μmol/L Aβ25-35誘導細胞凋亡。RT-qPCR方法檢測H8對凋亡相關基因Caspase-3、Bcl-2、Bax表達的影響。從表5中可以看出，與對照組相比，Aβ組的Bax、Caspase-3基因mRNA表達均增加，差異具有統計學意義（P<0.001），Bcl-2基因的mRNA表達下降（P<0.001）；與Aβ組相比，H8低、中、高劑量組的Bax、Caspase-3 mRNA表達均下降（P<0.05或P<0.01或P<0.001），而Bcl-2基因的mRNA表達上升（P<0.05或P<0.01）。以上結果表明，Aβ誘導PC12細胞可使促凋亡基因Bax、Caspase-3表達升高、抗凋亡基因Bcl-2表達降低，經H8作用后可降低凋亡基因表達、增加抗凋亡基因表達，因此，H8具顯著的抗凋亡作用。

4 討論

阿爾茨海默病的病理特征為：細胞外異常淀粉蛋白（β-amyloid，Aβ）沉積形成的老年斑和細胞內過度磷酸化的Tau蛋白和微管形成的神經纖維纏結[6，7]，此外，還有因細胞凋亡而導致廣泛的神經元和突觸的丟失[8]。Aβ是構成SP的核心成分，也是神經纖維纏結以及血管淀粉樣變性的生化基礎[9]。Aβ可以通過多種途徑引起促細胞凋亡因素增加和抗凋亡的因素減少，最終引起神經元的變性、凋亡和壞死[10]。Horiuchi M等[11]研究發現，β淀粉蛋白過表達和過度沉積是神經元功能障礙的觸發者，在大腦內注射Aβ能夠使神經元受損[12]。因此，拮抗Aβ誘導的細胞凋亡可能是治療AD的一種方法。

姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、神經保護等多種藥理作用。但姜黃素在體內的活性偏低、水溶性差、口服后體內代謝過快和生物利用度低[5，13]，這主要是由于姜黃素結構中β二酮結構片段的不穩定性所造成的[14，15]。本實驗室通過化學合成方法設計了姜黃素類似物H8[化學名稱為：（2E，5E）-2，5-雙亞芐基環戊酮，純度為99.3%]，前期經過HPLC檢測姜黃素類似物H8降解率低，并且穩定性較好。

本實驗以Aβ25-35誘導大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（PC12）建立AD細胞模型，觀察發現不同濃度Aβ25-35作用于細胞后，細胞存活率逐漸下降，細胞形態明顯改變：細胞胞體皺縮，突觸變短消失，出現凋亡的表現，并呈劑量依賴性。經過H8干預后細胞存活率明顯升高，細胞形態得到改善，其中以20 μmol/L的H8作用最明顯（P<0.001）。RT-qPCR方法檢測結果發現，Aβ作用于細胞后抗凋亡基因（Bcl-2 mRNA）表達降低，促凋亡基因（Bax mRNA）表達升高，使用H8干預后改善了這一現象，提示H8能在基因水平對抗Aβ引起的細胞凋亡。

綜上，由于姜黃素類似物H8能有效地抑制Aβ誘導的細胞損傷，發揮抗凋亡作用，因此，深入研究和開發姜黃素類似物對阿爾茨海默病的治療和預防具有重要意義。

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（收稿日期：2017-02-26）