鋁離子對神經細胞突觸生長的影響

王明明　梅潁　陽小飛

摘要：為了探討金屬鋁離子在小鼠神經細胞生長分化中的影響，采用小鼠大腦皮層細胞作為實驗材料，在細胞生長分化過程中加入濃度不同的金屬離子，等細胞生長至14 d時，對細胞進行免疫熒光染色，使用激光共聚焦顯微鏡對細胞進行拍照，并利用ImageJ軟件和GraphPad Prism 5.01軟件對神經細胞突觸的數目和大小進行統計學分析。結果表明：在鋁離子濃度較低的情況下，不會對神經細胞的突觸數目和突觸大小造成影響；隨著鋁離子濃度的升高，作用時間越長，對神經細胞損傷越大，直至神經細胞全部死亡；而其影響主要表現在使突觸數量減少，而對突觸的大小并沒有顯著的影響。

關鍵詞：小鼠大腦神經細胞；神經細胞分化；鋁離子；突觸形成

中圖分類號：Q253

文獻標識碼：A文章編號：16749944（2017）8022903

1引言

自閉癥譜系障礙（ASD）和阿爾茲海默癥（AD）均是由突觸功能障礙或突觸病變引起的神經系統疾病[1]。突觸形成和突觸功能的完善受到特定基因的調控，突觸功能障礙和突出病變與這些基因緊密相關。但是，基因外其他因素的影響同樣不容忽視。體內金屬離子含量失衡就是其中一個很重要的因素[2，3]。過去，很多研究用以證明人體內的各種金屬離子的重要性和毒性，這些研究發現，金屬離子對人體是否有害是有一個安全值的。當低于此安全值，有的金屬對人體是無害的，甚至是不可缺少的；當超過這個安全值，即便是人體必須的金屬元素，都會對人體造成傷害[4]。

隨著現在人們使用金屬制品的增多，人們對金屬離子特別是有毒金屬離子的攝入量也隨之增加，其在人體內長期蓄積，對機體神經系統的發育和功能產生干擾，當其濃度超過了安全值，便會對神經細胞造成傷害。在對自閉癥和阿爾茲海默癥患者的頭發樣品鑒定中發現，Zn、Ca、Fe、Mg、Mn和Se明顯低于正常人；同時，Al、As、Cd、Hg和Pb的濃度偏高[5，6]。而且，癥狀的嚴重程度與體內有毒金屬含量有很大關系[7]。

為了探究鋁離子對神經細胞生長分化特別是突觸形成的具體影響及其作用機制，利用體外培養的小鼠大腦皮層神經元細胞，在不同的時間向細胞培養基中加入梯度濃度的AlCl3溶液，然后利用免疫熒光染色，對神經細胞突觸的數量和大小進行記錄并對實驗數據進行統計學分析。試驗結果表明：在金屬濃度比較低時，無論作用時間長短，對神經細胞突觸形成均沒有影響；當Al離子濃度高于200 μM后，離子濃度越高，作用時間越長，對神經突觸的傷害越大，直至神經細胞全部死亡，而且金屬離子對神經細胞的影響主要表現在對突觸數目的影響，而對突觸的大小并沒有顯著影響。

2材料與方法

2.1材料

小鼠大腦皮層神經元細胞。胎牛血清（FBS，生化試劑，Gibco公司）；B-27；運鐵蛋白（Transferrin）；胰蛋白酶（Gibco公司）；葡萄糖（Glucose）；HEPES；鹽酸阿糖胞嘧啶（Ara-C）；多聚-L-賴氨酸；AlCl3。

2.2試劑與儀器

相差顯微鏡（奧林巴斯CKX41）；超凈工作臺（蘇州凈化）；二氧化碳培養箱（Thermo Fisher）；共聚焦顯微鏡（Nikon）。

2.3方法

2.3.1實驗溶液配制

利用胎牛血清、DMEM等試劑配置實驗所需的細胞培養基及相關緩沖液。所有溶液均需調整滲透壓和pH值至適宜細胞生長的實驗進行的值，并以適當方式進行除菌[8]。

2.3.2小鼠大腦皮層細胞培養

新生野生型小鼠，分離其大腦皮層與海馬細胞，用0.25% Trypsin-EDTA消化酶消化12 min，消化完成后用培養基終止消化，然后將大腦皮層細胞與海馬細胞吹打下來，加入鍍有多聚賴氨酸的玻片上進行培養，分別在培養第1、4、9 d進行換液，同時向培養基中加入不同濃度的金屬離子溶液。第1 d為神經元換無Ara-C的生長培養基，第4、9 d換含4 μM Ara-C 生長培養基[8]。培養14d后進行免疫熒光染色。

2.3.3細胞免疫熒光染色

用4%多聚甲醛（PFA）在4 ℃環境中固定12 min；用1x的PBS清洗1次之后，用0.2% TritonX-100對神經細胞室溫通透5 min，然后用1x的PBS浸洗5 min；用5%牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉30 min；吸去BSA后，一抗室溫孵育2 h；然后用1x的PBS浸洗3次，每次5 min；加入熒光二抗，室溫孵育30 min，在加入熒光二抗之后，所有的操作應注意避光；30 min后，用1x的PBS浸洗5次，每次5 min，最后用含抗熒光淬滅劑的封片液封片。封片完成后，在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

2.3.4數據處理

將所得圖片使用軟件Image J （National Institutes of Health）進行分析：隨機選取神經細胞的軸突，把直徑大于0.42 μm且小于12.6 μm的點視為突觸，并測量該段軸突的長度。將所獲得的突觸的數量和大小用Graph pad Prism 5.01（Graph Pad Software，Inc）軟件進行統計學分析，并對實驗組與對照組進行t檢驗，并使用Adobe Illustrator CC （Adobe Corporation）進行統計圖繪制。

