植物防御素在抗植物病害方面的應用

何玲++楊素云++劉媛++曹旭++鐘婧++竺錫武++吳娟

摘要 植物防御素是一類堿性、富含半胱氨酸、具有抗菌活性的低分子量多肽。不同植物防御素抗菌活性差異較大，但高級結構相似，都是1個α-螺旋和3個反向平行的β片層結構。植物防御素具有抑制酶活、抑菌、抑制癌細胞生長等功能，其作用機理主要是與真菌細胞膜上鞘脂等復雜脂類相互作用。植物防御素具有抗菌譜廣泛和高效性的特點，將在植物抗病基因工程和作物品種改良中發揮重要作用，并有望開發成為新型的抗菌劑以減少農藥的使用。本文綜述了植物防御素的結構、功能、作用機理以及在植物抗病蟲害基因工程上的應用研究進展。

關鍵詞 植物防御素；抑菌作用；基因工程；病害

中圖分類號 Q946 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）07-0147-03

Application of Plant Defensin on Plant Disease Resistance

HE Ling 1 YANG Su-yun 1 LIU Yuan 1 CAO Xu 1 ZHONG Jing 1 ZHU Xi-wu 1，2 WU Juan 1，2 *

（1 College of Agriculture and Biotechnology，Hunan University of Humanities，Science and Technology，Loudi Hunan 417000；

2 Collaborative Innovation Center for Farmland Weeds Control ）

Abstract Plant defensin is one kind of short peptides with low molecular weight，basic，cysteine-rich and antimicrobial activity.Antimicrobial activity of different plant defensin have large difference，but the higher structures are similar，which have one α-helix and three antiparallel β-sheets.Plant defensins can inhibit enzyme activity，antifungal activity and cancer cell proliferation.The mechanism of plant defensins is that it binds the complex lipids those from the outside of fungal plasma membrane.Because of broad anti-microbes activity and high efficiency，it will play an important role in plant genetic engineering of disease resistance and varieties improvement of plant，even be used as novel germicides in order to reduce the use of pesticides.The structural characteristics，biological functions，mechanism，progress in plant genetic engineering of plant defensins were reviewed in this paper.

Key words plant defensin；antifungal activity；genetic engineering；disease

植物像動物一樣也有一個內在的防御系統，在外部病原菌侵染下，植物體內精巧的免疫防御系統會被誘導激活。這種反應一般稱為植物的系統誘導抗性，對一系列不相關的病原菌有廣譜抗性[1]。植物體內會合成大量的抗性化合物，一些抗菌蛋白質也會被誘導產生，以阻止病原菌進一步繁殖擴展[2]。植物防御素正是這樣一類具有抗菌活性的低分子量短肽。

防御素最早發現于哺乳動物多形核中性粒細胞中，后來從昆蟲中也提取到了昆蟲防御素，在分子量、電荷及對革蘭氏陽性菌的抗性上，與哺乳動物防御素有很大的相似性[3]。1990 年，Mendez 等發現了第1個植物防御素，其氨基酸序列、保守氨基酸位點和三維結構與昆蟲防御素相似[4]。植物防御素是一類分子量小（約5 kD，由45～54 個氨基酸組成）、堿性、富含半胱胺酸、具有抗菌活性和復雜三維結構的陽離子多肽。

1 植物防御素的結構

防御素一般是分泌型蛋白，其編碼區域主要可分為2個部分。一個是信號肽區域，主要由疏水性氨基酸組成，引導防御素前體蛋白與膜脂結合通過膜分泌到胞外空間；另一個是成熟肽區域，前體蛋白到達特定部位后，切除信號肽成為成熟蛋白質發揮作用[5]。目前，已鑒定出數百種植物防御素，不同植物防御素抗菌活性具有較大差異。植物防御素通常由50個左右氨基酸殘基組成，分子量約為5.0 kD，其中除8個保守半胱氨酸殘基外，其余均非常不保守。同源性較低，但高級結構非常相似。如從蘿卜種子中分離的防御素（Rs-AFP1），其高級結構通過核磁共振闡明由1個α-螺旋和3個反向平行的β-折疊片層組成一個緊密的球形結構，位于α-螺旋中的第21位、25位Cys與位于第3個β-折疊片層中的第45位、47位Cys形成了2對二硫鍵，8個保守半胱氨酸殘基形成了4對二硫鍵對維持該結構發揮關鍵作用，因此命名為Cys穩定的α-螺旋、β-折疊結構，簡稱CSαβ（Cysteine stab-ilized α β motif）[6]。豌豆種子防御素PsD1[7]和綠豆防御素VrD1[8]的基本結構也類似。

