海綿放線菌的分離與抑菌活性篩選研究

杜英俠++任浩杰++張菊林++付晚濤

摘要 本文用5種分離培養基從大連海域潮間帶采集的2種海綿中分離培養放線菌，以副溶血弧菌、哈維弧菌和鰻弧菌3種海水養殖病原菌為指示菌對放線菌進行抑菌活性的篩選，并基于16S rDNA序列對篩選出的抑菌活性較強的海綿放線菌進行多樣性分析。結果表明：從海綿中共分離出57株海綿放線菌，以寡營養的M2培養基分離效果最好。抑菌活性篩選有55株對3株指示菌中的至少1株具有抑菌活性；有11株抑菌活性較強，對3株指示菌均具有抑菌活性，初步鑒定均屬于鏈霉菌屬。由此表明，海綿放線菌多能夠產生對海水養殖病原菌較強的抑菌活性，是天然活性物質的重要來源，在海水養殖應用方面具有較大的開發價值。

關鍵詞 海綿放線菌；抑制弧菌；抑菌活性；多樣性分析

中圖分類號 Q939.13 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）07-0229-03

Isolation of Sponge-associated Actinobacteria and Its Antibacterial Activity Screening

DU Ying-xia 1 REN Hao-jie 1 ZHANG Ju-lin 2 FU Wan-tao 2，3 *

（1 College of Fisheries and Life Science，Dalian Ocean University，Dalian Liaoning 116023； 2 College of Marine Science-Technology and Environment，Dalian Ocean University； 3 Key Laboratory of Nearshore Marine Environmental Science and Technology of Liaoning Province′s University）

Abstract This text isolated actinomycetes from 2 kinds of sponge taken from Dalian ocean intertidal zone with 5 kinds of separation medium.The antibacterial activity of sponge-associated actinobacteria was screened with Vibrio parahaemolyticus，Vibrio harveyi and Vibrio anguillarum as indicator bacteria.The diversity analysis of sponge-associated actinobacteria with strong antibacterial activity was conducted based on 16S rDNA sequence.The study showed that 57 strains in total were isolated from the sponges，and the separation effect of oligo-culture M2 was the best.The result of antibacterial activity screening found that 55 strains had antibacterial effect on at least one of the 3 indicator bacteria.There were 11 strains preliminarily identified as Streptomyces sp. having stronger antibacterial effect on all the 3 indicator bacteria.The results showed that most of the sponge-associated actinobacteria which was an important source of bioactive natural products had quite strong inhibition on mariculture pathogen.It has a great development value in the field of mariculture.

Key words sponge-associated actinobacteria；inhibition of vibrio；antibacterial activity；diversity analysis

隨著陸源微生物資源的開發難度越來越大，海洋豐富的微生物資源愈發受到人們的廣泛重視。海洋放線菌因為生存環境的特殊性，能夠產生結構新穎、抑菌活性顯著的次級代謝產物[1]。海綿是海洋放線菌最重要的一種共附生生物，其體內的微生物可高達海綿生物量的50%～60%[2-3]，因而是目前尋找新型天然活性化合物的重要途徑之一。近年來，已有不少學者從海綿中分離獲得具有強抑菌活性的放線菌菌株，在產生抗細菌、真菌等活性物質上具有較大的潛能[4-7]。

我國作為水產養殖大國，隨著海水養殖行業的繁榮發展，由弧菌引起的水產病害仍是人們治療防范的重點。本研究從海綿中分離篩選出3種常見的海水弧菌，即副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、哈維弧菌（Vibrio harveyi）、鰻弧菌（Vibrio anguillarum），三者均屬于具有抑制作用的放線菌。本文通過16S rDNA序列對具有較強抑菌活性的海綿放線菌進行分子鑒定，旨在發現具有海水養殖應用價值的海洋放線菌。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 海綿樣品。繁茂膜海綿（Hymeniacidon perlevis）、軟海綿屬海綿（Halichondria sp.）均采自大連黑石礁海域潮間帶，30 min內迅速帶回實驗室。