3結果

3.1第1d加入Al離子對小鼠神經細胞突觸形成的影響

研究表明，在ASD和AD患者的病因主要是突觸功能障礙和突觸病變，而更深層次的原因是基因和基因為因素的共同影響。在ASD和AD患者體內，Al離子濃度明顯升高，且與患者的癥狀嚴重程度成正相關。為了探究Al離子對神經細胞生長分化特別是對突觸生長的影響，我們選取小鼠大腦皮層神經細胞，分別在培養的第1、4、9 d，向培養基中加入梯度濃度的AlCl3溶液，濃度梯度為：10 μM，100 μM，200 μM，300 μM，500 μM。在培養14 d以后，對細胞進行免疫熒光染色，然后利用激光共聚焦顯微鏡對細胞進行成像，并對數據進行分析處理，然后再對三次獨立重復試驗進行統計學分析。

在細胞生長第1 d加入AlCl3溶液，并培養14 d以后，10 μM，100 μM組別與對照組相比，無論單位長度的突觸個數，還是突觸大小，并沒有明顯差異。在200 μM，300 μM組別中，與對照組相比，單位長度的突觸個數明顯減少，但是突觸的大小并沒有明顯差異。在500 μM的組別中，神經細胞已全部死亡。這說明，當Al離子濃度較低時，不會對神經細胞的突觸形成造成影響，而當其濃度超過一定范圍，便會對突觸形成帶來危害，如果濃度過高，則會導致神經細胞死亡（圖1）。

3.2第4 d加入Al離子對小鼠神經細胞突觸形成的影響

第4 d加入的AlCl3溶液濃度梯度為：10 μM，100 μM，200 μM，300 μM，500 μM，培養14 d之后，進行免疫熒光染色，利用共聚焦顯微鏡成像，用Image J對圖像進行分析，將所得數據進行統計分析，然后將3次獨立重復試驗進行統計學分析，其結果如圖2。

在第4 d加入AlCl3溶液后，10 μM，100 μM，200 μM，300 μM的組別無論單位長度內的突觸個數還是突觸的大小與對照組相比均沒有明顯差異，但500 μM的組與對照組相比，單位長度的突觸個數有明顯差異，但突觸大小仍沒有明顯差異。這說明，隨著作用時間縮短，同樣濃度的Al離子對突觸的形成造成的危害程度會相應的降低，但是高濃度的Al仍然會對突觸造成傷害。

3.3第9 d加入Al離子對小鼠神經細胞突觸形成的影響

第9 d加入的AlCl3溶液濃度梯度為：10 μM，100 μM，200 μM，300 μM，500 μM，培養14 d之后，進行免疫熒光染色，利用共聚焦顯微鏡成像，用Image J對圖像進行分析，將所得數據進行統計分析，然后將3次獨立重復試驗進行統計學分析，其結果如圖3。

結果顯示，在第9 d加入AlCl3溶液后，各實驗組與對照組相比，無論單位長度的突觸數量還是突觸的大小，均沒有明顯差異。

由以上結果可以得出，當AlCl3 濃度較低時，不會對小鼠大腦皮層神經細胞的突觸生長造成影響，且與作用時間長短無關；當AlCl3的濃度超過200 μM時，如果作用時間較短，對突觸生長并無明顯影響，如果作用時間較長，便會對突觸的生長造成危害；如果濃度過高，作用時間過長的話，甚至會導致神經細胞死亡。這說明，當作用時間過短時，在我們的濃度梯度內，不會對神經細胞的突觸形成造成危害。不過，也有可能此時神經突觸已經形成，加之Al離子作用時間過短，無法對其造成影響。

4討論

由于本實驗研究對象為神經細胞，所以選取小鼠大腦皮層神經細胞作為實驗材料，均為原代培養，所用小鼠為新生野生型小鼠。通過在小鼠神經細胞生長的培養基中加入梯度濃度的AlCl3溶液，通過采集小鼠神經細胞單位長度突觸的數目和突觸的大小等數據，來研究不同濃度的鋁離子對小鼠神經細胞突觸形成的影響。

對所采集到的數據進行統計學分析后發現：當Al離子濃度低于200 μM時，無論對小鼠神經細胞作用時間長短，均未對神經細胞的突觸個數和大小產生影響；當Al離子濃度超過200 μM，Al離子對神經細胞作用時間越長，對神經細胞突觸的形成的影響越大，單位長度的突觸數量顯著減少，但突觸的大小并沒有顯著改變；當Al離子濃度過高（達到或超過500 μM），作用時間過長的情況下，會直接導致神經細胞全部死亡。這說明，Al離子在人體內蓄積，特別是在神經系統內蓄積的時候，對神經細胞的生長分化是十分不利的。

另外，現有研究發現，Al離子對神經系統的損傷是一個非常復雜的過程，而且可以通過多種方式對神經系統造成傷害：一方面，鋁離子不僅能夠非競爭性抑制乙酰膽堿脂酶，產生神經毒性作用，觸發β-折疊，促進神經原纖維纏結形成，干擾神經傳導和誘導細胞的氧化損傷而發揮直接的毒性作用[9，10]；另一方面，還能夠作用于小分子物質，調節血清的金屬動態平衡，促進鐵介導的氧化反應而間接發揮毒性作用[11]。

神經系統的結構組成與功能實現完全取決于神經細胞的生長及分化，而突觸聯結是神經環路中不同神經元之間信息傳遞的關鍵節點，因此可以說神經細胞的生長分化中重要的部分就是神經突觸的形成。因此，研究神經細胞突觸的形成及其影響因子是研究生物神經系統的重要部分；同時對突觸功能障礙或突觸病變類疾病的醫學探究和病理學研究也具有極大意義。

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