2 植物防御素的功能

2.1 抑制酶的活性

植物防御素SIα1、SIα2和SIα3均對昆蟲消化酶α-淀粉酶有特異性抑制作用，但是對來自其他生物的α-淀粉酶無抑制活性或只有很弱的抑制活性[6]。另外，來自綠豆的防御素VrD1在昆蟲飼料中含量達0.2%時就能使昆蟲致死[9]。因此，植物防御素很有可能通過抑制昆蟲對淀粉的消化來殺蟲，在植物抗蟲方面發揮重要作用。來自殺蟲植物豬腸豆（Cas-sia fistula Linn.）的一種植物防御素5459有胰蛋白酶抑制活性，而另外一種多肽5144則無該活性，二者只有幾個氨基酸的區別[10]。

2.2 抑菌作用

大部分植物防御素都具有抑制真菌生長的功能，其IC50取決于真菌種類和植物防御素來源。H.Saitoh等[11]用馬鈴薯病毒載體PVX在本生煙中表達芥末的防御素蛋白WT1，再從病毒感染的葉片中提取，并用親和層析的方法純化蛋白，測得WT1抑制稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）的IC50為5 μg/mL，抑制灰霉病菌（Botrytis cinerea）的IC50為20 μg/mL。李 平等[12]研究報道苜蓿種子防御素基因alfAFP在酵母中有效分泌表達，加alfAFP酵母表達產物22.0 μg 時對紋枯病有較強的抑菌圈，加入量為21.98和22.00 μg 時對稻瘟病和白葉枯病有一定的抑制作用。

植物防御素的抗微生物活性主要表現在抗真菌上，也能抑制部分細菌，但作用偏弱。如H.Saitoh等[11]報道純化的防御素WT1-His6在濃度為10 μg/mL時對病原真菌稻瘟病菌和灰霉病菌的菌絲生長有明顯的抑制作用，但是對病原細菌假單胞菌沒有明顯抑制作用；濃度達到20 μg/mL時，才能觀察到微弱的生長抑制作用。

2.3 抑制癌細胞生長

植物防御素對特定種類人腫瘤細胞的抑制活性已有報道，如來自田豆的植物防御素Sesquin能夠抑制白血病的L1210和M1細胞系，抑制率分別達到35%、80%；對乳腺癌MCF-7細胞系抑制率約80%[13]。

3 作用機理

與人、昆蟲的防御素不同，植物防御素在人工磷脂膜上不能形成離子通道，也不改變磷脂雙分子層的電荷特性。說明其不直接作用于真菌質膜磷脂[14]。因為真菌細胞膜上磷脂分布于內側，鞘脂、麥角甾醇等復雜脂類分布在外側，所以植物防御素更可能是作用于膜上鞘脂等復雜脂類，然后誘導一系列快速反應，如Ca2+ 吸收、K+ 流出、改變膜結構及通透性等[15]。大麗菊植物防御素（DmAMP1）與真菌質膜中甘露糖苷二肌醇磷脂酰神經酰胺M（IP）2C相互作用，來自胡蘿卜種子的植物防御素（RsAFP2）則是結合菌類質膜中葡糖神經酰胺（GlcCer）[16]。ELISA檢測發現，RsAFP2只作用于真菌類的神經酰胺，并不作用于人和植物，因為其神經酰胺結構不同，如神經鞘胺脂底部分枝的9-甲基基團、不飽和程度和脂肪酸鏈長度。這些結構特征決定著其與防御素的作用特點[16]。