1.1.2 分離培養基。①M2培養基：甘油6 mL，精氨酸1 g，K2HPO4·3H2O 1 g，NaCl 20 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 L，pH值自然。②M2′培養基：甘油0.6 mL，精氨酸 0.1 g，K2HPO4·3H2O 1 g，NaCl 20 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 L，pH值自然。③M8′培養基：酪蛋白胨0.02 g，天冬氨酸0.01 g，丙酸銨4 g，K2HPO4·3H2O 0.05 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 L，pH值7.0。④RH培養基：棉籽糖1 g，組氨酸0.25 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，NaCl 20 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 L，pH值7.0。⑤GT培養基：甘露糖1 g，胱氨酸0.25 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，NaCl 20 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，CaCO3 0.05 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 L，pH值7.0。

1.1.3 指示菌。副溶血弧菌、哈維弧菌和鰻弧菌均來自大連海洋大學農業部北方海水增養殖重點實驗室。

1.2 試驗方法

1.2.1 海綿放線菌的分離。用無菌海水浸洗海綿5遍，除去表面附著的雜質物，再用無菌研缽研磨成漿，加入無菌海水稀釋10倍[8]后，取100 μL研磨液在不同的分離培養基上進行平板涂布，于28 ℃培養箱中倒置培養。培養基中均分別加入15 mg/L萘啶酮酸和50 mg/L重鉻酸鉀[9]抑制細菌和真菌的生長。

1.2.2 具有抑菌活性的海綿放線菌篩選。將分離純化的放線菌在改良高氏一號培養基[8]上28 ℃培養8～10 d至成熟，采用瓊脂塊法[10]進行抑菌活性篩選。用無菌打孔器（直徑10 mm）在長滿放線菌的平板上打孔，將瓊脂塊菌面向下分別置于涂布3種指示菌的營養瓊脂培養基平板上，30 ℃培養24 h，觀察抑菌結果。

1.2.3 具有抑菌活性的海綿放線菌的多樣性。以抑菌圈直徑（ID）大小為判斷海綿放線菌抑菌活性強弱的指標，對篩選出的抑菌活性較強（ID≥15 mm）的海綿放線菌進行分子鑒定。將海綿放線菌單菌落接入裝有5 mL滅菌 ISP2液體培養基的15 mL試管中，于30 ℃恒溫振蕩培養2～3 d。收集1 mL培養液，按照TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 試劑盒說明提取放線菌基因組DNA。以提取的基因組DNA為模板，參照信艷娟等[9]的引物F8/R1492的PCR反應條件擴增16S rDNA片段。擴增產物送至上海生工進行測序，測序結果在NCBI 的GenBank 進行Blast 比對，利用MEGA 5.0軟件中的Neighbor-Joining法構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 海綿放線菌的分離

利用5種分離培養基從海綿中共分離出57株放線菌，并且選用不同培養基對海綿放線菌的分離效果差別很大[10] 。

由圖1可以看出，分離效果較好的培養基有M2、RH和GT，其中M2培養基中共分離得到22株放線菌，分離效果最好。有研究發現，在培養基中加入低比例的營養成分能分離出更多的海洋特有放線菌[11]。M2培養基中除甘油和精氨酸外，僅提供了簡單的K、P和Mg等無機鹽，適合海綿放線菌的分離，這與很多研究發現甘油-精氨酸培養基的分離效果較好相符[12-14]；RH和GT培養基除提供了唯一的碳源和氮源外，其中加入的一些無機離子成分作為無機營養鹽，都是成分簡單的寡營養培養基，滿足了海綿放線菌的特殊需求。

2.2 具有抑菌活性的海綿放線菌篩選

以抑菌圈直徑大小為海綿放線菌抑菌活性強弱的判斷指標，其結果見表1。可以看出，從中篩選出11株活性較強（對3株指示菌均具有抑菌效果，且至少對1株指示菌的抑菌圈直徑ID≥15 mm）的海綿放線菌。分離出的57株海綿放線菌中有55株對3株指示菌中的至少1株有抑菌活性，表明海洋放線菌廣泛的抑菌活性具有無限的開發潛能，值得人們關注研究。

