海南油茶優樹選擇及DNA指紋圖譜構建

陳偉文++鄭道君++楊立榮++云勇++陳加利++陳宣

摘要 通過初選、復選和精選，從海南島35個油茶居群中選出5株油茶優樹，它們具有抗炭疽病強、產果量高、含油率高等特點，鮮果出籽率45.57%～52.00%，鮮果出油率7.30%～10.93%，單位冠幅產油0.11～0.21 kg/m2，產油量770.55～1 470.05 kg/hm2，茶油的酸值在0.21～0.30 mg/g之間，不飽和脂肪酸含量85.78%～89.10%，亞油酸含量5.06%～6.32%?；赟RAP標記，以引物組合Me1/Em4可把5個優樹區分開，構建了直觀、清晰、簡單的DNA指紋圖譜。

關鍵詞 油茶；優樹；DNA指紋圖譜

中圖分類號 S565.9 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）07-0005-03

Selection and DNA Fingerprinting Construct of Camellia oleifera in Hainan

CHEN Wei-wen 1 ZHENG Dao-jun 2 YANG Li-rong 2 YUN Yong 2 CHEN Jia-li 2 CHEN Xuan 2 *

（1 Forest Seed and Seeding General Station of Hainan Province，Haikou Hainan 570203； 2 Institute of Tropical Horticulture，

Hainan Academy of Agricultural Sciences）

Abstract 5 plus trees from 35 populations were checked ultimately in Hainan，the results showed that these plus trees with the characters of anti-anthrax，high fruit and oil production.The plus trees′ fresh seed rate was 45.57%～52.00%，oil production rate was 7.30%～10.93%，oil production was 0.11～0.21 kg/m2 in crown units，oil production was 770.55～1 470.05 kg/hm2，and the oil acid value was 0.21～0.30 mg/g，the unsaturated fatty acids was 85.78%～89.10%，the linoleic acid content was 5.06%～6.32%.Based on SRAP markers，the primer composition Me1/Em4 could distinguish the 5 plus trees，construct clear and simple DNA fingerprintings.

Key words Camellia oleifera；plus trees；DNA fingerprinting

油茶（Camellia oleifera Abel.）與橄欖、油棕、椰子并稱世界四大木本油料植物，其茶油有豐富的營養成分和優越的保健功能，有“食油之王”“東方橄欖油”等美譽，已被國際糧農組織列為重點推廣的健康型食用油[1]。海南省具有發展油茶產業的優質特色資源和氣候環境優勢，油茶產業又是極富有開發前景的特色生態產業[2]，充分挖掘海南省油茶資源，選育新品種，可加快海南省農林業產業結構調整，促進農民增收，對促進海南省國際旅游島建設具有非常重要的意義。但是，由于海南油茶資源開發較晚，目前還沒有經過審定的品種，單株產量低、良種少已成為當前海南油茶發展的關鍵瓶頸問題之一[3-5]。

目前，從現有林分中選擇優良單株，是油茶新品種（無性系）培育的必經步驟。從20世紀60年代起，我國油茶育種工作者相繼在全國各地選擇了林相較好的6 700 hm2油茶林進行選優，初選優樹11 000多株。經過復選和精選，最后決選出1 000多株優樹。其中，廣西、江西、湖南、浙江等?。▍^）較多[6]，如安徽農業大學從1999年8月開始對安徽舒城縣境內的油茶品種資源狀況做了一次較為全面的調查，并在現有資源中初選出2個優良單株[7]。安徽省農業科學院針對安徽省祁門縣境內原有的實生油茶林資源進行考察研究，并篩選出一批優株[8]。重慶市林業科學研究院等單位調查了重慶市36個油茶林分布，實測235株油茶單株，初步選出63株優樹[9]。目前生產上廣泛應用的無性系或品種，如湘林系列、亞林系列、贛系列、豐系列、長林系列、岑軟系列和桂無系列，均是在優株基礎上培育而成。

為了較好地鑒定油茶新品種或無性系，國內學者應用分子標記技術研究構建了部分油茶新品種或無性系。如林萍等[10]采用SRAP標記技術，對油茶長林系列進行分析，建立了全部供試材料的DNA指紋圖譜，實現了12個無性系的有效鑒別；李阿池[11]通過建立和優化AFLP體系，構建了從福建省17個縣市50份參試材料的DNA指紋圖譜；張國武等[12]、溫 強等[13]采用ISSR分子標記方法，建立了25個油茶無性系的DNA指紋庫。可見，應用分子標記技術對油茶新品種（系）進行研究可獲得可靠的結果。據此，本研究擬篩選出海南油茶優樹并構建DNA指紋圖譜，為海南油茶資源開發利用提供可靠的科學依據。

1 研究內容與方法

1.1 調查范圍和時間

在查閱植物標本和相關文獻資料基礎上，采用踏查法結合走訪當地農戶、農林業部門、油茶加工點，尤其是油茶果實或茶油收購商，對海南島油茶資源分布情況進行了全面的實地調查。同時，對各分布區15年以上油茶林林分現狀進行了調查。項目組走訪調查了海南省?？?、定安、文昌、瓊海、澄邁、屯昌、瓊中、五指山和臨高9個市（縣）的38個鄉鎮（國營農場），重點調查了分布區內的35個油茶林（表1），這些鄉鎮基本涵蓋了海南省主要油茶分布區。調查時間從2013年9月至2015年11月，包括了3個油茶花果期。