4 在植物抗病蟲害基因工程中的應用

植物防御素所表現出來的生物學活性如抗微生物、殺蟲活性等，使其成為植物抗病蟲害基因工程的優良候選材料。禾谷類是病蟲害高發作物，防御素基因工程在禾谷類作物的病蟲害抗性研究中起到了重要作用。Kanzaki等[17]用農桿菌介導法將防御素WT1的基因導入水稻，22個T2代純合株系對稻瘟病菌表現出不同程度的抗性，由其中2個高抗株系得到的T3代植株病斑比對照株縮小了約1/2。

有些植物防御素不僅對1種真菌起作用，而是對多種植物真菌病原體均有抑制活性，是其在植物抗病蟲害中的又一大優勢。真菌病害是瓜類危害最嚴重的病害，在西非廣泛種植的一種高度耐干旱甜瓜Egusi的產量受枯萎病和黑斑病的影響極大。2010年Ntui等[18]通過根瘤農桿菌EHA101介導，獲得轉防御素WT1基因甜瓜。對轉基因植株進行了RT-PCR、northern和western blot分析，目的基因在甜瓜植株中有效表達。離體葉片接種枯萎病菌或早疫病菌后，引起的病征比非轉基因對照延遲3 d出現，且壞死病斑較小，總面積僅有非轉基因對照的1/3。整株植株的體外感染試驗結果類似，對于早疫病菌引起的黑斑病和枯萎病菌引起的枯萎病，轉基因植株較非轉基因植株表現出更高的抗性。值得注意的是，這些轉基因株系表現出對枯萎病和黑斑病的抗性是非特異性的，意味著這種抗性能夠長久的保持，而且在田間環境下也是有效的。這些轉基因甜瓜可能對于其他真菌病害也有抗性，如Kanzaki等[17]報道表達防御素WT1的轉基因水稻能抑制稻瘟病生長，Khan等[19]報道表達防御素WT1的轉基因土豆對灰霉病菌表現很高的抗性。因此，推測防御素WT1能抗許多真菌病原菌，甚至包括一些細菌病原菌。

抗病基因抗菌譜不夠廣、病菌對其敏感度易下降或田間抗病效果不理想等缺點限制了植物抗病基因工程的發展。植物防御素是對大部分動植物真菌病害和細菌病害都有效的一類抗菌蛋白，其基因可作為優良抗病基因轉入植物基因組，且其本身對于人和動物食用安全，如防御素WT1基因來自芥末（一種日本料理的主要調味料）。目前已有多種防御素基因導入植株中用于增加植株抗性，并檢測到已表達的植物防御素蛋白及其抗菌活性。如把來自紫花苜蓿防御素的基因MsDef1轉入番茄基因組中，獲得轉基因番茄植株對枯萎病有較好抗性[20]。Terras等[21]將一種蘿卜種子防御素Rs2AFP2的基因轉入煙草，其表達量可達葉片總蛋白的0.2%，明顯增強了煙草植株對小葉病原菌煙草赤星病菌（Alternaria longipes）的抗性，之后有研究人員將其應用于番茄，獲得類似結果[22]。

但轉植物防御素基因的植物一般不會對某種病原菌產生完全抗性，要想獲得完全的抗性或者更強的抗性，可以將其他抗性基因一起轉入植物細胞[18，23]。植物防御素與其他抗菌化合物協同作用，有助于增強植株抗性，甚至還可能增強對非生物脅迫的適應能力[6]。Chen等[24]將煙草的β-1，3-葡聚糖酶、苜蓿防御素alfAFP及雙價基因轉入番茄，轉基因植株對青枯病菌（Ralstonia solanacearum）的抗性增強，且雙價基因轉化株抗性更高。

5 結語

總之，植物防御素以其廣泛的抗菌譜和高效性的特點，有望在研制新型綠色生態抗菌劑和培育新品種方面發揮重要作用，建立無污染的農業生態生產模式。但是植物防御素的胞內受體以及外界條件對植物防御素基因表達的誘導機理尚不明確，植物防御素基因轉入植物后基因表達的沉默問題也需要進一步研究。

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