2.3 具有抑菌活性的海綿放線菌的多樣性

對篩選出的11株抑菌活性較強的海綿放線菌進行16S rDNA序列分析，利用MEGA 5.0軟件對這些序列進行分析，采用鄰接法，重復取樣1 000次，構建的系統進化樹如圖2所示。可以看出，篩選出的這11株海綿放線菌均屬于鏈霉菌屬的不同種，對3種指示菌均具有抑菌活性，展現出海綿放線菌的多樣性。

3 討論

海綿是一種簡單而古老的多細胞動物，能產生比其他海洋生物物種更為豐富的生物活性物質，是海洋天然產物的重要來源。其體內大量的微生物資源得到分離并成功培養的占整個海綿微生物群落的不足0.1%[15]。對于海綿放線菌的分離培養，仍需要更積極地探索。其中，選擇性分離培養基的成分對于海洋放線菌的分離具有重要影響。研究發現，營養簡單的培養基更適合放線菌的分離[8]。常顯波等[16]用9種分離培養基對青島海區潮間帶的沉積物進行放線菌分離，培養基M1、M6分離得到的放線菌數目較多，主要碳源為可溶性淀粉和棉籽糖，是放線菌的偏好營養成分[17]。M8含有放線菌喜好的精氨酸和甘油成分[18-20]，分離到的數量也較多，與本文中M2培養基分離效果最好一致，低營養的RH和GT培養基同樣分離效果較好。

采用瓊脂塊法篩選海綿放線菌抑菌活性，海綿放線菌展現出較好的抑菌活性，在分離出的57株放線菌中有55株對3株指示菌中的至少1株有抑菌活性，僅有2株未表現出抑菌活性，說明海綿放線菌在開發抑菌活性物質上有廣闊的前景。由于本文中指示菌的廣譜性不高，或者受分離方法的限制，對于未表現出抑菌活性的海綿放線菌并不能判定無活性，需要針對不同的指示菌或者采用不同的篩選方法進一步的篩選驗證。

本研究中，從57株海綿放線菌中篩選出11株抑菌活性較強的海綿放線菌，對3株海水養殖病原指示菌均有抑制作用，且對至少1株指示菌產生的抑菌圈直徑>15 mm，值得進一步進行抑制海水養殖弧菌的生物活性等方面的研究。李 俠等[21]從山東日照海域潮間帶分離篩選出4株對半滑舌鰨鰻弧菌（Vibrio anguillarum）和副溶血弧菌（Vibrio paraha-emolyticus）同時具有較強拮抗作用的海洋放線菌，基本滿足海水養殖弧菌病防治要求。海洋放線菌對海水養殖病原菌具有較強的抑制作用，在海水養殖病害防治方面具有潛在的應用價值。

放線菌以產生豐富的次級活性代謝產物而著稱，特別是鏈霉菌屬作為已知放線菌中最大的族群，是產生抗生素最多的種屬[22]，受到人們的高度重視。本文對篩選出的11株抑菌活性較強的海綿放線菌進行了16S rDNA序列分析，初步鑒定均屬于鏈霉菌屬，進一步說明海洋鏈霉菌是獲得活性代謝產物的重要資源。

4 參考文獻

[1] BERNAN V S，GREENSTEIN M，CARTER G T.Mining marine micro-organisms as a source of new antimicrobials and antifungals[J].Curr Med Chem-Anti-Infective Agents，2004，3（3）：181-195.

[2] BERGMANN W，BURKE D C.Contributions to the study of marine pro-ducts.XXXIX.The nucleosides of sponges.III.Spongothymidine and spon-gouridine[J].J Org Chem，1995，20（11）：1501-1507.