1.2 優選方法

通過實地調查，初步觀測油茶的樹形、果實分布、果實大小和花芽分布等情況，以及植株的病蟲害情況，并剖視果皮厚薄程度。初步估計樹冠掛果平均1.0 kg/m2以上，春梢枝數不少于掛果枝數，80%以上的春梢有花芽，而且花芽健壯、分布均勻者，即為初選優株。在此基礎上，分株采集充分成熟的果實測定相關的性狀指標，并在樹干上掛牌標記優樹編號。

1.3 優樹選擇標準

油茶優樹選擇標準參照中華人民共和國林業行業標準《油茶第1部分：優樹選擇和優良無性系選育技術規程》（LY/T 1730.1—2008）進行。海南油茶母株優樹選擇的條件如下：

（1）樹形完整，樹冠開張，生長良好。

（2）無病或病害較輕，果實炭疽病率在3%以下。

（3）果實大小分布均勻，按冠幅乘積計算，2年平均單株鮮果產量為1 m2冠幅產茶果1.0 kg以上，小年產量不低于大年的50%；鮮果含油率7%以上；茶油酸價0.3以下。

（4）決選時，在上述條件相近的情況下，優先選擇亞油酸含量高的單株（亞油酸的含量是選擇和判斷油茶品種品質優劣的重要評價指標之一）。

1.4 茶油理化性質

種仁含油率測定采用索氏抽取法，具體步驟參照中華人民共和國國家標準《植物油料含油量測定》（GB/T 14488.1—2008）。油茶籽脂肪酸甲酯的制備按照GB/T 17376—2008標準進行，按照GB/T 17377—2008標準進行氣相色譜分析。茶油酸值測定按《食用植物油衛生標準分析方法》（GB/T 5009.37—2003）中酸值的測定方法進行。

1.5 優樹DNA指紋圖譜構建

采用改良CTAB法提取油茶總DNA，PCR-SRAP擴增實驗體系參考林 萍等[10]方法，然后取10 μL PCR擴增產物，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，EB染色后，在Gel Doc XR型凝膠成像系統中觀察、分析、記錄，每個反應重復1次。

根據PCR擴增產物的電泳結果，采用人工讀帶的方法，在凝膠的某個相同遷移率位置上有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”，獲得每個引物的Excel 0-1矩陣。擴增片段大小參照DNA ladder估測，擴增片段編號由引物編號加片段大小組成。分別統計分析各優樹的特異標記、唯一缺失帶以及單一引物（組合）的特征譜帶。篩選出最佳引物（組合）后，根據0-1矩陣在Excel中繪制膠板圖的標準化圖，從而構建油茶優株的DNA指紋圖譜。

2 結果與分析

2.1 海南油茶優樹初選結果

2013年10—12月之間，通過實地調查35個油茶居群（表1），實測243株油茶樹，結果表明，海南油茶種仁出油率較高，平均值為51.98%，海南不同油茶居群茶油的出油率變化不大，變異系數僅為4.21%；酸值、碘值和過氧化值在不同油茶居群間的變化則較大，平均酸值0.45 mg/g，變異系數達到38.6%；平均碘值102.99 g/100 g，變異系數為20.62%；平均過氧化值為3.39 mmol/kg，變異系數為27.92%。從中初選優樹30株，這些初選優樹的鮮果出籽率均達到38%以上，樹體生長良好，無病蟲害。

在2014年10—12月、2015年10—12月分別對上述初選優樹進行復選和精選，最終確定5株優樹。5株優樹的形態與經濟性狀表現分別見表2和表3。

2013—2015連續3年的觀測結果表明，所選優樹的花白色，通常初花期在10月下旬至11月下旬，果實成熟期10月中上旬至11月上旬，具有抗炭疽病強、產果量高、含油率高等特點。單鮮果重26.66～76.69 g，鮮果出籽率45.57%～52.00%，鮮果出油率7.30%～10.93%，單位冠幅產油0.11～0.21 kg/m2，產油量770.55～1 470.05 kg/hm2，連續3年觀測平均值見表4。茶油酸值在0.21～0.30 mg/g之間，不飽和脂肪酸含量85.78%～89.10%，亞油酸含量在5.06%～6.32%之間（表5），相關特性指標表現優異。

2.2 優樹指紋圖譜

基于SRAP標記，以引物組合Me1/Em4可把5個優樹區分開，構建了直觀、清晰、簡單的DNA指紋圖譜。其中瓊優1在1 200 bp處有特異帶，瓊優2在1 800 bp和850 bp處有特異帶，瓊優3在500 bp和180 bp處有特異帶，瓊優4在950 bp處有唯一缺失帶，瓊優6在1 500 bp和350 bp處有特異帶，均可作為唯一特異性鑒別條帶。

3 結論

3.1 篩選獲得優樹5株

本研究最終確定5株優樹，特征為花白色，通常初花期在10月下旬至11月下旬，果實成熟期10月中上旬至11月上旬，平均單鮮果重42.33 g，平均鮮果出籽率為48.04%，鮮果平均出油率為8.59%，單位冠幅平均產油量為0.14 kg/m2，最高可達0.21 kg/m2，平均產油量為952.48 kg/hm2，最高可達1 470.05 kg/hm2，茶油平均酸值在0.24 mg/g，不飽和脂肪酸含量85.78%～89.10%，亞油酸含量在5.06%～6.32%之間，平均為5.69%，相關特性指標綜合表現優異。

3.2 構建優樹的DNA指紋圖譜

基于SRAP標記，以引物組合Me1/Em4可把5個優樹區分開，構建了直觀、清晰、簡單的DNA指紋圖譜。

4 參考文獻

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