[3] WANG G.Diversity and biotechnological potential of the sponge-asso-ciated microbial consortia[J].Ind Microbiol Biotechnol，2006，33：545-551.

[4] 歐陽永長，梁梓添，姚雅琪，等.兩種南海海綿放線菌的分離和培養研究[J].湖北農業科學，2014，53（13）：3002-3005.

[5] 蘇培，王德祥，柯才煥，等.海綿共附生放線菌HNS054菌株的鑒定及發酵液抑菌活性研究[J].廈門大學學報（自然科學版），2012，51（6）：1085-1091.

[6] 崔美子，朱平.豐肉結海綿相關放線菌LS-298代謝產物研究[C]//中國菌物學會第五屆會員代表大會暨2011年學術年會論文摘要集.廣州：中國菌物學會，2011.

[7] 陳敏捷.海綿共附生鏈霉菌抗真菌活性篩選及多烯類抗生素生物合成基因結構初析[D].廣州：中國科學院南海海洋研究所，2009.

[8] 張海濤.海綿放線菌的分離和多樣性研究[D].大連：中國科學院大連化學物理研究所，2006.

[9] 信艷娟，艾江寧，劉亞男，等.一株海洋放線菌的分離鑒定及活性研究[J].生物技術進展，2012，2（5）：354-358.

[10] 高鵬，薛泉宏，常顯波，等.拮抗放線菌的篩選培養基與篩選方法研究[J].西北農林科技大學學報（自然科學版），2005，33（1）：59-63.

[11] JENSEN P R，GONTANG E，MAFANS C，et al.Culturable marine acti-nomycete diversity from tropical Pacific Ocean sediments[J].Environ Microbiol，2005，7：1039-1048.

[12] SUN W，DAI S K，JIANG S M，et al.Culture-dependent and culture-independent diversity of actinobacteria as-sociated with the marine sponge Hymeniacidon perleve from the South China Sea[J].Antonie van Leeuwen-hoek，2010，98：65-75.

[13] 王宏梅，趙心清.可培養海洋放線菌生物多樣性的研究進展[J].微生物學通報，2007，34（5）：996-1000.

[14] ZHANG H，LEE Y K，ZHANG W，et al.Culturable actinobacteria from the marine sponge Hymeniacidon perleve：isolation and phylogenetic diversity by 16S rRNA gene-RFLP analysis[J].Antonie Van Leeuwen-hoek，2006，90（2）：159-169.

[15] WEBSTER N S，WILSON K J，BLACKALL L L，et al.Phylogenetic div-ersity of bacteria associated with the marine sponge Rhopaloeides od-orabile[J].Appl Environ Microbiol，2001，67：434-444.

[16] 常顯波，劉文正，尹琦，等.海洋放線菌不同分離方法的比較研究[J].海洋科學，2012，36（8）：35-39.

[17] 楊宇容，徐麗華，李啟任，等.放線菌分離方法的研究[J].微生物學通報，1995，22（2）：88-91.

[18] TAKAHASHI Y，OMURA S.Isolation of new actinomycete strains for the screening of new bioactive compounds[J].J Gen Appl Microbiol，2003， 49：141-154.

[19] SUN W，DAI S K，JIANG S M，et al.Culture-dependent and culture-independent diversity of actinobacteria as-sociated with the marine sponge Hymeniacidon perleve from the South China Sea[J].Antonie van Leeuwen-hoek，2010，98：65-75.

[20] ZHANG H，LEE Y K，ZHANG W，et al.Culturable actinobacteria from the marine sponge Hymeniacidon perleve：isolation and phylogenetic diversity by 16S rRNA gene-RFLP analysis[J].Antonie Van Leeuwen-hoek，2006，90（2）：159-169.

[21] 李俠，程璐.4株海洋放線菌對半滑舌鰨病原弧菌的拮抗作用[J].江蘇農業科學，2011（1）：268-270.

[22] 曾文兵，王錦，段學輝.從鏈霉菌中發現新抗生素的趨勢分析[J].江西科學，2004，22（4）：293-296.